This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.
स्तनधारियों में और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में शुक्राणुजनन के दौरान पुरुष रोगाणु कोशिकाओं आवश्यक विकासात्मक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में विकसित करना. यह एक स्टेम सेल आबादी, mitotic प्रवर्धन, और अर्धसूत्रीविभाजन से भेदभाव शामिल हैं. इसके अलावा, के बाद meiotic रोगाणु कोशिकाओं को एक नाटकीय रूपात्मक देगी प्रक्रिया के साथ ही रोगाणु लाइन क्रोमेटिन-हिस्टोन करने वाली protamine स्विच की एक वैश्विक epigenetic पुनर्विन्यासन गुजरना.
उत्परिवर्तजनन या अन्य आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर के बाद meiotic शुक्राणुजनन में एक प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन अक्सर आवश्यक भ्रूण, पूर्व meiotic, या जांच के तहत प्रोटीन की meiotic कार्यों से बाधित है. इस तरह के एक प्रोटीन की एक उत्परिवर्ती के बाद meiotic फेनोटाइप पहले के एक विकास खंड के माध्यम से छिप जा सकता है, या phenotype की व्याख्या जटिल हो सकता है. मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक इस समस्या को बाईपास प्रदान करता है: बरकरार वृषण औरजल्दी pupae से विच्छेदित जर्म कोशिकाओं का भी अल्सर संस्कृति माध्यम में पूर्व vivo विकसित करने में सक्षम हैं. ऐसी संस्कृतियों बनाने के लिए वृषण में और रोगाणु लाइन अल्सर के रोगाणु जीवित कोशिकाओं के सूक्ष्म इमेजिंग की अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात है, खेती की वृषण और रोगाणु कोशिकाओं को भी इस तरह के बाद meiotic चरणों सहित, शुक्राणुजनन दौरान एंजाइमी कार्यों के हेरफेर की अनुमति, औषधीय inhibitors के लिए सुलभ हो गया है.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल काटना और पोटा संबंधी वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर खेती करने के लिए कैसे करें. पोटा संबंधी वृषण और संस्कृति की स्थिति के विकास पर सूचना संस्कृति में रहते वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर की खुर्दबीन इमेजिंग डेटा के साथ प्रदान की जाती हैं. हम भी हिस्टोन acetyltransferase अवरोध anacardic एसिड का उपयोग हिस्टोन करने वाली protamine स्विच को लक्षित एक परख द्वारा उदाहरण के बाद meiotic शुक्राणुजनन, अध्ययन करने के लिए एक औषधीय परख का वर्णन. सिद्धांत रूप में, इस साधना ओ कई को संबोधित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैपूर्व और बाद meiotic शुक्राणुजनन में वहाँ अनुसंधान सवाल.
कई प्रजातियों के पुरुष रोगाणु कोशिकाओं के विकास के एक क्रमिक प्रक्रिया है. यह आकृति विज्ञान और epigenetically अत्यधिक विशेष शुक्राणु के गठन में खत्म कि महत्वपूर्ण घटनाओं की एक श्रृंखला की विशेषता है. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, वृषण विभाजन की नोक पर रोगाणु लाइन स्टेम कोशिकाओं asymmetrically 1,2 (एक सिंहावलोकन के लिए देखें चित्र 1) एक नई स्टेम सेल और spermatogonium, यानी, भेदभाव के लिए प्रतिबद्ध है कि बेटी सेल को जन्म देने के लिए . spermatogonium अर्धसूत्रीविभाजन की शुरुआत के साथ, प्रभावशाली वृद्धि और ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि का एक चरण spermatocyte चरण कहा जाता है, mitotic डिवीजनों के चार दौर आए और. एक spermatogonium से होने वाले कोशिकाओं को एक दूसरे से जुड़ा हुआ है और दो दैहिक कोशिकाओं एक संरचना एक पुटी के रूप में निर्दिष्ट से लिपटे एक सिंक्रनाइज़ बंडल के रूप में विकसित रहते हैं. अर्धसूत्रीविभाजन के पूरा होने के बाद, पुरुष रोगाणु कोशिकाओं की आकारिकी पूरी तरह से हैपुनर्गठित (रेखाचित्र के चित्र 1 में दिखाया गया है). प्रारंभ में, दौर spermatids hydrodynamic सिर संरचना के लिए फार्म बढ़ाना, और कशाभिका विकसित करता है. 5 – अंत में, शुक्राणु कोशिकाओं वैयक्तिकरण 3 नामक एक जटिल, apoptosis से संबंधित तंत्र के द्वारा एक दूसरे से अलग हो रहे हैं.
