Introduction
Den mogna ventilen är sammansatt av tre stratifierade skikt av specialiserad extracellulär matrix (ECM) varvat med ventil interstitiella celler (VICS) och inkapslad av ett enda skikt av hjärtklaffs endotelceller (VEC) 1. Roll ECM är att ge alla nödvändiga biomekaniska egenskaper för att klara ständiga förändringar i hemodynamiska kraft under hjärtcykeln. Omsättningen av ventil ECM i den vuxna ventilen är hårt reglerad av Vics som till stor del vilande och fibroblastliknande i frånvaro av sjukdom. Förutom den VIC befolkning, hjärtklaffs endotelceller (VEC) bildar en oavbruten endotel över ytan av ventil kuspar 2. Även betydelsen av ECM och Vics för ventil struktur och funktion har beskrivits av oss och andra, är den roll som VEC mindre känt. Dock är kritiskt för ventilbildning i embryot detta jämförelsevis liten cellpopulation och beskrivs som dysfunktionell i ventilensjukdom.
Hjärta ventilbildning i embryot börjar när en delmängd av endotelceller inom atrioventrikulär kanalen och utflöde regionerna genomgår endotelceller till mesenkymala transformation (EMT) och bilda svullnader som kallas endokardiska kuddar 1,3. De nyligen trans mesenkymala celler inom dessa strukturer senare differentiera till Vics och bildar de mogna ventilerna. När EMT är fullständig, endotelceller som omger kuddarna, benämnd VEC, bildar en oavbruten endotelcellskikt som skyddar det mogna ventilen mot skada. Dessutom VEC avkänna hemodynamiska omgivningen och har visats molekylärt kommunicera med underliggande VICS att reglera ECM homeostas 1,3. I sjuka ventiler är VEC monoskiktet störs i samband med onormala förändringar i ECM organisation och ändrade biomekanik 4,5. Dessutom studier i musmodeller antyder att VEC dysfunktion är den bakomliggande orsaken till ventil disease 1,6-9. Som VEC spelar en viktig roll i ventil utveckling, underhåll och sjukdom, är det viktigt att vi till fullo definiera sina timliga fenotyper för att föra fältet och förstå mekanismerna bakom sjukdomen.
Tidigare arbete av flera labs har framgångsrikt isolerade VEC från svin och får modellerna 10-12. På grund av den stora storleken på dessa ventiler, isoleringar genom bomullstopp och / eller enzymatisk nedbrytning, följt av ett antal olika isoleringsmetoder inklusive magnetisk pärla cellseparation och enda cell klonal expansion har varit effektiv för att generera rena populationer 11-13. Dock kan dessa modeller vara restriktiv på grund av den ofullständiga anteckningen av gris och får genomen som begränsar tillgängligheten av molekylära verktyg utöver de höga kostnaderna. Därför experiment av svin och får VEC efter isolering kan vara begränsande. Musmodeller är att föredra på grund av de många möjligheterna till genetisk manipulation och molekylära verktyg i embryot och vuxna, men hittills inga VEC isoleringar i små djurmodeller har rapporterats. Detta beror sannolikt på att det är svårt att arbeta med små vävnadsprover som inkluderar en minoritet cellpopulation som för närvarande saknar unika identitet VEC-specifika markörer och därmed förhindra antikroppsbaserade isoleringsmetoder.
I denna artikel redovisar vi en ny metod för direkt isolering av murina VEC på embryonala och vuxna stadier. Detta protokoll tar fördel av Tie2-GFP-möss, som uttrycker GFP i alla endoteliala celltyper och har i stor utsträckning använts för att studera endotelial cellpopulationer 14. Emellertid är det nya i denna aktuella studien att dessa möss, som för första gången har använts för att isolera endotelceller från ventilerna. Genom noggrann dissektion av vävnad ventil och en serie av nio enzymatiska spjälkningar följt av FACS-sortering kan VEC isoleras och användas för olika experimentella tekniker isive RNA-extraktion och kultur, direkt efter sortering.
