Abstract
Memelilerde ve Drosophila melanogaster spermatogenez sırasında, erkek germ hücreleri temel gelişim süreçleri bir dizi geliştirmek. Bu kök hücre popülasyonu, mitoz büyütmesi ve mayoz farklılaşmasını içerir. Ek olarak, öz değişmesine ait sonrası germ hücreleri, dramatik bir morfolojik yeniden şekillendirme işlemi gibi mikrop hattı kromatin-histon-protamin ile anahtarın küresel epigenetik tekrar konfigüre tabi tutulur.
Mutagenezi veya başka genetik araçlar kullanılarak sonrası öz değişmesine ait spermatogenez bir proteinin rolünün incelenmesi, genellikle temel embriyonik ön mayoz veya araştırma altındaki protein öz değişmesine ait işlevleri tarafından engellenmektedir. Bu tür bir protein, bir mutantının sonrası öz değişmesine ait fenotip önceki bir gelişim bloğu bulanıklaşmasının edilebilir veya fenotipin yorumlanması karmaşık olabilir. Model organizma Drosophila melanogaster bir bu soruna bypass sunar: sağlam testisler veErken pupa disseke germ hücrelerinin bile kistleri kültür ortamında ex vivo geliştirmek edebiliyoruz. Bu tür kültürlerin Yapımı kullanımı testislerde ve germ-line kistler germ hücrelerine yaşayan mikroskobik görüntüleme sağlar. Önemli olarak, ekili testis hücreleri ve tohum hücreleri de bu şekilde sonrası miyoza ait aşamaları dahil olmak üzere, spermatojenez sırasında enzimatik işlevleri manipülasyonuna izin veren farmakolojik önleyicileri tarafından ulaşılabilir olur.
Sunulan protokol incelemek ve pupa testisler ve germ-line kistler yetiştirmek için nasıl açıklar. Pupa testis ve kültür şartlarının geliştirilmesi ile ilgili bilgiler kültürün canlı testisler ve germ-line kist mikroskop görüntüleme verilerinin yanında verilmektedir. Biz de histon asetiltransferaz inhibitörü anakardik asit kullanılarak histon-to-protamin anahtarı hedefleyen bir deneyle örneklenen post-mayoz spermatogenez, çalışmak için farmakolojik tahlil açıklar. Prensip olarak, bu uygulama metodu birçok o ele adapte olabiliröncesi ve sonrası mayoz spermatogenezde ther araştırma soruları.
Introduction
Birçok türün erkek germ hücrelerinin gelişimi sıralı süreçtir. Bu morfolojik ve epigenetik oldukça uzmanlaşmış sperm oluşumu ile sonuçlanacak çok önemli bir dizi olay ile karakterize edilir. Drosophila melanogaster, testis böl ucunda germ-line kök hücreler asimetrik 1,2 (genel bir bakış için bkz Şekil 1), yeni bir kök hücre ve spermatogonyum, yani farklılaşma kararlıdır yavru hücre meydana getirmek için . Spermatogonyum mayoz başlangıcı ile, şaşırtıcı gelişmeler ve transkripsiyon aktivite fazı spermatosit aşaması olarak adlandırılan, mitotik bölünmeleri dört tur geçirilir ve. Bir spermatogonyum kaynaklanan hücreler birbirine bağlı iki somatik hücre-bir yapı, kist olarak adlandırılır tarafından sarılı bir paket olarak eşzamanlı geliştirmek kalır. Mayoz tamamlanmasından sonra, erkek üreme hücrelerinin morfolojisi tamamenyeniden (şematik olarak, Şekil 1 'de gösterilmektedir). Başlangıçta, yuvarlak spermatidler hidrodinamik kafası yapısının oluşturulması için uzunlamasına ve kamçı geliştirir. 5 - Sonunda, sperm hücrelerinin bireyselleştirilmesi 3 olarak adlandırılan karmaşık bir apoptoz ile ilgili bir mekanizma ile birbirinden ayrılır.
9 - Drosophila melanogaster ve memeli türler de dahil olmak üzere birçok türde, haploid germ-line kromatin olağanüstü bir epigenetik yeniden düzenlenmesi eşliğinde germ hücrelerinin morfolojik değişiklikler, (HP anahtarı) 6 histon-to-protamin anahtarı da denir. Muhtemelen hemen hemen tüm standart histon ve histon birçok varyant molekülü DNA'dan ayrılır ve olgun sperm kromatin özgü, yüksek ölçüde kompakt bir yapıyla sonuçlanan nucleoprotamine küçük temel protein, protamin, ile yer değiştirir. HP anahtarının genel özellikleri t vardırsonra ilk geçiş proteinleri tarafından ve nihayet protaminler tarafından histon varyantları tarafından kanonik histonların diye değiştirilmesi. 12 - Tüm bu histon kaldırılması 7,10 hemen önce böyle histon H4 asetilasyonu seviyelerinde bir dalgalanma olarak epigenetik işaretleri çeşitli değişiklikler eşlik eder.
Tümü değilse de çoğu, yukarıda sözü edilen işlemlerin, olgun, tam olarak fertil sperm gelişimi için gereklidir. Bu memeli spermatogenez pay olarak, omurgasız sistem 1,8,9 benzerliği önemli bir bölümü, Drosophila aynı zamanda insanlarda sadece geçerlidir. Germ-hücre gelişimini büyük ölçüde incelenmesi Drosophila model sistemde kolaylaştırılır. Sinekler genetik derece erişilebilir. Mutantlarının üretilmesi hem de kimerik gen ya da RNA interferans yapıları ifade eden uçucu soylarının kurulması çok az çaba gerektirir. Bununla birlikte, sonra-mayoz spermatojenez, mutantların kullanımının bir çalışmadad basit bir genetik araçlar sınıra ulaşabilir. Drosophila spermatogenezde, transkripsiyon mayoz bölünmeler içine girişi ile neredeyse tamamen sona erer. 16 - Böylece, öz değişmesine ait spermatogenez sonrası esas olarak uzun bir öz değişmesine ait profaz 13'te sentezlenen translasyon bastırılmış depolanmıştır mRNA'lar dayanmaktadır. Bu nedenle, RNA interferansı veya şartsız mutantlarının kullanımı gibi araçlar, özellikle de ön öz değişmesine ait ya da öz değişmesine ait germ hücre gelişiminde temel fonksiyonları yerine gen ürünlerinin post-öz değişmesine ait rolleri incelemek için uygun değildir.
20 - gibi durumlarda yararlanılabilir Drosophila bir avantajı, kültür ortamında 4,12,17 ex vivo olarak geliştirmek için teşrih sağlam testis ve germ hücre da kistlerin yeteneğidir. Testis veya germ-line kistlerin diseksiyonu ve yetiştirme canlı hücreler germ hücre gelişiminde değil, sadece mikroskopik gözlem sağlar, ama birLSO farmakolojik deneyler, kullanımı gibi, örneğin, histon asetiltransferazlar (şapka), histon deasetilazların (HDAC'ler), topoizomerazlar, ya da proteazom gibi enzim komplekslerinin önleyicileri. Bu nedenle, post-mayoz spermatogenez sırasında enzimatik fonksiyonları işlemek için ve ne olursa olsun, embriyonik ön-mayoz veya mayoz fonksiyonların 4,12 gelişimsel sonuçlarını izlemek mümkündür.
