높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Summary

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

Abstract

점착성 포유 동물 조직 배양 세포 모델에서의 동작을 관장하는 제어 메커니즘을 이해의 발전은 단일 셀 형태의 분석에 점점 의존하게된다. 세포 집단에서 바이오 마커의 평균 값을 반영하는 복합 데이터를 전달하는 방법은 연구 생물학적 시스템의 이질성을 반영 하위 집단 역학을 잃고 위험이 있습니다. 이을 유지, 전통적인 접근 방법에 의해 대체되고있다, 또는 높은 콘텐츠 현미경에 의해 평가를 할 수 있도록 개발 된 세포 분석의,보다 정교한 형태의 지원. 이러한 분석은 잠재적으로 독점 소프트웨어 패키지와 함께 제공으로 활성화 형광 바이오 마커의 이미지의 큰 숫자를 생성, 셀 당 멀티 파라미터 측정이 가능합니다. 그러나, 상대적으로 높은 자본 비용과 이러한 장치의 많은 overspecialization 많은 연구자 자신의 접근성을 방지했다.

여기에 설명입니다대부분의 형광 현미경의 이미지와 함께 사용하기에 적합 개별 세포의 특정 세포 내 지역의 여러 형광 마커 강도의 정량화를위한​​ 보편적으로 적용 워크 플로우. 이 워크 플로의 핵심 형광 마커 강도를 이러한 이미지로 각 셀, 정의 세포 내 영역으로 세그먼트를 구분하고 제공하는 무료로 사용할 수있는 휴대 프로파일 러 소프트웨어 ^(1)의 구현은이 지역에 특정 값입니다. 이미지 데이터로부터 개별 셀 세기 값의 추출이 워크 플로우의 중앙 목적 및 인간 세포에 부착 G1 체크 포인트 레귤레이터 siRNA의 화면에서 제어 데이터의 분석을 예시한다. 그러나, 여기에 제시된 플로 셀 섭동의 다른 수단으로부터의 데이터의 분석에 적용될 수있다 (예를 들면, 복합 화면) 이와 같이 형광 계 세포 마커의 다른 형태와는 실험실의 다양한 유용 할 것이다.

Introduction

여기에 제시된 작품은 각각의 세포와 정의 세포 내 영역을 식별하기 위해 부착 세포의 형광 현미경 이미지의 알고리즘을 유도 분석을 수행하기 위해 무료로 사용할 수있는 소프트웨어 셀 프로파일 러를 사용하는 방법을 설명한다. 이미지 분할이라고도 이러한 접근 방식은, 각 셀 또는 (분절화 된 객체 라 함) 세포 내 영역에 국부적 인 형광 표지 된 마커를 정량함으로써 묘화 셀의 후속 멀티 파라미터 분석을 허용한다. 이 흐름은 높은 함량 분석을 가능하게하기위한 기초를 구성하고, 추가로 개발 된 멀티 파라 맞게 수정, 개별 셀은 특수 고 함량 악기 또는 독점 소프트웨어에 액세스하지 않고도 실험실에서 분석 할 수있는 도구의 역할을하도록 의도된다. 이 원고가 공급 설명한 파일을 생성하는 분석 관련 미가공 이미지 데이터, 알고리즘 설정 및지지 스크립트 테스트 세트를 포함한다. 제공된 알고리즘 설정 F또는 셀 프로파일 설정 예제 데이터 및 조정이 다른 연구에서 이미지 데이터의 사용을 활성화 할 필요가있다 어떤 토론 섹션 세부 사항에 최적화되어 있습니다.

정량적 데이터 셀 프로파일을 사용하여 추출되고 나면, 다른 실험실 원시 데이터의 개별 셀 값에 의해 제공된 정보를 사용하는 방법에 대해 다른 요건을 가질 수있다; 여기에 표시된 게이트는 각각의 분석에 대한 원시 데이터에 적용되는 하나의 방법입니다. 이러한 게이트 사용 데이터는 게이트에 의해 정의 된 응답을받은 세포의 개체군과 다른 처리를 연결 추세 시각화를 허용 응답 이진면으로 변환된다. 게이트는 각 관련 측정을 위해 적절한 음성 및 양성 컨트롤에 대한 얻은 데이터 분포의 관찰에 기초하여 설정된다. 게이트의 사용 원료, 셀 기반 측정을 관리하는 방법의 한 예이다. 또한 여기에 표시된 핵 DNA 강도의 사용이다 나게이트 데이터와 함께 값의 연속적인 범위로 자신의 원시 형태 asurements. 이미지 분석 데이터를 관리 할 수​​있는 다른 방법들이 연구의 특성에 따라 고려되어야한다; 소집단에 셀을 할당하는 게이트를 사용하는 대안 통계적 파라미터들의 많은 ^{수를 세보고되었다} 걸쳐 높은 컨텐츠 데이터를 요약하는 ^전략이 체계적인 비교를보고되었다.