9 – ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और स्तनधारी प्रजातियों सहित कई प्रजातियों, में, अगुणित पुरुष रोगाणु लाइन chromatin की एक उल्लेखनीय epigenetic पुनर्व्यवस्था के साथ कर रहे रोगाणु कोशिकाओं के morphological परिवर्तन, (एचपी स्विच) 6 हिस्टोन करने वाली protamine स्विच कहा जाता है. संभवत: लगभग सभी विहित हिस्टोन और कई हिस्टोन संस्करण अणु डीएनए से छीन रहे हैं और परिपक्व शुक्राणु के क्रोमेटिन के लिए विशिष्ट अत्यधिक कॉम्पैक्ट nucleoprotamine संरचना में जिसके परिणामस्वरूप छोटे बुनियादी प्रोटीन, protamines, द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं. हिमाचल प्रदेश के स्विच की सामान्य विशेषताएँ हैं टीपहले तो संक्रमणकालीन प्रोटीन से, और अंत में protamines द्वारा हिस्टोन वेरिएंट द्वारा विहित हिस्टोन की वह प्रतिस्थापन. 12 – यह सब हिस्टोन हटाने 7,10 करने से ठीक पहले इस तरह के हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण के स्तर में वृद्धि के रूप में epigenetic निशान में कई बदलाव, के साथ है.
नहीं तो सब अधिकांश, उपर्युक्त प्रक्रियाओं की परिपक्व, पूरी तरह से उपजाऊ शुक्राणु के विकास के लिए आवश्यक हैं. यह स्तनधारी शुक्राणुजनन शेयरों के रूप में, अकशेरुकी प्रणाली 1,8,9 के साथ समानता का एक काफी मात्रा में ड्रोसोफिला में बल्कि मानव में न केवल सच है. पुरुष रोगाणु सेल विकास का अध्ययन बहुत ड्रोसोफिला मॉडल प्रणाली में मदद की है. मक्खियों आनुवंशिक रूप से अत्यधिक सुलभ हैं. म्यूटेंट की पीढ़ी के साथ ही संलयन जीन या आरएनए हस्तक्षेप निर्माणों व्यक्त मक्खी उपभेदों की स्थापना थोड़ा प्रयास करता है. हालांकि, बाद के meiotic शुक्राणुजनन, म्यूटेंट के उपयोग के अध्ययन में एकडी सरल आनुवंशिक उपकरण एक सीमा तक पहुंच सकता है. ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन में, प्रतिलेखन meiotic डिवीजनों में प्रवेश के साथ लगभग पूरी तरह से समाप्त हो जाता है. 16 – इस प्रकार, बाद meiotic शुक्राणुजनन मुख्य रूप से एक विस्तारित meiotic प्रोफेज़ 13 में संश्लेषित translationally दमित और संग्रहीत mRNAs पर आधारित है. इसलिए, आरएनए हस्तक्षेप या गैर सशर्त म्यूटेंट के उपयोग जैसे उपकरणों विशेष रूप से भी पूर्व meiotic या meiotic रोगाणु सेल विकास में आवश्यक कार्यों को पूरा कि जीन उत्पादों के बाद की meiotic भूमिकाओं के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं.
20 – ऐसे मामलों में शोषण किया जा सकता है कि ड्रोसोफिला का एक फायदा संस्कृति के माध्यम 4,12,17 में पूर्व vivo विकसित करने विच्छेदित बरकरार वृषण और रोगाणु कोशिकाओं के भी अल्सर की क्षमता है. वृषण या रोगाणु लाइन अल्सर का विच्छेदन और खेती जीवित कोशिकाओं में जर्म सेल विकास की न केवल सूक्ष्म अवलोकन की अनुमति देता है, लेकिन एकlso साथ औषधीय assays, का उपयोग जैसे, ऐसे हिस्टोन acetyltransferases (टोपी), हिस्टोन deacetylases (HDACs), टोपोईसोमेरासिज़, या एंटीबॉडी के रूप में एंजाइम परिसरों के अवरोधकों. इस प्रकार, यह बाद की meiotic शुक्राणुजनन दौरान एंजाइमी कार्यों में हेरफेर करने के लिए और की परवाह किए बिना, भ्रूण पूर्व meiotic, या meiotic कार्यों 4,12 के विकास के परिणामों पर नजर रखने के लिए संभव है.