Farmakolojik analizlerde, biz daha önce mayoz profaz sırasında bromodomain proteinin asetilleşme bağımlı lokalizasyonu gibi şapkalar ve HDAC'ler 12,21 hedefleyen özel inhibitörleri kullanarak post-mayoz spermatogenezde epigenetik, HP anahtarı için histon asetilasyonun düzeylerinin alaka analiz. Bu deneylerde, HP anahtarı Hedefleme füzyon genleri histone2AvD-TTT ile endojen desen protamineB-EGFP 12,22 eksprese eden bir uçucu suşu kullanılarak mümkün kılınmıştır ve gözlem olduğupupa testislerde ilk spermatid 24 ve 48 saat APF 12 arasındaki HP anahtarı geçer.
Sunulan protokol Drosophila pupa, kültür koşulları ve sağlam olan bir pupa testis farmakolojik testte testis ve kistlerin diseksiyon açıklar. Bu amaçla, puparium formasyonu (APF) sonra yaklaşık 24 saat sonra pupa testis kesilip alınmıştır (Şekil 1 ve 2 'ye bakınız). Bu anda, testisler diğer dokulara bağlantıları yapılmış değil ve inhibitör bileşiklerin 23,24 daha iyi nüfuz etmesini sağlar sadece ince bir dış kılıf ile çevrilidir. Testisler kolayca kültürün içine alınabilir fasulyesi ya da armut şeklinde bir organdır. Bu kültür testis, kesilmiş ve spesifik inhibitörleri ile tedavi edilmektedir. Daha sonra, inhibitörlerin etkileri immünofloresan analiz eder ve füzyon protein ifade floresan mikroskopi kullanılarak izlenir ve nükleer morfolin karşılaştırılmasıylaTedavi edilmeyen germ hücrelerinin olduğu için tedavi germ hücrelerinin ogy. Bu protokol sunulan koşullar aynı zamanda kültür testisler ve germ-line kistler gelişmekte canlı görüntüleme sağlar.
Protocol
Etik bildirimi:
Bu protokol açıklanan deneysel işlemler münhasıran Drosophila melanogaster ile çalışmak ve Almanya'da hayvan refahı yasalara tabi değildir barındırır.
Medya, Araçlar, ve Sinek 1. Hazırlık
- Potasyum bikarbonat 17 olmadan değiştirilmiş piyasada mevcut toz M3 büyüme ortamı hazırlayın. DİKKAT: Göz ve cildi tahriş eder. % 10 cenin sığır serumu ile orta Ek, 100 E / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. En iyi sonuçlar için ısı ile inaktive edilmiş ve böcek kültür test edilmiş cenin sığır serumu kullanın. -20 ° C'de parçalar halinde, 0.2 um'lik bir şişe iyi filtre birimi ve mağaza (ortam diye değinilmektedir) tam orta filtre. Kullanmadan önce, filtre (0.2 mikron şırınga filtre ucu) orta tekrar çökeltilerin kaldırmak.
- Farmakolojik deneyler için önleyici stok çözelti hazırlayın. Dissolalikotları uygun bir solvent ve mağaza kimyasal ettik. (: Göz ve cildi tahriş edicidir DİKKAT) dimetilsülfoksitte Örneğin, 28.69 mM anakardik asit stok çözeltisi hazırlamak.
- Disseke pupa testis ve tek kist diseksiyon bozulması için araçlar hazırlayın. Iki keskin ve sert iğneler yerine bir çift forseps kullanın. Forseps bir çiftinin iki kolu arasında gelişen kılcal kuvvet çok zor ortamı az miktarda tek kist diseksiyon hale getirir. Örneğin, bir aşı halka tutucu içine yerleştirilmiş paslanmaz çelikten bir böcek iğnesinin ucunu kullanın.
- Beyaz sinek, yeterli sayıda (yaklaşık 40-60 sinekleri) ile uygun olarak yaşlı pupa, tohum ca. 10, büyük kültür şişeleri (4 cm çaplı borular) elde etmek için. HP anahtarı analiz etmek için, onların endojen desen 12,16,22 içinde H2AvD-RFP ve ProtamineB-eGFP ifade sinekler kullanın. 25 ° C'de standart koşullar altında inkübe şişeleri, En fazla 4-5 gün üçüncü instar larvaları tarama kadar takriben ° C ile şişelerin 25 duvarlarında pupa başlar.
Diseksiyon için 24 saatlik eski Pupalar elde edilir 2. İşaretleme veya Beyaz Toplama Pre-pupa
- , HP anahtarı bazı kimyasalların etkisini test yaklaşık 24 saat APF 12 de pupa testisi incelemek. Aşamalı pupa elde edilmesi için, larva pupa ile hazırlanan sinek kültür şişeleri alır (Bölüm 1.4) ve mümkün olduğu kadar çok beyaz önceden tespit pupa. Pupa yılında ilk adımı sırasında ön-pupa hareketsiz olmayan beslenme, dışa çekik spiracles ve beyaz renkli puparium ile oldukça kısaltılmış larva olarak görünür. Puparium pupa gelişme 26 sonraki aşamada gösterir 30 ila 60 dakika, içindeki kahverengi-kahverengi olur.
- Viyallerin dış kalıcı bir kalem ile ön pupaların bir şekilde işaretleyin. Yaklaşık 24 saat boyunca 25 ° C'de inkübe şişeleri.
- Seçenek olarak,PBS tamponu ile nemlendirilmiş küçük bir fırça ile şişelerin yan ön pupa seçin. Daha sonra yeni bir 50 ml'lik reaksiyon tüpünün yan ön pupa aktarın ve yaklaşık 24 saat boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
Puparium Formasyonu sonra yaklaşık 24 saat sonra Pupa Testislerindeki 3. Diseksiyon
- , 10 cm Plastik hücre kültürü ya da bir Petri tabağına orta birkaç damla (yaklaşık 80 ul her biri) dağıtın. Forseps geniş bir çift veya ortam ile nemlendirilmiş bir fırça kullanarak, (bakınız bölüm 2) kuluçkaya flakonlarından 24 saat APF aşamada pupa almak. Yemeğin orta her damlasını bir pupa aktarın.
- Diseksiyon için, bir fiber-optik aydınlatıcı ile teçhiz edilmiş bir stereo mikroskop kullanılır. Bu kültürde doğru gelişmesini engelleyebilecek gibi diseksiyonu sırasında RT yukarıda testisler ısıtmayın.