^{6 -} 이미지 데이터의 고 함량의 분석은 약물 반응 세포 연구에도 사용되어왔다 유전학 ^{4 시그널링} 환경 스트레스 역방향. 고 함량 분석의 장점은 형광 현미경 데이터의 알고리즘 분석 및 정량 공간 파라미터가 개별 셀 ⁷ 걸쳐 동시에 고려 될 수 있다는 사실로부터 유래한다. 이러한 방식으로, 다수의 분석 결과는 셀룰러 분석-D의 상호 참조, 차동 동작 될 수있다efined 세포 개체군은 형태 학적 변수의 고려를 포함 할 수 있습니다 실험 조건과 분석에서 추적 할 수 있습니다. 전략 및 분석 워크 플로우는 다른 높은 콘텐츠 접근에 관해서는, 각각의 세포에 교차 참조 다중화 된 데이터를 제공 할 수있다, 여기에서 논의. 형광 현미경 이미지를 생성하고 이미지의 수천을 통해 처리량이 낮은 기존의 형광 기반의 현미경에서 생성 된 이미지의 수십에 이르기까지 데이터의 분석에 적용 할 수있는 높은 콘텐츠 방법 정장 연구 자동화 높은 콘텐츠 심사 플랫폼을 사용하여 제조.

흐름은 별도 분석법 핵 형광 표지 강도 또는 각각 형광 리포터 단백질의 핵 / 세포질 전좌, 하나의 관점에서 측정되는 예를 들어 데이터와 함께 여기에 설명된다. 흐름은이 분석법 별도로 또는 조합하여 고려 EAC에 따라 될 수 있다는 점에서 유연시간은 다른 연구자들에 의해 연구 문제를 주어진. 예를 들어 데이터는 RNA 간섭 (RNAi의) 실험 (도 1)의 일부로서 생성된다. 작은 간섭 RNA 올리고 뉴클레오티드 (siRNA의)는 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 활동의 두 형광 기자의 변경 사항이 발생할 HCT116 인간의 대장 암 세포에서 특정 단백질을 녹다운하는 데 사용됩니다. 세린 핵 망막 모세포종 단백질 780 (P-S780의 RB1)의 CDK6 의존성 인산화 항체 염색에 의해 평가된다. 동일한 셀에서, CDK2 활성 (GFP-CDK2 기자)의 녹색 형광 단백질 표지 된 리포터는 CDK2 활성의 부재하에 리포터가 세포질로 핵 및 CDK2 활성 셔틀에있는 세포질 비율 핵에 의해 평가되고 ^8. 또한, 각 셀의 DNA는 핵 DNA 인터 - 염료를 사용하여 염색하고, 이미지의 경계를 핵 세포를 식별하고 정의하기위한 수단을 구성한다 Bisbenzimide뿐만DNA 풍부 세포의 세포주기의 위치에 대한 정보를 제공한다 (그림 2)의 SA 측정.

CDK2 및 CDK6의 활성은 세포주기 ^(5)의 S G1 단계로의 세포 수송과 같은 검출 가능한 그러한 개별 셀 내의 두 기자 간의 일치도 확대가 예상되는 바와 같이, 서로 ^9,10 성공할. 여기서 사용되는 데이터 세트는 데모의 siRNA의 효과 CDK6, 망막 모세포종 단백질 (RB1) 및 비 - 타겟팅 음성 대조군 (표 1)을 대상으로 예로서 분석한다. CDK6의 녹다운 P-S780의 RB1 에피토프의 저하 및 세포주기의 G1 단계에서 세포의 축적을 유도한다 모두. RB1 녹다운는 포스 S780 항체의 특이성 시약 제어부로서 기능한다. 포르말린에서 형광 현미경 이미지는 형광 염색 HCT116 조직 배양 세포를 이미지 분석 알고리즘에 사용되는, ¹¹ 고정. 결과 숫자 데이터는 데 사용됩니다상호 참조 기자와는 다른 최저 상태의 영향을 측정.