औषधीय assays में, हम पहले से meiotic प्रोफेज़ दौरान एक bromodomain प्रोटीन की एसिटिलीकरण निर्भर स्थानीयकरण के साथ ही टोपी और HDACs 12,21 को लक्षित विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग कर के बाद meiotic शुक्राणुजनन में epigenetic हिमाचल प्रदेश स्विच के लिए हिस्टोन एसिटिलीकरण स्तर की प्रासंगिकता का विश्लेषण किया. इन assays में हिमाचल प्रदेश स्विच लक्ष्य निर्धारण संलयन जीन histone2AvD-आरएफपी और अंतर्जात पैटर्न में protamineB-EGFP 12,22 व्यक्त कि एक मक्खी तनाव का उपयोग करके संभव बनाया, और अवलोकन किया गया था किपोटा संबंधी वृषण में पहली spermatids 24 और 48 घंटा APF 12 के बीच हिमाचल प्रदेश स्विच के माध्यम से गुजरती हैं.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला pupae, संस्कृति की स्थिति, और बरकरार पोटा संबंधी वृषण साथ एक औषधीय परख से वृषण और अल्सर के विच्छेदन का वर्णन है. इस प्रयोजन के लिए, puparium गठन (APF) के बाद लगभग 24 घंटे पर पोटा संबंधी वृषण विच्छेदित कर रहे हैं (आंकड़े 1 और देखते 2). इस समय, वृषण अन्य ऊतकों को कनेक्शन नहीं बनाया है और अवरोध यौगिकों 23,24 से बेहतर पैठ की अनुमति देता है जो केवल एक पतली बाहरी म्यान, से घिरे हैं. वृषण आसानी संस्कृति में लिया जा सकता है कि bean- या नाशपाती के आकार का अंग हैं. ये वृषण सुसंस्कृत, विच्छेदित, और विशिष्ट inhibitors के साथ व्यवहार कर रहे हैं. बाद में, अवरोधकों का प्रभाव immunofluorescence विश्लेषण करती है और संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग निगरानी कर रहे हैं, और परमाणु morphol की तुलना द्वाराअनुपचारित रोगाणु कोशिकाओं की है कि इलाज रोगाणु कोशिकाओं की ogy. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत की स्थिति भी संस्कृति में वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर के विकास के लाइव इमेजिंग अनुमति देते हैं.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक दिया विकास के चरण में है और एक संस्कृति डिश में इन कोशिकाओं और ऊतकों के पूर्व vivo विकास पर ड्रोसोफिला वृषण और एकल रोगाणु लाइन अल्सर टुकड़े करने की क्षमता के आधार पर दोनों दो अलग अलग अनुप्रयोगों का वर्णन है. One आवेदन शुक्राणु विकास के दौरान महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के औषधीय हेरफेर है. महत्वपूर्ण बात है, यह आसानी से मक्खी आनुवंशिकी के आधार पर कार्यात्मक विश्लेषण का उपयोग कर प्राप्त नहीं है कि बाद के meiotic शुक्राणुजनन के लिए उपयोग की अनुमति देता है. अन्य आवेदन में रहने वाले और रोगाणु कोशिकाओं और वृषण के विकास का सूक्ष्म अवलोकन है. विशेष रूप से संस्कृति में ड्रोसोफिला कोशिकाओं और अंगों की क्षमता से इस आवेदन के लाभ जीवित और आरटी पर और सामान्य वातावरण के तहत विकसित करने के लिए. इसलिए, (25 डिग्री सेल्सियस के मानक प्रजनन के तापमान को गर्म करने) एक गर्म मंच से लैस एक औंधा इमेजिंग माइक्रोस्कोप रहते इमेजिंग प्रयोगों में सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है. इसके अलावालाइव इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन व्यक्त अधिक, कई ट्रांसजेनिक मक्खी उपभेदों मौजूद है या आसानी से स्थापित किया जा सकता है.