- No 5 forseps iki çift ile pupa ayır. Bir çift, onun en posterior pupa kapmakbölüm (posterior spiracles) ve konumda tutun.
- Forseps diğer çifti ile ön spiracles tut ve ön sonunda pupa kapakçık açın. Toraks en azından bir kısmı açığa çıkana kadar pupa davayı soyulabilir.
- Onun en arka sonuna pozisyonda pupa tutmaya devam edin. Pupa iç basıncını serbest bırakmak için, pupa kafa bölgesine forseps çiftinin her iki kolu yerleştirin.
- Forseps açılması ve anterior yönde forseps hareket ettirerek açık pupa rip. Bu hareket ile oluşturulan açıklık ilk denemede mümkün olduğu kadar büyük olduğundan emin olun. Basınç bu testisler küçük açıklıktan doğrudan itiliyor ve en sık engelleniyor neden olabilir olarak piyasaya sürülmüştür önce, arka sonunda pupa zarar kaçının.
- Pupa açıldıktan sonra, pupa salınan iç basınç la ile yağ ve vücut hücreleri ve doku topakların presler gözlemleyinkafa bölgesinde rge açılması. Pupa testisler zaten bu malzeme ile pupa itilmiş olup olmadığını kontrol edin; Bu, bazı durumlarda ortaya çıkar. Testis 24 saat APF herhangi bir başka doku ile bağlantılı değildir ve bu nedenle pupa 23 kolaylıkla çıkabilmektedir.
- Onlar pupa kalırsa bu testislerin zarar verebilir forseps ile pupa sıkmaktan kaçının. Forseps kullanılarak bir çift açıklığın büyütün.
- Daha sonra, en arka ucunda pupa tutun. Pupa testisler serbest bırakmak için anterior posterior gelen pupa içeriklerini diğer forseps çifti ve yavaşça çizgi kapatın.
- Önceden kesilmiş 200 ul pipet içine çekerek testisler toplayın. Testisler ile transfer vücut yağ hücrelerinin sayısını azaltmak için orta sadece çok küçük bir miktar transfer çalışın. Bir taze kültür çanak ortamı içine testisler yerleştirin. Sadece birkaç şişman vücut hücresinde kadar testislerde orta birkaç kez yıkayıns kalır.
- Canlı görüntüleme için, orta ile bir cam alt kültür çanak testisler aktarmak ve ters bir görüntüleme mikroskop kullanıyoruz. Farmakolojik deneyler, adım 5 ile devam edin.
Erkek germ-line Kistler ve Canlı Görüntüleme 4. Diseksiyon
- Cam-alt kültür çanak için bir veya daha fazla pupa testis aktarın.
- Fiber optik aydınlatma ve iki paslanmaz çelik iğne ile stereo-mikroskop kullanmak erkek germ-line kistlerin diseksiyonu için (bölüm 1.3).
- Bir iğne ile, dikkatlice ön veya arka ucunda bir testis aşağı pin deneyin. Konumda tutun. Testis içine diğer iğneyi ve yanlara iğne hareket ettirerek testis kılıfı bozabilir. Kistlerin çoğu bu hareketi ile testisten çıkacak.
- Bir iğne ile pozisyonda testis tutmaya devam edin. Diğer iğne ile testisten kalan kistlerin nazikçe çizgi.
- Gent tarafından Ayrı toplanmış kistleri yaly kistlerin küme aracılığıyla veya 200 ul pipet kullanarak ortam ile taze kültür çanak kistleri aktararak yana bir iğne hareket.
- Tek kist canlı görüntüleme için ters bir görüntüleme mikroskop kültür çanağı hareket. Bir iğne gerekirse yeniden kist dağıtılır.
- Faz-kontrast ve floresan mikroskobu kullanarak kistlerin sahne tanımlayın.
- Istenen aşamada bir kist odaklanın. Kistler kültür çanak alt uymak ve bu nedenle odak akıp eğilimi yok gibi, sık sık uzun görüntüleme deneyleri sırasında odak ve kist konumunu onaylayın.
Not: Hareketsizleştirme için poli-L-lisin ile çanak kaplanması erken germ-çizgisi kist gelişimi için zararlıdır. Bunun yerine, bireysel kistler izole edilebilir. Bazı uygulama ile, çok hafifçe iğne ile iterek belirli bir kist tek tek mümkündür. Bu ayrı kült tek kistlerin transferi sağlayacakmikroskop görüş alanına sığar çizilmiş bir ucu bir cam Pasteur pipeti ile ure yemekler. İzole kistler daha sonra kolayca hatta uzun süreli inkübasyon sonrasında kültür tabaklarında taşındı olabilir.
Bozulmamış Pupa Testislerindeki 5. Farmakolojik Deneyi
- 12 replika deney için ortamdan 500 ul, 24 gözlü hücre kültür plakasının her bir gözeneğine doldurun. Önceden kesilmiş 200 ul pipet kullanarak her bir kuyunun Transfer tek pupa testis,.
- Ters bir floresan mikroskobu kullanılarak izole testislerde protaminler varlığı kontrol edin. Testisler, HP anahtarı kistlerin herhangi bir yer almadığını gösterir ProtamineB-eGFP sinyal, ücretsiz olmalıdır. Zaten ProtamineB-eGFP-pozitif kistler göstermek testisler değiştirin.
- İlk 12 kuyuya, arzu edilen nihai konsantrasyonu elde etmek üzere seyreltildi inhibitör bileşiği (anakardik asit) içeren bir maddenin 500 ulOyuk başına 1 ml ortam maddesi içinde (150 uM). Tedavi edilmeyen kontroller olarak kalan kuyuları kullanın; inhibitör bileşikleri gibi kullanılan çözücü ile aynı miktarda ortamının 500 ul ilave edin. Not: Birçok farklı bileşik, ve çözücü maddeler kullanıldığında, bu kontrol olarak sadece ortamını kullanmak için daha verimli olabilir ve ayrı deneyde çözücü artan konsantrasyonlarının etkisini test etmek.
- Karanlıkta, 24 saat boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
- Yukarıda tarif edildiği gibi inkübe testislerde protaminler varlığında tekrar edin. Kontrol testis, HP anahtarı aracılığıyla geçişi gösterir bir veya daha fazla ProtamineB-eGFP-pozitif kistler, göstermelidir.
- 200 ul, bir pipet ucu kullanarak, poli-L-lizin kaplı slaytlar testisler aktarmak başka 12,27,28 tarif edildiği gibi uygun bir floresan antikorlar ile kabak hazırlıklar ve leke olun.