이러한 유형의 분석에 의해 생성 된 데이터의 크기는 정상 전위 분석 도구에 도전을 제공 할 수있다. 예를 들어, 개별 데이터 셀은 스프레드 시트 소프트웨어 일부가 수용 할 수보다 클 수있다. 큰 데이터 세트의 분석을 돕기 위해 데이터의 단순, 높은 반복, 감독 처리를 수행 펄 스크립트가 포함되어 있습니다. 펄 스크립트는 특정 파일 명명 규칙 (도 3)와 함께 이미지 파일을 처리 할 때 셀 프로파일에 의해 생성되는 출력 파일에 대해 특별히 기록하고 분석에 사용되는 웰 당 분야의 가변 수 있도록되어있다. 그것은 세포 아 집단 ⁵ ​​동향을 추적 게이트 개별 세포 분석 데이터에 자주 중요하고 여기에 도시 각 분석 유형에 대해 소정 세트 게이트에 기초하여 각각의 셀은 플래그 펄 스크립트의 사용이다. 또한 포함 된 옵션 펄 스크립트는이는 개별 우물 (또는 조건)에 대한 데이터 결과를 요약, 제공 : 세트 게이트 내에서 세포와 원시 분석 점수의 평균 값의 비율입니다. 응답이 전부 또는 웰 내의 다수의 셀에 영향을주는 곳 시청 데이터를 후자보다 균질 방법은 유효하다. 전술 한 바와 같이, 이러한 평가는 응답이 모집단 내의 셀의 서브 세트로 한정되는 개별 셀 데이터 게이팅 의해 수득보다 덜 유용하다.

설명한 워크 플로우의 유틸리티 또는 siRNA에 기재된 마커 분석에 의해 섭동에 한정되지 않는다. 연구는 siRNA를 조합, 화학 억제제 및 방사선 치료를 사용하여 조직 배양 실험에서와 CDK6 이외의 마커와 CDK2 활동 ^(5)의 평가에 대한 응답을 분석하기 위해이 방법을 사용했다.

개념적으로, 실험적 전략은 생물학적으로 유용한 세포 내 영역의 다양한 자동으로 등록 할 수 있습니다형광 현미경 이미지에 존재하는 각각의 세포에. 이와 같이,이 접근 방법은 개체군보다는 개별 셀에 초점 기술을 통해 누락 될 수 정량, 다중화 데이터 드러내는 생체 정보를 얻을 수있다. 약간의 수정으로 기술 된 접근 및 분석 워크 플로우는 형광 기반의 분석 출력 및 세포 생물학적 반응에 대한 양적, 개별 셀의 데이터를 얻을 수있는 DNA 함량의 정량적 평가, 핵이나 세포질 형광의 정량 또는 이들 사이에 마커의 셔틀 링 두 구획 개별적으로 또는 다중화 방식은 흥미 롭다. 출판 요구 사항은 점점 더 게시 된 데이터를 재분석을 찾고 실험실에도 직접적인 관심이 될 것입니다 여기에 설명 된 것과 같은 공개적으로 접근 원시 데이터에 대한 액세스 및 현미경 이미지 분석을위한 무료 도구에 익숙 제출을 향해 경향이있다.

Protocol

응답 마커 1. 실험 섭동과 셀 라벨 (역 형질의 siRNA 화면)