Protocol
1 Beredning av utrustning och lösningar
- Sterilisera dissektion verktyg - fina vävnads sax för att extrahera vuxna hjärtan och 2 fin pincett för dissektion av klaff regionen - genom autoklavering i en täckt instrument fack. Spray verktyg med 70% etanol (EtOH) före dissektion.
- Förbered alla lösningar omedelbart före experimentet och sterilisera lösningar genom att leda dem genom ett sterilt 0,2 pm filter. Håll lösningarna på is tills användning.
- Steril Dissociation Buffer (15 ml totala / prov). Kombinera 1,2 ml kollagenas IV, 300 l 2,5% trypsin och 150 ul chick serum. Bringa volymen upp till 15 ml med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Steril Sortering Buffer (12 ml totalt). Kombinera 25 | il 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 12 | il DNas I (RNas-fri). Bringa volymen upp till 12 ml med HBSS.
- VEC Kultur Media. Mix endotelceller growth medier enligt tillverkarens instruktioner (se material kalkylblad) genom att lägga till den i lika delar komponenter ur satsen till 500 ml EBM2 media.
- GFP Negativ Kultur Media (icke-endotelceller media). Blanda 445 ml av Medium 199 1x med 5 ml penicillin / streptomycin (pen / strep) (1% slutlig koncentration) och 50 ml FBS (10% slutkoncentration).
2 Dissektion av Valvular regionen från vuxna möss och E14.5 embryon
- Alla animaliska förfaranden godkändes och utförs i enlighet med den Nation Barnsjukhus Forskningsinstitut IACUC riktlinjer.
- Tie2-GFP möss köptes från Jackson Laboratories (stock nummer 003.658) 14 och bibehölls som homozygota genotyper på en FVB / N bakgrund, och därmed se till att alla off-våren express GFP i Tie2-positiva endotelceller.
- För FACS sortering, förbereda en åldersmatchade negativ sample som inte innehåller GFP som C57 / BL6 att ställa GFP gate parametrar för FACS sortering. OBS: Detta protokoll och representativa resultat bygger på att använda tre, fyra månader gamla vuxna möss eller en kull på embryonala dag (E) 14.5.
- Vuxna möss: Omedelbart efter offer från CO2 anoxi, använd dissektion sax för att försiktigt öppna brösthålan och exponera hjärtat och lungorna. När utsatta, grepp hjärtat med pincett på de stora artärerna och dra bort från kroppen. Ta lungvävnad vid intakt, och placera hjärtan i kall HBSS att skölja. Ta ventrikeln och dra bort förmaken lämnar atrioventrikulärt kanalen "ring" och aorta regioner intakta. Gör ett snitt längs sidan av atrioventrikulärt kanalen för att öppna upp den "ringen" och exponera klaffstrukturer. Ta hjärtmuskeln och proximala aorta regioner genom att försiktigt retas bort med pincett. Identifiera klaffblad som vitt, tät vävnad över rosa hjärtmuskeln. Försiktigt DETAch den chordae tendinae från atrioventrikulärt ventiler och ta bort så mycket av det kvarvarande myokardium som möjligt. Var försiktig med att inte dra eller skrapa klaffblad under denna process eftersom VEC kan rubbas. Placera trimmade klaff regioner i ett 1,5 ml Eppendorf-rör innehållande 1 ml HBSS och hålla på is. OBS: Noggrann dissektion är avgörande för att eliminera icke-klaff endotelceller som kan förorena provet.
- Embryon: Sacrifice honmöss 14.0 dagar efter parning plugg observeras (morgonen copulation plugg = 0,5 dagar).
- Omedelbart efter offer, dissekera livmodern (som innehåller embryon) och tvätta i kallt HBSS. Dissekera ut enskilda embryon från livmodern och ta bort den embryonala gulesäcken som omger varje embryo. Ta hjärtan från var och en av embryon och följa steg 2.1. (OBS: försiktigt klämma embryot med pincett precis nedanför de övre bihang bör bidra till att exponera hjärtat och göra bort lättare.)