Representative Results
Drosophila erkeklerde testis zaten embriyo oluşturulur ve larva aşamalarında vücut boşluğunda devam edilir. Üçüncü instar larvaları gösteren küçük, yuvarlak testis gelecek pigment hücrelerinin bir tabakası ile çevrilidir ve yağlı vücut doku (Şekil 2A) içine gömülmüştür. Yetişkin erkek sinekler testisler genital disk ve pigment katman 24 kaynaklanan kas hücresi tabakası ile kaplı olan uzun, dolaştırılmış borular, bulunmaktadır. İlginçtir, larva testisler mayoz profaz karşılık birincil spermatosit aşamasına kadar ön-mayoz ve mayoz aşamaları sadece germ-line hücreleri içeren 23 (ayrıca 1 bakınız Şekil). Germ hücre kuşakların ilk puparium oluşumu sırasında mayoz geçer. Yaklaşık 24 saat APF at, uzun flagella ile post-mayoz aşamaları zaten geliştirdik ve tüm çekirdekler histon H2AvD-RFP içeren (Şekil 1 ve 2B). Spermatidlerin hiçbiri t uğramıştırHiç ProtamineB-EGFP sinyali olarak, HP anahtar floresan mikroskobu (Şekil 2C) ile tespit edilebilir. Sık sık, bu aşamada kesilir testis yağ birkaç damla (Şekil 2C, ok başı) bir yağ, vücut hücrelerinin granül veya bir andıran değişken büyüklükte bir oto-floresan bir yapı içerir. Testis içinde bu yapı aynı zamanda faz-kontrast mikroskobu ile görülebilir. Bugüne kadar, biz literatürde yılında doğanın herhangi bir açıklama bulamadık. 36 saat APF disseke testisler uzatılmış ve bazı durumlarda zaten (Şekil 2D) kıvrılmaya başlar görünür. Onlar zaten genital hayali diskten 23,24 dışarı büyüyen genital sistem dokulara eklenmiş. Bundan başka, sık sık ProtamineB-EGFP bir sinyal (Şekil 1 ve 2 boyutlu, ok) ile gösterildiği gibi, HP anahtarı ötesindeki ilk spermatidlerin içerir. 48 saat APF anda, testisler daha uzun ve açıkça da curling başlarproksimal ucu. Protamin-pozitif çekirdeklerin ile birkaç germ-line kistler (ok, Şekil 2E) görünür hale gelir.
24 saat APF de kesilmiş testis 24 saat boyunca kültür içinde tutulur, bunlar sağlam sinek gibi ince uzun olmayan ('Şekil 2D karşılaştırın, Şekil 6A ile 2E). Bu, normal olarak arka ucu 23,29 de testis temas gelişmekte olan genital gönderilen konum ve büyüme sinyallerine eksikliği sahip olmasından kaynaklanmaktadır. Doğmakta olan miyotüpleri testis 24 genital diskten geçiremez, çünkü Ayrıca, testis kılıfı kas tabakası gelişmez. Testis kılıf-bu durum sadece ince pigment tabakası-ki içinde germ hücreleri gelişmekte artan sayıda zarf kültür yeterince büyümek gibi görünmüyor. Ancak, germ hücreleri, bölme büyür ve bağımsız testis kılıfı ayırt. Bu nedenle, en fazla 36 saat sonrakültür r, erken testis sık sık açık patlama olacak ve daha da geliştirilmesi görülmez. Ancak, daha kısa bir zaman dilimi içinde, o Şekil 3A -3 C ile kanıtlandığı gibi, kültürde gelişen bütün testis time-lapse, ex vivo canlı görüntüleri kaydetmek mümkündür (ayrıca 1 Ek videoyu görmek). Yaklaşık 45 saat APF de kesilmiş bir pupa testis, 6 saat boyunca ortam içinde inkübe edildi ve her bir 5 dakika görüntülendi. Bu süre içinde, spermatidlerin birkaç kistleri, HP anahtarı aşamasından çıkacak ve ('-3 C, açık oklar Şekiller 3A) parlak ProtamineB-eGFP sinyal gösterir.
Yukarıda belirtildiği gibi, Drosophila testiste erkek germ hücreleri birbirine hücrelerinin senkronize demetleri gibi geliştirmek, adını kistler 1. Şekil 4A çevresinde 24 saat APF bir pupa testisten disseke kistlerin bir özetini göstermektedir. Ön öz değişmesine ait aşamaları, Mayoz evreleri, erken post-mayoz aşamaları ve ayrıca (Şekil 1 ve 4B -4 E) bulunabilir, HP anahtarına önce uzun çekirdekleri ile erken kano aşamada kaybolur. İzole kistler çok kırılgan ve dikkatle ele alınmalıdır. Kist zarfı oluşturan iki somatik hücreler mekanik olarak kolayca bozulabilmektedir. Germ-çizgisi kök hücre hayatta kalma ve in vivo somatik 30 kist hücrelerin genetik ablasyonu sonra bölünen devam yeteneğine sahiptir. In vitro olarak, 16 hücreli aşamada germ hücre, daha fazla geliştirmek ve 19 birbirinden ayırarak somatik zarf ayrılmış olduğu bildirilmiştir. Nitekim, biz muhtemelen geç spermatositler çok seyrek de olsa, kesintiye kist hücreleri ile mayoz bölünme tamamlanmış bizim kültür sisteminde fark ettim. En sık bu kesintiye kistler gelişimini durdurdu. Sunulan protokol izlenerek, bazı durumlarda olduğu gibi kistleri olabilir dev72 saat bir süre için Develop ex vivo kültür içinde ortam. Ancak, kist makul bir sayıda inkübasyon 48 saat kadar hayatta olduğu görülmektedir. Bu süre içinde, kültürlü kistler HP ötesine geç kano aşama 12 geçene kadar mayoz bölünmeler sonrasına kadar yanı sıra histon tabanlı kromatinli yuvarlak çekirdekleri aşamasından birincil spermatosit aşamasından geliştirmek edebiliyoruz. Bu öz değişmesine ait bölünme spermatositler (Şekil 5 ve 2 Ek Video) girişi, örneğin, spermatogenez yaşam süreçlerini canlı görüntüleme sağlar. Bu deney için, RFP-işaretli histon varyant H2AvD kromozom markeri olarak kullanılmıştır. Birincil spermatosit aşama vivo 31 yaklaşık 3 gün boyunca devam eder. Bu nedenle, mayoz bölünmeleri kaydetmek için, biz gözle kromatin yoğunlaşması (Şekil 5A, bölge 2) başladı spermatositlerin ile kistler seçti. Mayoz bölünme spermatositlerde başlarKalan spermatositlerde bir dalga takip ederse, kistin bir tarafında ve (bölge 1 ve bölge 2'de Şekil 5A'da da 2 Ek video). Kromatin Yoğunlaşma yakında parlak noktalar (Şekil 5A, bölge 2) gibi görünür hızlı hareket kromozomlar yol açar. 30 dakika sonra, bu bölgenin birinci spermatositler (Şekil 5B, ok başları) telofaz zaten. Genç bölgesi 1 kromozomları metafaz levha 20 dakika, daha sonra (Şekil 5C) de sağlayabilir. Onlar tam telophase ve yaklaşık 15 dakika sonra (Şekil 5D) sitokineze geçmesi hazırız. Anafaz, telofaz ve sitokinez bu kaydı (Ek videoda 2) içinde yaklaşık 10 dakika sürdü.