एक विशिष्ट विकास मंच की पोटा संबंधी वृषण या रोगाणु लाइन अल्सर प्राप्त करने के लिए, यह एक ड्रोसोफिला विकास के समय से परिचित है कि महत्वपूर्ण है. प्रत्येक चरण के लिए सही समय प्रयोगशालाओं, संस्कृति की स्थिति में भिन्नता है, और उपभेदों भरने के लिए और अनुभव से स्थापित किया जाना चाहिए सकता है. ऊपर उल्लिखित के रूप में, इस उदाहरण के लिए, हिमाचल प्रदेश स्विच लक्ष्य है कि, औषधीय assays के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस तरह के प्रयोगों के लिए, यह समय भी एक जनसंख्या के भीतर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि हमेशा वास्तविक अवरोध परीक्षण से पहले एक ProtamineB-EGFP संकेत के साथ spermatids के लिए जाँच करने के लिए सलाह दी जाती है.
संलग्न वसा शरीर के ऊतकों से मुक्त बरकरार अंगों के रूप में जल्दी पोटा संबंधी चरणों से वृषण काटना प्रयोगकर्ता सक्षम होना चाहिए ऊपर प्रोटोकॉल के बाद. ये वृषण और, उससे भी ज्यादा, जीई पृथकआरएम लाइन अल्सर बहुत ही कमजोर हैं. इसलिए, यह हैंडलिंग और संदंश, सुई, और pipettes का उपयोग वृषण और अल्सर के हस्तांतरण के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता और अनुभव को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. खासकर meiotic और जल्दी के बाद meiotic रोगाणु सेल विकास को लक्षित पढ़ाई इस से लाभ होगा. यह वयस्क वृषण से लंबे flagella साथ देर spermatids के अल्सर टुकड़े करना अपेक्षाकृत आसान है, यह पहले चरण को प्राप्त करना कठिन है. इस प्रोटोकॉल के बाद जल्दी पोटा संबंधी वृषण से इन अल्सर विदारक बहुत ही कुशल है. एक सामान्य मक्खी तनाव में, pupae के केवल सीए 50% पुरुष हो जाएगा कि ध्यान में रखें. इसलिए, आवश्यक वृषण की संख्या के रूप में कई pupae के रूप में कम से कम दो बार काटना तैयार करते हैं. वैकल्पिक रूप से, यह वृषण बरकरार लार्वा 23,34 के पार्श्व वसा शरीर के ऊतकों में एम्बेडेड के रूप में पारदर्शी दौर अंगों पहचाना जा सकता है के रूप में, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग पुरुष L3 लार्वा की पहचान करने के लिए, और ताजा संस्कृति शीशियों में उन्हें इकट्ठा करने के लिए संभव है कि कर सकते हैंमचान और विच्छेदन के लिए पूर्व pupae लेने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. यह पुरुष पूर्व pupae 35 की पहचान करने के लिए भी संभव है.
भी पहले 18 बताया गया है, जैसा कि हम अलग रोगाणु लाइन अल्सर और संस्कृति में बरकरार पोटा संबंधी वृषण दोनों प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं कि देखा. यह प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता भी औषधीय assays में इस्तेमाल कुछ रासायनिक यौगिकों के लिए पकड़ सकता है. इसलिए, यह ऊष्मायन के दौरान अंधेरे में एक परख की संस्कृति बर्तन रखने के लिए सबसे अच्छा है. विकासशील वृषण और, साथ समय चूक इमेजिंग प्रयोगों की योजना बनाते समय इसी तरह, विशेष रूप से, अलग अल्सर, बहुत लंबी जोखिम बार और / या बहुत उच्च नमूना दर पूर्व vivo विकास को बाधित कर सकते हैं कि मन में रखो. उचित दर नमूना प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए.