- Använda sterila pipettspetsar, ta bort HBSS från Eppendorf-rör som innehåller klaffregionerna.
- Ersätt med 1 ml dissociation buffert och 4 pl DNas I.
- Rotera rören vid 37 ° C under 7 min.
- Pipettera upp och ner 3 gånger och sedan låta provet nöja sig 15 sek. Samla supernatanten (innehållande de dissocierade celler) i ett 15 ml koniskt rör.
- För att stoppa kollagenas reaktionen, till 125 l av hästserum till uppsamlingsröret. Håll provröret på is.
- Upprepa dissociation steg (3,2-3,5) nio gånger för att samla nio fraktioner av supernatant.
- Passera fraktione samlingen genom en 70 pm nylonfilter i ett nytt provrör för att säkerställa en enda cellsuspension genom att ta bort eventuellt skräp och klumpar.
- Spin suspensionen vid 400 g under 5 min för att pelletera cellerna.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml Sortering buffert ochhålla på is tills FACS.
4. FACS-sortering GFP positiv VEC
- Ställ portarna för framåt och sidospridning för att utesluta skräp och fånga enstaka celler; utesluta dubbletter med hjälp av dubbdiskriminering gating. Spela det negativa kontrollprovet och definiera gate inställningar för att jämföra och exakt definiera GFP-positiva cellpopulation i Tie2-GFP prov.
- Analysera GFP-positiva celler via FACS och förfina gate inställningar.
- Sortera på Tie2-GFP prov och samla både GFP-positiva och GFP-negativa celler. Om celler kommer att användas för RNA-extraktion, sortera direkt in i sorteringsbufferten. Till odlingsceller efter FACS, samla GFP-positiva celler i ett sterilt rör innehållande 1 ml VEC media med 1 ml FBS, och samla GFP-negativa celler i en ml icke-endotel-media med 1 ml FBS. Använd denna 50% media / 50% serum kombination för att förbättra cellernas livskraft. Håll på is tills post FACS-analys.
5. Post FACS analysier
- RNA-extraktion:
- Omedelbart efter FACS, centrifug GFP positiva och negativa celler vid 1500 xg under 8 min.
- Försiktigt pipett supernatanten (sorteringsbuffert) och kassera.
- Resuspendera cellpelleten (pellet är inte synlig för de urvalsstorlekar som rekommenderas här) i 200 l Trizol.
- Frysa vid -80 ° C eller börja standard fenol-kloroform-extraktion för att isolera total-mRNA såsom beskrivits tidigare av vårt labb 15.
- Använd 50-200 ng av RNA för cDNA-syntes med hjälp av Mastermix enligt tillverkarens anvisningar.
- Ämne cDNA kvantitativ PCR-amplifiering med hjälp IDT Primetime qPCR sonder mot mus-endothelial cellmarkörer (CD31, von Willebrands faktor (vWF)), ventil interstitiell cellmarkörer (α-glattmuskelaktin (α-SMA), Periostin (Postn)), myocyt markörer (Mhc6, Mhc7) och GAPDH.
- Odling Murin VEC:
- Efter FACS sortering och cellsamling (steg 4.3), centrifugera celler vid 300 xg under 5 minuter.
- Försiktigt pipettera bort supernatanten (sorteringsbuffert + media) och kassera.
- Resuspendera GFP-positiva cellpelleten i 1 ml VEC medier och GFP-negativa pelleten i 1 ml icke-endotelceller medier.
- Plate varje prov i en brunn i en plastkammare bild och växa tills sammanflytande. Kultur för ca 1 vecka för GFP negativa celler att bli sammanflytande och mer än 2 veckor för GFP-positiva celler att bli sammanflytande (från ett urval av 3, vuxna möss). Ändra media varannan dag.