Memelilerde, hem de Drosophila gibi histon H4 asetilasyon belirgin bir artış sonrası öz değişmesine ait sırasında histon çıkarılması ve HP anahtarın başlangıcına işaretspermatogenez 6,11. Bu modifikasyon bir epigenetik temel bir bileşeni veya HP gelişimsel program bile tetik 10,32 geçiş olduğu önerilmiştir. Daha önce, inhibitörleri post-mayoz aşamaları 12 sırasında histon H4 asetilleşme seviyesini etkilemek için şapkalar ve HDAC'ler hedefleme ile kültür içinde Drosophila pupa testisler tedavi. Bu farmakolojik deneyler olarak, histon asetilasyonu protamin bazlı kromatinli aşamalarına histon bazlı kromatinli aşamalarında spermatogenez ilerlemesi için gerekli olduğu bulunmuştur.
Şekiller 6 ve 7 pupa testislerde şapkalar hedef anakardik asit kullanılarak bir farmakolojik tahlil için temsili sonuçlar göstermektedir. 24 saat APF testisler H2AvD-RFP ve ProtamineB-eGFP ifade eden bir sinek suşundan disseke edildi. ProtamineB-eGFP protein bu erken pupa testislerde (Şekil 6A ve B) yoktu. 24 saat sonrakültür r, kontrol testisler ilk kistleri, HP anahtarı (Şekil 6A ', açık ok uçları) ötesinde gelişmiş olduğunu gösterdi ProtamineB-eGFP sinyalleri gösterdi. Bu 150 mcM anakardik asit (Şekil 6B ') ile tedavi testisli durumda değildi. Testis squash hazırlıkları ve immunofloresan analizler daha ayrıntılı bilgi (Şekil 7) sunuyoruz. Tedavi edilmeyen kontrol olarak, nispeten büyük primer spermatositlerin çekirdekleri büyük kromozomlara Drosophila (Şekil 7A, sütun 1) içinde (4 ° C düzeyine) uygun zengin lekeli üç DNA bölgelerin karakteristik modeli ile tespit edilebilir. Histon H4 asetilasyonu, bu aşamada (Şekil 7B, sütun 1) belirgin bir şekilde tespit edilebilir. Öz değişmesine ait bölünme sonraki ilk aşama Nebenkern aşaması olarak bilinmektedir ve daha büyük, yuvarlak çekirdekleri ile karakterize edilir (bkz Şekil 4C, Şekil 7'de gösterilmeyen). Şekil 7 'de gösterilen bir sonraki aşama kamçılı büyüme ve daha önce (Şekil 7A, sütun 2) daha önceki safhalar içinde çok daha küçüktür ve histon H4 asetilasyon neredeyse bulgulanamaz seviyelere çok düşük göstermektedir germ hücre çekirdeklerinin, yuvarlak şekil ile tanımlanır (Şekil 7B, sütun 2). Yuvarlak sonra, (Şekil 7A, sütun 3) uzatır ve histon H4 asetilasyon açıkça tekrar (Şekil 7B, sütun 3) tespit edilebilir. Spermatidler sonra HP anahtar yer alır ve histonlar protamin ile ikame edildiği kano şekil aşamaya ulaşmak için (Şekiller 7A - 7 ° C, sütun 4 ve 5). Kano aşamasını takiben protaminated çekirdekleri daha sonra, olgun sperm (burada gösterilmemiştir) ve çok ince bir iğne şekline tabakasından oluşur.
Anakardik asit ile tedavi testis Testis kabak hazırlıkları sonuçları (Şekil farklı 7D <gösterdi/ Strong> - 7 F). Anakardik asit ile muamele edilmiş olan tohum hücreleri içinde daha fazla kromatin muamele edilmemiş kontrol (Şekil 7D, muamele edilmiş ve 7A, kontrol ile karşılaştırın) daha özet yazı. İmmünofloresan H4 asetilasyonu büyük ölçüde azalmış veya anakardik asit (Şekil 7E) ile muamele germ hücrelerinin çekirdeklerinde bile yok olduğunu ortaya çıkardı. Histon asetilasyonu eksikliği kromatin bölgelerde sık sık, baskıcı bir yapı 33 gösterir iken, yüksek oranda asetile histonlar açık kromatin bölgeleri ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, anakardik asit ile muamele, muamele edilmiş germ hücre çekirdeklerinin kromatin yapısını etkilediği şaşırtıcı değildir. Önemlisi, geç kano aşamasında veya dışında hiçbir protamin-pozitif çekirdekler tedavi testis (Şekil 7K) tespit edildi. Spermiogenesis fro devam etmek için Böylece, veri fikriyle tutarlıdır ŞAPKA aktivite şart olduğunum protamin tabanlı kromatin aşamalarında kromatine histon tabanlı.
Drosophila spermatogenez Şekil 1. Genel Bakış. Sol panel bireyselleştirilmiş sperm kök hücre germ hücresi gelişiminde aşamaları dizisini gösterir. Şematik çizimler germ hücrelerinin karakteristik nükleer morfoloji göstermektedir. Bir spermatogonyum bir kist 16 birbirine sperm hücrelerine üretmek için böler. Bu aşamada post-mayoz gelişim için gerekli transkript çoğu, üretilen translasyondan bastırılmış ve saklanır. Transkripsiyonel aktivitesinin toplu mayoz bölünmeler içine girişi ile sona erer. Kromatin olarak histonla kadar protamin anahtarı, erken ve geç evre kano arasında gerçekleşir. Bir histon bazlı kromatinli aşamaları yüksektirkırmızı ışıklı; protamin tabanlı kromatinli aşamaları yeşil vurgulanır. Sağ panelde çubuklar yaklaşık 24 bulunan germ normalde larvaları gelişmekte testiste bulunabilir hücrelerin, pupa evrelerini ve puparium oluşumundan sonra 36 saat (APF), ve yetişkin sinekler gösterir.