1. 멸균 조직 문화 후드 피펫에서 멸균, 일반 96 웰 플레이트의 우물에서 1X siRNA를 버퍼에 200 nM의 siRNA를 70 μL. 무 혈청 DMEM 매체의 볼륨 (40)로 형질 전환 된 지질 희석시키고 각 웰에 siRNA를 함유하는 105 μl를 분배.
   참고 : 무 혈청 DMEM의 10.5 ml의에 262.5 μL 지질를 희석은 물론 당 지질의 2.6 μl를 제공, siRNA를의 전체 96 웰 플레이트에 적합한 마스터 믹스를 얻을 수 있습니다. 이 단계에서 200 nM의 siRNA를 시작 농도의 사용 단계 1.3에서 20 nm의 작업 농도를 제공 할 것입니다,하지만 절차는 적절하게 조정 시작 농도 (즉, 50 ㎚)로, 5 nm의 아래로 농도를 작업에 작동합니다. 그들에 응답하여 타겟의 크기를 감소시킬 수 있지만, 낮은 농도는 작동 온 타지 증가로 이어지는, 오프 - 타겟 스코어 위양성을 감소시킬 수있다위음성 율을 t.
2. 실온 전해조 부드럽게 진동 플레이트 섞는다. 세 50 μL로 결과 175 μl를 하위 분할은 투명 기재와, 96 웰 플레이트 처리 불투명, 조직 배양에 목표 PER 복제합니다.
3. 50 μL - 지질 복합체에 직접 siRNA를 10 % 혈청을 함유하는 150 μL의 DMEM에 웰 당 8,000 세포를 분배함으로써 역방향 트랜. 사용 HCT116 인간의 대장 암 세포를 안정적으로 CDK2 활동 ^5,8를보고 GFP 태그가 지정된 마커를 표현. 더 이상 혼합이 필요하지 않습니다. 습도를 제어하고 판 '에지 효과'를 방지하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO _2에서 가습 인큐베이터에 접시를 배치 멸균, 접착제 통기성 멤브레인 플레이트를 밀봉합니다.
4. 용지의 잔량이 적은 것을 웰에 남아 매체는 기음. 각 웰에 4 % 완충 포름 알데히드 100 ㎕를 첨가하여 세포를 고정시키고 실온 t에서 10 분 동안 흄 후드에서 부화칼 럼.
5. 접시를 흡입하여 고정 솔루션을 제거합니다. 어느 이때하는 플레이트를 한 다음 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS)로 세 번 세척하여 실험 중지는 주까지 4 ℃에서 어둠 속에서, PBS 100 ㎕ 하에서 밀봉 또는 진행 저장할 세포 투과성으로.
   참고 : 우리는 고정 후 가능한 빨리 처리 판을 추천, 일반적으로 완전히 처리 플레이트의 스토리지를 선호합니다. 예컨대 치메로살, 아 지드 화 나트륨, 또는 상업적 대안으로서 살충 보존제 micoroganismal 성장을 방지하기 위해 첨가 될 수있다. 포스파타제 억제제를 첨가 포스 에피토프를 유지하도록 돕고, 다른 수단에 관련된 분석 콘텍스트에서 유용 할 수있는 단백질의 변형 상태를 보존
6. 플레이트로부터 제거하고 PBS를 투과성으로 용액 100 ㎕를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 진탕없이 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. multich를 사용하여 투과성으로 솔루션을 기음annel 피펫. 이 단계를 세 번 반복합니다.
7. 실온에서 30 분 동안 웰 당 100 μL 블록 용액을 첨가하여 세포를 차단. 실온에서 어둠 속에서 2 시간 동안 차단 용액에 500 배 희석 안티 P-S780의 RB1 항체 50 μL와 프로브, 플레이트를 흡입하여 블록 용액을 제거한다.
8. 5 분마다의 접시에 솔루션을 떠나, 100 μL 판 세척 용액으로 판을 세 번 씻으십시오. 염색질 특정 DNA 염료 Bisbenzimide 2 μM 보충 블록 솔루션 50 μl의 형광 표지 된 이차 항체 희석 1,000 배와 4 ° C에서 밤새 어둠 속에서 접시를 프로브. 4 ° C에서 어둠 속에서 100 μl의 PBS에서, 이전에 저장 밀봉으로 판을 세 번 씻으십시오. 이미지 2 주 이내에 접시입니다.