- Immunofluorescerande Färgning:
- Avlägsna medierna från celler och fixera i 4% paraformaldehyd (PFA) under 30 min vid RT. Tvätta fixerade celler tre gånger i 5 minuter vardera i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Avlägsna kammarbrunnar från sliden och block i 5% bovint serumalbumin / 1x PBS under 1 h vid RT.
- Inkuberadiabilder O / N vid 4 ° C med primära antikroppar (CD31, en: 1000 eller α-glattmuskelaktin (α-SMA), 1: 100). Tvätta 3x under 5 min i PBS.
- Späd sekundär antikropp (Alexa-Fluor 568 get anti-Rat) 1: 400 i PBS, lägg till bilder, och inkubera 1 timme vid RT. Skölj objektglasen 3x under 5 min i PBS.
- Montera i Vectashield-innehållande DAPI och inkubera 1 timme vid 4 ° C före visning.
Representative Results
Tie2-GFP celler samlokalisering med endotel markörer i de embryonala och vuxna hjärtklaffar.
För att bekräfta specificiteten hos Tie2-GFP uttryck i VEC från embryonala och vuxna möss, var immunofluorescens för att bestämma samlokalisering med endotelceller markör CD31 i vävnadssnitt framställda från E14.5 och 3 månader gammal vuxen Tie2-GFP möss med användning av metoder som tidigare publicerats av vårt laboratorium 16. Såsom visas i fig 1, VEC co-express GFP (figur 1 A, B, E, F) och CD31 (fig 1 C, D, E, F) vid både vuxen (figur 1 B, D, F) och embryonala ( Figur 1 A, C, E) stadier, därför validera vår modell för efterföljande VEC isolering.
FACS-analys identifierade distinkta GFP-positiva och GFP-negativa cellpopulationer i embryonala och vuxna hjärtklaffar isolerade från Tie2-GFP möss.
Wild typ C57 / BL6 möss användes för att ställa in GFP parametrar och cirka 2% av enkels gated celler från Tie2-GFP-möss visar en signifikant anrikning i GFP-positiva celler genom FACS-analys i både embryon och vuxna prover (Figur 2). Baserat på co-lokaliseringsstudier som visas i figur 1, är dessa celler anses VEC och ger ett genomsnitt på 61.800 totala celler (prover varierar mellan 39,000-77,000 celler / prov) hos vuxna prover (n = 3) och 8928-celler (8,015- 11.000 celler / kull) från en kull E14.5 embryon.
PCR-analys bekräftar anrikning av endothelial cellmarkörer i GFP-positiva celler och ventil interstitiell cellmarkörer i GFP-negativa celler isolerade från Tie2-GFP möss.
Gene expression analys av GFP positiva och negativa cellpopulationer från qPCR följande FACS visar tydliga molekylära profiler. Jämfört med GFP negativa cellpopulationer isolerade från Tie2-GFP embryon och adults, är GFP-positiva celler anrikade för expression av endotelial cellmarkörer CD31 och vWF, (Figur 3). Vidare är uttrycket av myocyt markörer (Myh6, Myh7) i dessa cellpopulationer mycket låg, vilket visar minimal kontaminering av icke-endotelceller. Däremot är GFP-negativa celler som isolerats från vuxna Tie2-GFP-möss och E14.5 embryon berikad för ventil interstitiell cell (VIC) markörer, α-SMA och Periostin (POSTN) i förhållande till GFP-positiva celler. Anrikning av dessa markörer är högre i GFP negativa celler isolerade från E14.5 prover jämfört med vuxna på grund av den vilande fenotypen av vuxna Vics och därmed lågt uttryck av aktiverade markörer.
GFP-positiva celler isolerade från Tie2-GFP vuxna möss kan odlas in vitro.
Förmågan att kultur GFP positiva och GFP negativa celler isolerade från vuxna prover undersöktes basd på cellmorfologi och immunhistokemisk färgning. Använda protokoll som tidigare beskrivits av oss 17 vi visar i fig 4 att GFP-positiva celler visas runda i morfologi (Figur 4A) och co-express GFP med endotelial cellmarkör CD31 efter två veckor i kultur (figur 4C). Däremot icke-endotelceller är negativa för GFP, visa ett mesenkymala liknande morfologi (Figur 4B) och uttrycka VIC markör α-SMA efter nio dagar (Figur 4D).