Farklı gelişim aşamalarında 2. Drosophila testisler Şekil. (A) üçüncü evre larva (L3) biraz ezilmiş tüm montaj Testis Faz-kontrast görüntü. Sadece ön-mayoz ve mayoz aşamaları bulunabilir. Spermatogonia göbek bölgesi (yıldız) altında ön ucu ile sınırlıdır. Kalan testis spermatositlerin (açık ok). (B) yaklaşık bir miktar ezilmiş testisin Faz-kontrast görüntü ile doldurulur Puparium oluşumu (APF) sonrası 24 saat. Spermatositler (açık ok) ek olarak, testis artan flagella (çift açık ok başı) kademeler ince ve uzun yuvarlak çekirdekleri ve spermatidler ile Nebenkern aşamasında spermatidlerin (açık ok başları) içerir (C - E). Ifade pupa testisler Tüm montaj H2AvD-RFP ve ProtamineB-eGFP (faz-kontrast ve eGFP ve RFP floresan görüntü bindirmeleri). (C) yaklaşık 24 saat APF disseke Pupa testis. Ok başı yaklaşık 36 saat APF de kesilmiş farazi yağ, vücut hücrelerinin. D) Pupa testis oto-floresan birinci ProtamineB-EGFP-pozitif kisti (ok) gösteren işaretler. Yaklaşık 48 saat APF (e) Pupa testis bir grup ile ProtamineB-eGFP-pozitif kistler (ok). Tüm şekil parçaları, yıldız göbek bölgesini gösterir. Ölçek çubukları: 100 mikron.ank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ex vivo büyüyen bir pupa testis histon-to-protamin anahtarı 3. Canlı görüntüleme Şekil. (A) puparium oluşumu (APF) sonra yaklaşık 45 saat sonra kültürün içine alınmıştır H2AvD-RFP ve ProtamineB-eGFP ifade eden bir pupa testisin Faz-kontrast görüntü. Seminal vezikül dolu bir okla gösterilir. Bir paragonium (çift ok) testis bağlı kalır. (A ') (A) gösterilen testis eGFP ve RFP floresan. Açık ok bir ProtamineB-eGFP-pozitif kist gösterir. Ölçek çizgisi:. 100 mikron (B) 2 saat kültürde 30 dakika daha bir dizi kistler (açık ok) sonra ortaya from ek yaklaşık sonra histon-protamin ile geçiş. (C) Kültür 3 saat, örneğin kültür içinde 5 saat 29 dakikalık bir toplam güçlü ProtamineB-EGFP sinyal kistler bir (açık ok) testis yakın ucunda görülebilir. Ayrıca Ek Video 1 Bkz. Tüm şekil yerinde, yıldız göbek bölgesini göstermektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklı gelişim aşamalarında germ hücrelerinin 4. İzole kistleri Şekil. (A) Kistler puparium oluşumu (APF) sonra yaklaşık 24 saat sonra bir testisten disseke. Faz-kontrast ve H2AvD-RFP floresan (kırmızı) görüntü Yerleşimi. Ölçek çubuğu: 100 mikron.(B - E) farklı aşamalarında tek kist büyütmeler. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve H2AvD-RFP floresan görüntüleri Yerleşimi. Ölçek çubuğu:. 16 spermatositlerin 20 mikron (B) Kist Nebenkern aşamada 64 yuvarlak spermatid (C) Kist.. Nebenkern yapısı sonraki çekirdeğe (açık ok başı) erimiş mitokondri gelişir ve DIC görüntülerde görülebilir. Yuvarlak H2AvD-RFP-pozitif çekirdek ve uzayan Kamçılı spermatidlerin (D) Kist (açık ok ucu eşlik eden bir uzayarak Nebenkern yapısını gösterir büyüyen axoneme). (E) uzun bir nükleer şeklini gösteren erken kano aşamada spermatidlerin bir kist Apikal ucu. Yoğun uzatılmış flajeller sadece kısmen görebilir. bu f büyük halini görmek için buraya tıklayınızŞEKIL.
H2AvD-RFP ifade kültüründe bir kist mayoz ben ex vivo. Floresan görüntüleri geçiren bir tek 16-spermatosit kist Şekil 5. Canlı görüntüleme. Kistin bir dalga benzeri şekilde mayoz bölünmeler geçmek mayoz I. spermatositlerin karakteristik aşamaları. Olan tasvir (A) Kromozom yoğunlaşma okla gösterilen kist (yönünde yoluyla (2) kistin bir tarafında çekirdeklerde başlar ve ilerler ). Karşıt bölgede çekirdekler (1) üç büyük kromozom işaretleme histon-yoğun bölgeler hala ayırt edilebilir kromatin yoğunlaşması, bir önceki aşamasını temsil eder. Bölgede spermatositler (2) görünür parlak floresan noktalar tam olarak yoğunlaşmış kromozomlar içerir. (B) 30 sonra0; kromozom yoğunlaşma bölgesi (1) 'de devam ederken dakika bölgenin ilk spermatositler (2), telofaz (açık ok başları) olarak ifade edilmiştir (C) bölgesinde son spermatositler (1)', kromozomlar (ok başları) düzenlenmiştir. başka bir 15 dakika içerisinde metafaz plakası 20 dakika sonra. (D), son spermatositler telophase tamamlamış görünüyor ve şimdi sitokinez (açık ok uçları) geçmesi için hazırız. . Ayrıca Ek video 2 Ölçek çubuğu görmek:. 50 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. anakardik asit kültürlü pupa testislerde histon-to-protamin anahtarını önler. Pupa testislerde Expressi ((DMSO, dimetilsülfoksit;, 'A, A, kontrol), ya da 150 uM anakardik asit ile takviye edilmiş ortam içinde ng H2AvD-TTT ve ProtamineB-EGFP ve puparium oluşturulduktan sonra 24 saat sonra kesilir (AFP), inhibitör olmadan ortam içinde 24 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı B, B '). Asterisklerle gösterildiği gibi göbek bölgeleri. (A, B) Resim ProtamineB-EGFP-pozitif kistler diseksiyon fark edilebilir. (A ') kuluçkalamadan 24 saat sonra, bir kist histon-kadar-protamin anahtarı ve ProtamineB-EGFP-pozitif uygulandı anakardik asit ile muamele edilmiş kistler (açık ok başları) gözlenebilir. (B ') Deneyler ProtamineB-EGFP-pozitif kistler gelişmez. Ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 7. anakardik asit histon H4 asetilasyon ve spermatidlerin kromatin yapısını etkiler pupa testislerinden spermatid nükleuslarının ProtamineB-EGFP ifade (24 saat APF) inhibitörü (A - C) olmadan 24 saat boyunca kuluçkaya Kabak preparatları. Ya da 150 uM anakardik asit (D - F). DNA, Hoechst boya (A ve D) ile boyanmıştır. H4 asetilasyon (B ve E) immunofluorescently analiz edilmiştir. ProtamineB-EGFP sinyali (c ve f) ile takip protaminler bulunması. Anakardik asit ile muameleden sonra, kromatin güçlü bir (D) sıkıştırılmış olduğu görülür ve H4 asetilasyon sinyal tamamen herkes spermatid aşamada (D) olarak azalır. Buna ek olarak, anakardik asit ile muameletestisler geç kano aşamasında ya da dışında hiçbir kistleri ve hiçbir ProtamineB-eGFP sinyali (F) gösterir. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Video 1. 6 saat zaman ders görüntüleme ex vivo. Videolu büyüyen bir pupa testis eGFP ve histon-to-protamin anahtarı RFP floresan üzerinden canlı görüntüleme ProtamineB- dağılımındaki artışın histon-to-protamin geçişini gösterir eGFP pozitif kistler. Görüntüler her 5 dakikada elde edildi. Ayrıntılar için, bkz Şekil 3. (Yüklemeler altında "suppl_video_1.MOV" bak).