2. 이미징 및 영상 분할

1. 별도 취할 20 배의 목적으로 공 초점 또는 회전하는 디스크 형광 현미경을 사용하여 16- 비트, DNA 염료, GFP 및 면역 염색 형광체에 해당하는 세 개의 채널에서 그레이 스케일 TIFF 이미지. 비 중첩 이미지 세트 많은, 잘 당 이미지, 프레임으로 여기에 약 1,000-2,000 세포를 언급 캡처합니다.
2. 각각의 파일 이름 '실험 이름', '잘 어드레스'의 순서로 '프레임 번호'및 '채널 식별자'(도 3)의 고유 한 조합이되도록 체계적 이미지 파일 이름. 예를 들어, 데이터 세트는 "블루"(염색질의 DNA 염색) 또는 "녹색"(GFP) 또는 "레드"채널 식별자로 (면역 염색 형광)을 사용합니다. 웰 주소, 프레임 번호 및 채널 식별자는 상기 이미지에 메타 데이터라고 칭한다. 혼란 잘 프레임 메타 데이터를 피하기 위해 밑줄 기호를 사용합니다.
3. 지정된 순서에 따라 메타 데이터 요소와 파일 이름을 지정합니다. 이는 후속 단계들은 소프트웨어 이리와! 빨리되도록하는 데 필요분석을위한 이미지 ctly 그룹 설정합니다.
4. 프리웨어 셀 프로파일을 다운로드하여 설치, 액티브 펄 커뮤니티 에디션, R 통계 프로그래밍 환경과 RStudio. 설치시 기본 옵션을 모두 수락; 액티브 펄을 설치 한 PC 사용자는 메시지 곳 PATH, 파일 확장자 협회 및 스크립트 매핑과 관련된 모든 옵션을 사용하도록 설정해야합니다. 액티브 펄은 Mac 사용자를위한 선택 사항이지만 그들은 그렇지 않으면 터미널 명령 줄에서 단계 3.2보다는 아이콘 클릭을 사용하여 Perl 스크립트를 실행해야합니다.
5. '파일' '파일'다음 '가져 오기 파이프 라인'을 클릭, 셀 프로파일 러 소프트웨어를 열고 파일 3_channels_pipeline.cppipe (그림 S1A 및 S1B)를 선택합니다. 이 파일은 설명 파일 이름 규칙에서 이미지 파일의 메타 데이터를 해석 할 수있는 소프트웨어에 필요한 지침이 포함되어 있습니다. 셀 프로파일 러는 이제 일에서 핵 DNA 항체 농도를 추출, 이미지에 관한양반과 각 셀에 대해 검출 (도 4 및 5) 세포질 강도 대 핵의 비율을 계산하는 GFP 채널을 사용한다.
6. 셀 프로파일 러 창의 왼쪽 아래 모서리에있는 버튼을 '보기 출력 설정'을 클릭합니다. 새로운 화면 상단의 '기본 입력 폴더'와 '기본 출력 폴더'라고 표시된 텍스트 상자입니다. 한번에 하나는,이 상자의 우측에 폴더 아이콘을 클릭하고 (S1C도)를 각각 추출 된 데이터에 대한 분석을위한 이미지 파일의 위치와 목적지를 선택한다.
7. 셀 프로파일 러의 왼쪽 하단 모서리에있는 '분석 이미지'버튼을 눌러 이미지 분석을 시작합니다. 화면 하단에있는 데이터 추출, 'STOP 분석'과 '일시 정지'버튼의 남은 시간을 관찰합니다. 필요한 경우에 유용합니다 언제든지에서 '일시 정지'버튼을 선택하여 분석을 일시 중지영상을 시청하는 것이 분석되는 경우 (단계 2.8 참조).
8. 선택적으로, 프로그램 창 (그림 S1D)의 맨 왼쪽에있는 패널에서 눈 아이콘을 클릭하여 이미지 분석 단계 중 하나의 창을 엽니 다. 셀 프로파일의 현재 설정은 이미지 분할이 적합한 수행 (이러한 설정 수정에 대한 조언을 그림 1 및 토론 참조) 확인하기 위해 'IdentifyPrimaryObjects'창 '차'와 '고등 객체'에 대한 사람들을 관찰한다.
9. 분석이 완료되면 메시지 상자가 나타나면 '확인'을 클릭합니다. 결과에 모든 데이터 파일이 쉼표로 구분 된 값 (.csv) 파일 (그림 S2A)로 저장되는 위치 '기본 출력 폴더'로 이동합니다.