संस्कृति बर्तन में बैक्टीरियल और / या फंगल संक्रमण और अधिक विकास के लिए एक गंभीर समस्या बन गया है. भी कई बैक्टीरिया से संक्रमित संस्कृति व्यंजन पूर्व vivo विकास के उद्देश्यों का समर्थन नहीं करतेवृषण और अल्सर की lopment. इसलिए, वर्णित संस्कृति के माध्यम पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1.1 कदम देखें), लेकिन लंबी अवधि के ऊष्मायन के दौरान होता है, इन एंटीबायोटिक दवाओं अपमानित किया जा सकता है और उनकी गतिविधि कम हो सकता है. यह अस्तित्व के सीमित समय के लिए कारणों में से एक (अधिकतम. 72 घंटे) ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय मनाया सुसंस्कृत अल्सर का हो सकता है. फिर भी इस समय सीमा के बर्तन में संस्कृति के माध्यम से नियमित रूप से प्रतिस्थापन द्वारा नहीं बढ़ाया जा सकता है. हम अन्य कारकों जैसे जननांग पथ के अन्य ऊतकों से विकास संकेतों की कमी के रूप में, संस्कृति में अस्तित्व प्रभावित हो सकता है कि निष्कर्ष है. दूसरी ओर, बाद के meiotic विकास तेज ड्रोसोफिला में स्तनधारियों में से है. ड्रोसोफिला में, spermiogenesis लगभग 90 घंटे लगते हैं, और हिमाचल प्रदेश स्विच अर्धसूत्रीविभाजन 9,12 के बाद 50 और 60 घंटे के बीच होता है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त लगभग 48 घंटे के सामान्य अस्तित्व के समय विशेष में निर्णायक विकासात्मक प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है,ऐसे meiotic डिवीजनों या हिमाचल प्रदेश स्विच के रूप में rmatogenesis,. बैक्टीरियल या फंगल संदूषण स्वच्छ उपकरण और मीडिया के प्रयोग से बचा जा सकता है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल मक्खियों क्योंकि सख्ती से बाँझ काम की स्थिति का उपयोग करना और मानक परिस्थितियों में उठाया जब वृषण पहले से ही बैक्टीरिया होते उड़ नहीं करता है. फिर भी, इस संस्कृति तकनीक के कुछ अनुप्रयोगों विच्छेदित मक्खियों से लाभ हो सकता है या यहां तक कि (प्रोटोकॉल के लिए, 17,36,37 देखें) सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत उठाया.
भेषज assays inhibitors या विभिन्न एंजाइमों की activators के रूप में अभिनय रासायनिक यौगिकों के उपयोग पर निर्भर करते हैं. आमतौर पर इस तरह के प्रयोगों में इस्तेमाल यौगिकों अक्सर अपने लक्ष्य विशिष्टता में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं. एक लाभ के रूप में, इस anacardic एसिड बाधा P300 / CBP, PCAF, और टोपी 38 के Myst परिवार के सदस्यों के साथ, उदाहरण के लिए, पूरे एंजाइम वर्गों को लक्षित करने की क्षमता प्रदान करता है. इस के नकारात्मक पक्ष बंद लक्ष्य या साइटोटॉक्सिक प्रभाव induc संभावित हो सकता हैऐसे यौगिकों से एड. इसलिए, पोटा संबंधी वृषण या अल्सर के साथ एक परख में इस्तेमाल प्रत्येक यौगिक अपने cytotoxicity और विभिन्न सांद्रता में विशिष्ट प्रभाव के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. इसके अलावा, संस्कृति की स्थिति, यौगिक एकाग्रता या गतिविधि, और सेल पारगम्यता में बदलाव में मामूली बदलाव प्रेरित प्रभाव की परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, यह एक प्रयोग में इलाज की सफलता पर नजर रखने के लिए आवश्यक है. हम 150 माइक्रोन पर anacardic एसिड का इस्तेमाल किया जब हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण लगातार कमी आई थी, जबकि उदाहरण के लिए, हम, बीच और कभी कभी कुछ वृषण भीतर chromatin संक्षेपण phenotype की ताकत में मामूली परिवर्तनशीलता मनाया.
संस्कृति में ड्रोसोफिला वृषण साथ भेषज assays शुक्राणुजनन 4,12,14,21 के पूर्व और बाद meiotic तंत्र का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह आनुवंशिक उपकरणों के साथ के बाद meiotic शुक्राणुजनन का उपयोग करने के लिए मुश्किल है के बाद से आवश्यक तत्व के साथ खिलाड़ियों को लक्षित करने के लिएएल पूर्व meiotic और meiotic काम करता है, इस पूर्व vivo दृष्टिकोण एक विकल्प का गठन किया. इसके अलावा, सिद्धांत रूप में, विधि समय के साथ इलाज रोगाणु कोशिकाओं के विकास का पालन करने के लिए प्रयोगों का पीछा नाड़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, हम अभी तक इस संभावना का परीक्षण नहीं किया. जल्दी पोटा संबंधी वृषण बनाने के लिए औषधीय assays में एक फायदा है. सबसे पहले, (24 घंटा APF के आसपास) युवा पोटा संबंधी वृषण की पतली बाहरी म्यान रासायनिक यौगिकों के बेहतर पारगम्यता अनुमति दे सकता है. बाद के meiotic हिमाचल प्रदेश स्विच का अध्ययन दूसरा, जब पोटा संबंधी वृषण हिमाचल प्रदेश स्विच प्रभावित था या नहीं का प्रत्यक्ष readout सक्षम protamine-GFP- व्यक्त मक्खी लाइन से 24 घंटा APF में विच्छेदित.