Tek bir 16-spermatositler kist geçiren mayoz Ek Video 2. Canlı görüntüleme ben ex vivo. Bir Time-lapse floresan görüntüleme80 dakika boyunca H2AvD-RFP'yi tanımlayan kültür kist. Bu video mayoz I. Görüntüler karakteristik aşamaları her 1 dakikada satın alındı göstermektedir. Ayrıntılar için, bakınız Şekil 5. (Yüklemeler altında "suppl_video_2.MOV" bak).
Discussion
Sunulan protokol belirli bir gelişim aşamasında ve bir kültür çanak bu hücrelerin ve dokuların ex vivo geliştirme Drosophila testisler ve tek germ-line kistler incelemek için yeteneği hem dayalı iki farklı uygulamaları açıklar. Diğer bir uygulama geliştirme sırasında sperm yaşam süreçlerini önemli farmakolojik değiştirmedir. Önemlisi, bu kolayca sinek genetik dayalı işlevsel analizler kullanılarak elde değil post-mayoz spermatogenez için erişim sağlar. Diğer uygulama yaşayan ve germ hücreleri ve testislerin geliştirilmesi mikroskobik gözlem. Özellikle kültür Drosophila hücreleri ve organların yeteneği, bu uygulama avantajları hayatta kalma ve oda sıcaklığında ve normal bir atmosfer altında geliştirmektir. Böylece, bir (25 ° C standart yetiştirme sıcaklıkta ısıtılarak) ısıtılmış aşaması ile donatılan bir ters mikroskop görüntüleme canlı görüntüleme deneylerinde anlamlı sonuçlar elde etmek için yeterlidir. Ayrıcacanlı görüntüleme için floresan protein-etiketli proteinleri eksprese Dahası, pek çok transjenik sinek suşları mevcut veya kolayca kurulabilir.
Belirli bir gelişim aşamasında pupa testisler ya da germ-line kistler elde etmek için, bu bir Drosophila gelişme zamanlama aşina olduğu önemlidir. Her aşama için kesin zamanlama laboratuvarlar, kültür koşulları arasında değişir ve suşları sinek ve ampirik kurulmalıdır olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, bu örnek için, HP anahtarı hedef, farmakolojik tahliller için özellikle önemlidir. Bu deneyler için, zamanlama bile bir popülasyon içinde değişiklik gösterebilir, çünkü her gerçek önleyicisi test öncesi bir ProtamineB-EGFP sinyal spermatidler kontrol edilmesi tavsiye edilir.
Ekli vücut yağ dokusu serbest dokunulmamış organlar gibi erken pupa aşamalarında testisler incelemek için deneyci sağlamalıdır yukarıda protokolünü takiben. Bu testis ve hatta daha çok, ge izolerm-hat kistler çok kırılgan. Bu nedenle, taşıma ve forseps, iğneler, ve pipetler kullanarak testisler ve kistler aktarılması için gerekli el becerisi ve deneyimlerini geliştirmek için çok önemlidir. Özellikle mayoz ve erken post-mayoz germ hücresi gelişimini hedefleyen çalışmalar bu yararlanacak. Erişkin testis uzun Kamçılı geç spermatid kistleri incelemek için nispeten kolay olsa da, daha önce aşamalarını elde etmek zordur. Bu protokol sonrası erken pupa testis bu kistler Diseksiyon çok daha verimli. Olağan sinek türünde, pupa sadece yaklaşık% 50 erkek olacak aklınızda tutun. Bu nedenle, gerekli testislerin sayısı kadar pupa olarak en az iki kez incelemek için hazırlar. Alternatif olarak, testisler dokunulmamış larva 23,34 yanal yağ vücut dokuları içine gömülü olarak saydam tur organları tespit edilebilir, stereo-mikroskop kullanılarak erkek L3 larvalarına tespit etmek ve taze kültür şişeleri içerisinde toplamak mümkün olduğunu canevreleme ve diseksiyonlardan ön-pupa seçmek için kullanılabilir. Bu erkek ön pupa 35 tespit etmek de mümkündür.
Ayrıca önceden 18 bildirilmiştir Biz, izole germ-line kistler ve kültür bozulmamış pupa testisler hem ışık duyarlı olduğunu fark ettim. Bu ışık duyarlılığı da farmakolojik deneylerde kullanılan bazı kimyasal bileşiklerin tutabilir. Bu nedenle, inkübasyon sırasında karanlıkta bir tahlilin kültür kaplarına tutmak için en iyisidir. Gelişmekte testis ve time-lapse görüntüleme deneyleri planlarken Aynı şekilde, özellikle, izole kistler, çok uzun pozlama süreleri ve / veya çok yüksek örnekleme oranları, ex vivo gelişimini engelleyebilmektedir akılda tutmak. Uygun olan numune alma oranı deneysel olarak tespit edilmelidir.
Kültür tabaklarında bakteriyel ve / veya mantar enfeksiyonları ve aşırı büyüme ciddi bir sorun teşkil etmektedir. Çok bakteri ile enfekte kültür yemekleri ex vivo deve desteği yoktestis ve kistlerin lopment. Bu nedenle, tarif edilen kültür ortamı, penisilin ve streptomisin (adım 1.1), ancak uzun süreli inkübasyon sırasında içerir Bu antibiyotikler, düşebilir ve etkinlik azalır olabilir. Bu sağkalım sınırlı bir süre için nedenlerinden biri (max. 72 saat) Yukarıdaki protokolü kullanarak gözlemlenen kültür kist olabilir. Ancak bu zaman çerçevesi yemekler kültür ortamının değiştirilmesi ile normal genişletilebilir olabilir. Biz diğer faktörler gibi genital sistem diğer dokulardan büyüme sinyalleri bir eksikliği olarak, kültürde hayatta etkileyebilir sonucuna varıldı. Öte yandan, öz değişmesine ait sonrası daha hızlı gelişimi Drosophila memelilerde daha uzundur. Drosophila, spermiogenesis yaklaşık 90 saat sürer ve HP anahtarı mayoz 9,12 sonra 50 ve 60 saat arasında gerçekleşir. Dolayısıyla, bu protokol ile elde etrafında 48 saatte normal sağkalım süresi müstakbel önemli gelişim süreçlerini takip etmek uygundurBöyle Mayotik bölümler veya HP anahtar olarak rmatogenesis. Bakteri veya mantar kontaminasyonu temiz araçları ve medyayı kullanarak önlenebilir olmasına rağmen, sunulan protokol sinekler nedeniyle kesinlikle steril çalışma koşulları faydalanmak ve standart koşullar altında geçirilen zaman testisler zaten bakteri barındırmaz uçmaz. Yine de, bu kültür tekniğinin bazı uygulamaları disseke sinekler yarar olabilir hatta (protokoller için, 17,36,37 bakınız) aseptik koşullarda kaldırdı.