Figur 1. Tie2-GFP-positiva celler samlokalisering med CD31 på embryonala och vuxna hjärtklaffar. Immunfluorescens att visa sammanslutning av (Tie2-) GFP uttryck (A, B) med endotelceller markör, CD31 (C, D) i de septal broschyrer av mitralisklaffen vid E14.5 (A, C, E) och vuxna (B, D, F) stadier. Regionen Ventilen är markerad i A, C, E. (E, F) Samsorterade bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tie2-GFP-positiva VEC kan identifieras med FACS. Jämfört med åldersmatchade C57 / BL6 kontroller (A, C), ventiler isolerade från Tie2-GFP embryon (B) och vuxna (D) innehåller en tydlig GFP- positiv cellpopulation, såsom indikeras i grönt. GFP-negativa händelser, som visas i rött uppsamlades som en kontroll. Siffror inom (B) och (D) anger den genomsnittliga% av GFP-positive celler från det totala antalet händelser sorterade efter FACS (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GFP-positiva celler anrikas för endotel markörer medan GFP-negativa celler uttrycker gener associerade med ventil interstitiella celler. Representant qPCR av endotelceller cellmarkörer (CD31, von Willebrands faktor (vWF)) och vuxna (Myh6) och foster ( Myh7) myocyt markörer i GFP-positiva celler isolerade från klaff regioner av E14.5 (A) och vuxna (B) Tie2-GFP-möss. Obs anrikning av endothelial cellmarkörer och mycket låga nivåer av myocyt associerade gener. (C, D) Vik changes i uttryck av ventil interstitiella cellmarkörer α-sma och Postn i isolerade GFP-negativa celler från E14.5 (C) och vuxna (D) Tie2-GFP möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Tie2-GFP-positiva celler upprätthålla uttryck av endotelceller cellmarkörer in vitro. Efter FACS, GFP positiva (A, C) och negativa (B, D) cellpopulationer från vuxna möss odlades fram till sammanflytande och omfattas faskontrastbildframtagning (A, B) och fluorescerande immunfärgning (C, D). GFP-positiva celler uttrycker CD31 (röd) (C) efter10 dagars odling. Däremot var GFP uttryck inte registreras i negativ cellpopulation, som färgas positivt för α-SMA, en markör för aktiverade Vics (D).
Discussion
Här beskriver vi för första gången, ett nytt förfarande för isolering av embryonala och vuxna murina VEC från Tie2-GFP-möss. Även denna mus linje har i stor utsträckning använts för isolering av endotelceller cellpopulationer, detta är den första rapporten som visar selektiv isolering av VEC. På grund av bräcklighet VEC befolkning, har vi utvecklat en stringent protokoll som möjliggör enskild cell isolering av GFP positiva (och GFP negativ) celler från hjärtklaffar av embryonala och vuxna möss. Jämfört med den ursprungliga publikationen med hjälp av hela embryon eller organ från Tie2-GFP möss 14 har vi optimerat kollagenas och dissektion steg baserat på den låga förekomsten av denna sköra endotelceller befolkningen att isolera en utvald population av celler.
VEC isoleringar har tidigare endast rapporterats i stora djurmodeller med begränsade genetiska och biomolekylära verktyg. Dessa verktyg är väl etablerade i möss, och därför abihet att isolera murina VEC möjliggör en utökad uppsättning experimentell design som ska användas för hjärtklaff forskning. Därför är en betydande fördel med detta tillvägagångssätt att VEC kan isoleras tidsmässigt från vildtyp möss och modeller av ventil sjukdomar och skador. En andra fördel är att VEC kan isoleras och analyseras nästan omedelbart efter dissektion, bevara uttrycksmönster som återspeglar situationen in vivo mer exakt. Vidare är denna isolering protokoll tillräcklig för att eliminera cellkultur för antal expansion och därför potentiella fenotypiska förändringar inducerade av den in vitro-miljön förhindras.