तिथि करने के लिए, ड्रोसोफिला अंगों और वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर सहित ऊतकों के पूर्व vivo खेती के लिए कई प्रोटोकॉल (जैसे, 4,14,17,20,39,40 देखें) विकसित किया गया है. खेती मध्यम और प्रयोग सामान्य अनुदेश1979 में स्थापित किए गए थे यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में 17. संस्कृति प्रणाली बाद में वयस्क वृषण 4 से अलग देर के बाद meiotic अल्सर में वैयक्तिकरण तंत्र के vivo इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया था. इससे पहले, हम इन शर्तों को भी चारों ओर 48 घंटा 12 के लिए उनके अल्सर में अस्तित्व और meiotic और जल्दी के बाद meiotic रोगाणु कोशिकाओं के भेदभाव का समर्थन करने वाले की सूचना है. अन्य संस्कृति प्रणाली 19 के विपरीत इन संस्कृतियों में मनाया विकास समय (विवरण के लिए, 12 देखें) तय नमूनों से निर्धारित समय से लगभग अनुरूप था. H2AvD-आरएफपी और protamine-GFP प्रतिदीप्ति संकेत संस्कृति में रोगाणु कोशिकाओं के परमाणु आकारिकी और chromatin संरचना कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम संस्कृति में विकास के चरणों की स्पष्ट पहचान के लिए, इस तरह के अल्सर के coiling के रूप में अन्य मापदंड, अधिक लाभप्रद है कि पाया. महत्वपूर्ण बात है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल मक्खी ext के अलावा शामिल नहीं करताभ्रूण गोजातीय सीरम के अलावा अन्य ract या अन्य विकास कारकों. इसके अलावा, हम स्थितियों पूर्व vivo संस्कृति में meiotic डिवीजनों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं कि यहाँ दिखा. छवियाँ लंबी अवधि के विकास का समर्थन करता है कि एक आसान करने के लिए उपयोग के माध्यम में उचित संकल्प के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इस Voltalef तेल 41,42 में अल्पकालिक (सीए 3 घंटा) टिप्पणियों को सक्षम करने के प्रोटोकॉल के विपरीत है.
खेती और पोटा संबंधी वृषण और एक पुरुष रोगाणु लाइन अल्सर के औषधीय उपचार के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन में शोध किया जा सकता है कि कई आनुवंशिक, epigenetic, जैविक सेल, या विकास संबंधी सवालों को आसानी से निभा रहे हैं. यह रोगाणु लाइन स्टेम सेल पर ध्यान केंद्रित विशेष रूप से अनुसंधान में शामिल हैं. यह सुसंस्कृत वयस्क के लाइव इमेजिंग द्वारा पीछा किया जा सकता है कि स्टेम सेल के विकास 20,43 वृषण दिखाया गया है. हालांकि, परिपक्व वृषण की क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलन म्यानज छवि अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप. इसलिए, या तो इमेजिंग खंडित वृषण 43 या प्रदर्शन इमेजिंग प्रयोगों की संख्या खो डेटासेट 20 के लिए खाते में वृद्धि की जानी है का उपयोग किया जाता है. प्रारंभिक पोटा संबंधी वृषण (24 घंटा APF) अभी तक मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ संलग्न नहीं कर रहे हैं. यहां तक कि थोड़ा पुराने वृषण (36-45 घंटा APF) कुछ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलनों दिखाने (चित्रा 3 और पूरक वीडियो 1 तुलना) दिखाई देते हैं. इसलिए, अक्षत अंगों के रूप में युवा पोटा संबंधी वृषण की खेती एक विकल्प के रूप में सेवा कर सके.
इसके अलावा, एक बार, पोटा संबंधी वृषण टुकड़े करने की क्षमता में महारत हासिल है और अंत में पृथक रोगाणु लाइन अल्सर छोटे, सेल आबादी यद्यपि एक सजातीय के एक स्रोत के रूप में एक अल्सर का उपयोग आगे आवेदनों की अनुमति देगा. पहले से ही प्रदर्शन किया गया है के रूप में उदाहरण के लिए, यह, शुक्राणुजनन की परिभाषित चरणों के दौरान विशिष्ट जीन की ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का विश्लेषण करने के लिए RT-qPCR प्रदर्शन करने के लिए इस प्रकार संभव है <sup> 15.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.
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