3. 데이터 추출

1. 사이에 포함 된 새 파일 'Nuclei.csv'을 찾기셀 프로파일에서 출력. 이 파일은 형광 핵 항체 강도, 핵 DNA 강도와 GFP-CDK2 기자 비율 값 (도 6A 및 S2A)에 대한 개별 셀의 데이터가 포함되어 있습니다.
   주의 : 다른 실험실 분석 자신의 성질에 맞게 이러한 유형의 데이터를 처리 할 것이다. 항체 제공된 데이터 및 펄 스크립트 '2_gate_classifier.pl'를 이용하여 GFP-CDK2 리포터 값에 따라 각각의 처리 조건에서 세포의 게이팅은 현재 제안 된 데이터이다.
2. 'Nuclei.csv'데이터 파일 (그림 S2A)와 동일한 폴더에 제공 Perl 스크립트 파일 '2_gate_classifier.pl'를 복사합니다. 두 번 클릭하여 Perl 스크립트의 아이콘과 메시지가 표시되면, 세포가 항체 마지막으로 게이트 값 게이트 및 작성할 수있는 파일의 '.CSV'파일 이름 이름 다음에 데이터 파일의 전체 이름을 입력형광 및 GFP-CDK2 기자 데이터.
   참고 : 주로 게이트 설정을 확인하고 데이터의 분석을 위해 이러한를 적용하는 방법이 대표적인 데이터 섹션 및 그림 6에 아래에 설명되어 있습니다 (데이터 제공 사용 '0.004'각각 '1.5', 분석). Mac 사용자가 입력하여 터미널 명령 행에서 Perl 스크립트를 실행해야합니다 : '펄 2_gate_classifier.pl을'.
3. 각 웰에서 각 셀은 모두 게이트 (그림 6C)에 대해 수행하는 방법을 보여 하위 집단 레이블 원래 셀 프로파일 데이터로부터 원료 개별 셀의 분석 값을 결합하여 새로 생성 된 파일을 확인하십시오.
4. RStudio 소프트웨어를 개방함으로써 개별 셀 모집단 라벨을 사용하여 각 실험 조건에 대한 데이터를 그린다. '파일'과 '파일 열기'를 클릭 한 후 제공 'analysis.r'파일을 선택합니다. 도 6B 음모 명령을 관찰, (도 S2B)의 상부 좌측 창 trong> (7, 8). 왼쪽 창에서, 선, 5, 6에 큰 따옴표 기호 사이에, 게이트 데이터를 포함하는 폴더의 컴퓨터 주소를 입력합니다. ( "/ 분석 폴더 / 분석 출력 C"와 "nuclei_gated.csv"예를 들어,) 드라이브 문자와 각각 파일 자체의 이름을 포함합니다.
   주 : RStudio 주어진 컴퓨터를 처음 사용하는 경우, R 그래픽 패키지 'ggplot2'이 처음 설치 될 필요가있을 것이다. 이는이 단계가 중복이되는 후 RStudio의 새 설치에 대해 한 번만 단계입니다. 'ggplot2'를 설치하려면, RStudio의 오른쪽 하단 모서리에있는 창 위의 '패키지'라는 탭을 클릭이 아래에 나타납니다 '패키지 설치'버튼을 클릭합니다. 새 창이 나타납니다. '패키지의 타입으로'ggplot2 '(생략 인용)이 새 창에서 속도와 마지막 단계 3.6에서 계속 창을 닫으 필요한 ggplot2 기능을 설치하고 주 RStudio 창으로 돌아갑니다 '설치'버튼을 클릭합니다.
5. RStudio의 왼쪽 창에서 17을 통해 강조 라인 한 후 '실행'버튼을 클릭합니다. 이 R (그림 S2C)에 실험 데이터, 임계 값과 잘 위치 세부 정보를 입력 할 수 있습니다. R 지금은 일시적으로 플로팅 관련 데이터를 개최한다.
6. 라인 (17) 아래에있는 나머지 코드의 각각의 블록을 선택하고 이전과 '실행'버튼을 클릭하여 해당 플롯을 만들 수 있습니다. RStudio의 오른쪽 하단 모서리에있는 창에 플롯을 관찰하고 '내보내기'버튼 (그림 S2D)을 클릭하여 형식의 수를 저장합니다.
7. RStudio을 닫는 동안 메시지가 표시되면 '저장 안함'을 클릭합니다. 이것은 그렇지 않으면 데이터를 개최한다 RStudio의 다음 사용에 혼란을 방지이전 세션에서.