Farmakolojik deneyler inhibitörleri veya aktivatörlerinin çeşitli enzimlerin işlevi gören kimyasal bileşiklerin kullanımına bağlıdır. Yaygın haliyle, deneylerde kullanılan bileşikler genellikle, hedef spesifikliği bakımından büyük farklılıklar vardır. Bir avantaj olarak, bu anakardik asit inhibe p300 / CBP, PCAF, ve şapkalar 38 MYST aile üyeleri ile, örneğin, bütün enzim sınıfları hedef potansiyel sunmaktadır. Bu olumsuz hedef dışı veya sitotoksik etkileri induc bir potansiyel olabilirBu tür bileşiklerin ederek hazırlanabilir. Bu nedenle, testis veya pupa kistli bir deneyde kullanılan her bileşiğin, sitotoksisite ve farklı konsantrasyonlarda özel etkiler için test edilmelidir. Buna ek olarak, kültür koşulları, bileşik konsantrasyonu veya aktivitesi, hücre geçirgenliği değişiklikler küçük farklılıklar bağlı etkilerin değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, her bir deney için tedavinin başarısını izlenmesi gereklidir. Biz 150 uM'de anakardik asit kullanıldığında histon H4 asetilasyonu sürekli azaldığı Örneğin, biz ile bazen testis olan kromatin kondensasyonu fenotipin kuvvetinde hafif bir değişkenlik gözlenmektedir.
Kültüründe Drosophila testisler ile farmakolojik deneyler spermatogenez 4,12,14,21 öncesi ve sonrası-mayoz mekanizmalarını analiz etmek için kullanılmıştır. Genetik araçları ile post-mayoz spermatogenez erişmek zor olduğundan Essentia ile oyuncu hedefl ön-mayoz ve mayoz fonksiyonları, bu ex vivo yaklaşım bir alternatif oluşturmaktadır. Ayrıca, ilke olarak, yöntem, zaman içinde tedavi edilen üreme hücrelerinin gelişimini izlemek kovalayıcı deneyler pulse uyarlanabilir. Ancak, henüz bu olasılığı test etmedim. Erken pupa testislerde Yapımı kullanımı farmakolojik testlerin bir avantajdır. İlk olarak, (24 saat APF civarında) genç pupa testislerin ince dış kılıf kimyasal bileşiklerin geliştirilmiş geçirgenlik izin verebilir. Post-mayoz HP anahtarını okuyan İkincisi, pupa testisler, HP anahtarı etkilenen veya yapılmadığının doğrudan okuma etkinleştirmek Protamine-GFP ifade sinek hattı 24 saat APF disseke.
Bugüne kadar, Drosophila organ ve testis ve germ-çizgisi kistler dahil olmak üzere dokuların ex vivo olarak kültivasyonu için çeşitli protokoller (örneğin, bkz 4,14,17,20,39,40) geliştirilmiştir. Yetiştirme ortamı ve kullanılan genel şartları1979 yılında kuruldu burada sunulan protokolünde 17. kültür sistemi, daha sonra yetişkin testis 4 izole sonrası geç-mayoz kistlerde bireyleşme mekanizmasının in vivo görüntüleme adapte edildi. Daha önce, bu koşulları da etrafında 48 saat 12 onların kist hayatta kalmayı ve mayoz ve erken post-mayoz germ hücrelerinin farklılaşmasını destekleyen bildirdi. Diğer kültür sistemlerine 19 aksine, bu kültürlerde gözlenen gelişim zamanlaması (ayrıntılar için, bakınız 12) sabit örneklerden belirlenir zamanlama ile hemen hemen sabit olmuştur. H2AvD-RFP ve protamin-GFP flöresan sinyalleri kültürde üreme hücrelerinin nükleer kromatin morfolojisi ve bileşim görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Biz kültürde gelişim aşamaları net bir şekilde belirlenmesi için, bu tür kistlerin kıvrılma gibi diğer kriterler üzerinde avantajlı olduğunu bulundu. Önemli olarak, uçucu Sunulan protokol ext ilavesini içermezfetal sığır serumu dışında ract ya da diğer büyüme faktörleri. Ayrıca, koşullar ex vivo kültür içinde öz değişmesine ait bölünme floresan mikroskobu görüntüleme ile uyumlu olduğunu gösteriyoruz. Çıkan uzun süreli gelişimini destekleyen bir kolay kullanımlı ortamda makul çözünürlük ile elde edilebilir. Bu Voltalef petrol 41,42 kısa vadeli (yaklaşık 3 saat) gözlemlerini sağlayan protokolleri tersidir.
Yetiştirme ve pupa testis ve tek erkek germ-line kistlerin farmakolojik tedavisi için, yukarıda anlatılan prosedürler Drosophila spermatogenezde araştırılabilir birçok genetik, epigenetik, biyolojik hücre veya gelişimsel sorulara kolayca uyarlanabilir. Bu germ-line kök hücreler üzerinde duruluyor özellikle araştırmalar içerir. Gösterilmiştir ki, kültürlenen yetişkin canlı görüntüleme ile takip edilebilir kök hücre gelişimi 20,43 testis gösterilmiştir. Bununla birlikte, testis olgun peristaltik hareketi kılıfh görüntü alımı ile müdahale. Bu yüzden, iki görüntüleme parçalanmış testisler 43 veya görüntüleme gerçekleştirilen deneylerin sayısı kayıp veri kümeleri 20 hesaba arttırılmalıdır kullanılarak yapılır. Erken pupa testisler (24 saat APF) henüz kas hücreleri ile kapalı değildir. Hatta biraz eski testisler (36-45 saat APF) birkaç peristaltik hareketleri göstermek (Şekil 3 ve Ek videoyu 1 karşılaştırmak) görünür. Bu nedenle, dokunulmamış organlar gibi genç pupa testislerin ekimi bir alternatif olarak hizmet verebilir.
Ayrıca, bir kez pupa testisler incelemek için yeteneği hakim ve sonunda izole germ-çizgisi kistler, küçük hücre popülasyonu olsa homojen bir kaynağı olarak tek bir kist kullanılarak daha fazla uygulamalar sağlar. Bugüne kadar görüldüğü gibi, örneğin, bir, spermatojenez, tanımlanmış aşamalarda spesifik genlerin transkripsiyonu düzenlediği analiz etmek için RT-qPCR gerçekleştirmek mümkün olmaktadır
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
- Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
- Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W.
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
- Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
- Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
- Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
- Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
- Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
- Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
- Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H.
- Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
- Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
- Rebollo, E., González, C. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. Henderson, D. S. , Humana Press. 77-87 (2004).
- Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
- Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
- Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , Wiley and Sons. 275-367 (1950).
- Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
- Ashburner, M., Roote, J., et al. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 585-599 (2000).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., et al. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. W, S. ullivan, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
- Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
- Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
- Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K.
- Demerec, M., Kaufmann, B. P. Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1996).
- Wang, W., Yoder, J. H.
- Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
- Meynadier, G. Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. Vago, C. 1, Academic Press. New York. (1971).
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
- Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).