Trots nyheterna och experimentella fördelarna med detta protokoll, inser vi att begränsningar fortfarande föreligger. Först storleken VEC populationen inom murina ventiler är mycket liten och därför sänds flera tajmade embryonala kullar som krävs för att generera tillräckligt med RNA för genuttrycksanalys. Medan this kan övervinnas med hjälp av flera uppfödare, kan det påverka tillämpningen av några efter isolering analysverktyg. Denna begränsning har varit en utmaning särskilt för upprättande sammanflytande kulturer av GFP-positiva VEC för att utföra fler grundliga analyser av VEC fenotyper inklusive molekylära profiler och funktionella analyser. Därför erkänner vi att inte alla svårigheter har övervunnits av vår strategi, men detta är ett område av intresse som vi strävar efter att övervinna.
Detta tillvägagångssätt att isolera VEC från klaff regioner införs möjligheten för kontamination från Tie-GFP-positiva, icke-klaff endotelceller endokardiet eller kärlstrukturer inom kammarhjärtmuskulaturen. Hittills har inte identifierat molekylära skillnaden av VEC från andra hjärt endothelial cellpopulationer. Emellertid en enhancer region av Nfatc1 gen har identifierats och visat att specifikt märka VEC som inte gör detgenomgår EMT, och ingen annan endotelceller populationen i hjärtat 18. Som Cre modell (Nfatc1 ENCRE) finns tillgänglig, kan framtida studier utnyttja specificiteten hos denna linje för att minimera kontamineringsrisker. Förutom icke-klaff Tie2-GFP- positiva celler, det finns alltid risken för föroreningar från myocyter vid den punkt där ventilbladen fäster den ringformade området av septal och vägghjärtväggar. I uppgifter som inte visas här, från början började vi studier för att isolera VEC från dissekerade klaff regioner som använder antikropps konjugerade kulor belagda med anti-GFP och anti-CD31. Medan detta tillvägagångssätt var framgångsrikt för isolering av de endotelceller, vi upplevt signifikant cellklumpning från intilliggande, icke-endotel-celltyper och därför VICS och myokardceller förorenat vår experimentella provet. Detta har undvikits genom att använda FACS-analys som parametrar har ställts in för att isolera bara encellssuspensions och PCR-analys för att detektera uttryck av myocyt specifika gener har kontrollerat för denna begränsning (Figur 3). Medan vår förorening kan anses som minimal, är det fortfarande en potentiell experimentell komplexitet som skulle kunna undvikas i framtiden med den dubbla val av GFP och endotel cellspecifika ytmarkörer.
Med hjälp av detta protokoll, har vi framgångsrikt isolerade VEC från embryonala och vuxna möss och som exempel på hur denna metod kan användas för RNA-isolering och cellodling av GFP-positiva och GFP negativ cellpopulationer. Emellertid är detta tillvägagångssätt inte begränsat till dessa tillämpningar och kan användas för en mängd olika molekylära, cellulära och funktionella metoder. Dessutom kan den Tie2-GFP bakgrund paras med genetiska musmodeller som kommer att möjliggöra jämförande studier av VEC populationer i hälsa och sjukdom. Utvecklingen av denna nya metod kommer, för första gången, möjliggöra fokuserade studierundersöka bidrag VEC i ventil utveckling och underhåll och kunde avslöja tidigare skattade mekanismer endotelberoende ventil sjukdom.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytisk Cytometry Core-anläggning, särskilt Katrina Moore, för tekniskt stöd med FACS-analys. Dessutom inser vi Dr William Pu och hans grupp för deras vetenskapliga insikter. Detta arbete stöddes av NIH HL091878 (JL) och The Heart Center vid Nationwide barnsjukhuset.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5 M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning cellgro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11 cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T.
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