Representative Results

이미지 집합 예에 대비 한 역 형질 siRNA를 선별 프로토콜을 사용하여 생성 및 세포 프로파일 러 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 결과 수치 원시 데이터는 모든 세포가 개별적으로 추적 다시 이미지에 잘 원산지, 표시 및 여러 형광 강도 매개 변수 (그림 6A)에 대해 측정되도록한다. P-S780의 RB1 항체 및 DNA의 핵 염색 정의 통합 마스크에 DNA 강도 핵에 대한 평균 형광 강도를 식별 된 각각의 셀에 대해 결정된다. 각 세포의 핵 및 세포질 영역에 대해 GFP 세기 값 평균은 또한 GFP 리포터-CDK2의 핵 대 세포질 형광의 계산을 가능하게 기록된다. 이들 알고리즘 형광 세기 측정 사용의 하류 두 분석법, 핵 항체 염색 및 CDK2-GFP 리포터위한 게이트를 정의하기 위해 이러한 개별 셀 데이터로 이루어진다. 일에 세포의 후속 주석분석 결과 특정 소집단을 사용하려면 다음 라벨 사용의 전자 기준은 더 설명 세 번째 측정 (핵 DNA 함량)을 특징으로한다.

각각의 분석을 위해 수집 된 원시 형광 강도 데이터 히스토그램 플롯 세포 아 집단이 상이한 조건 하에서 동작 방식을 평가하는 효과적인 방법이다. 그림 6의 (b)에 막대 그래프는 각 RNAi의 최저 조건에 대한 세중의 우물에서 개별 셀 데이터의 인구 분포를 보여줍니다. 왼쪽에있는 핵 항체 강도 및 오른쪽에있는 데이터는 GFP-CDK2 기자에 해당하는 데이터가되어 있습니다. P-S780 RB1 항체 데이터는 세포가 광범위 이러한 번역 후 변형과 관련 및 S780에서 인산화 RB1의 손실이 세포 집단으로 두 집단에 존재하는 풍부한 핵 강도의 좌측 피크로 구분 될 수 있음을 보여준다 CDK6는 siRNA에 의해 무너 뜨렸다 때. 이 같은 왼쪽 피크RB1 자체가 단백질하여 P-S780의 RB1 염색의 철저한 제거를 반영, RNAi의 대상이되는 경우에 볼 수 있습니다. 대조적으로, 동일한 셀의 동일한 실험 조건은, GFP 리포터-CDK2 분석을 통하여 관찰 한 경우, 개별 데이터 셀에서 다른 동적를 나타낸다. 연속 분포는 오직 하나의 피크가 관찰되지만, 세포주기 (siCDK6)을 방해하고 (즉, 분포의 우측 어깨의 확장에서 G1 단계 결과의 축적을 일으키는 siRNA의 예를 나타내는 세포의 향상된 존재를 나타내는 핵 / 세포질 비율 GFP의 증가) X 축에 표시.

도 6b의 히스토그램 분석 두 세트의 데이터의 분포에 기초하여 선택된다 게이트 값 (수직 바)이다에서도 도시. 최대 폭 위치의 메인 왼쪽 어깨에 : P-S780 RB1 항체 데이터에 사용되는 규칙은 절반 높이로서 게이트 위치를 정의하는 것음성 대조군 세포의 데이터를 고려할 때 (오른쪽) 피크 (siRNA의 비 표적). 데이터는 빨간색이 게이트로 식별됩니다 감소 및 결석 P-S780의 RB1와 세포이다 강조했다. 비율 값 분포의 어깨에 위치하는 대향 유사한 게이트 CDK2-GFP 리포터 사용된다. 부족 또는 기능 감소 CDK2 활동 결과 높은 비율 모집단 세포는 녹색으로 표시됩니다. 두 다중화 분석법 분석을 설명하기 위해도 6c는 아래 주석 파일에 원시 데이터 (도 6A)를 변환 2_gate_classifier.pl 펄 스크립트를 사용하여 두 게이트 값의 구현을 보여준다. 이 새로운 파일 (각각 사용 하였다 항체 데이터 0.004 GFP-CDK2 리포터 1.5이 경우 게이트에서) 각 셀에 대한 클래스 라벨의 새로운 칼럼과 구별하기 위해 사용되는 2 개의 게이트 값과 함께 원래의 데이터를 포함 .

f는 각각의 세포를 분류 데ROM은 분석 데이터의 플롯의 주석을 돕기 위해 이러한 클래스 라벨을 사용하는 것이 가능해 두 분석에 기초하여 각각의 최저 조건.도 7은 P-S780 RB1 및 GFP-위한 개별 셀 데이터의 플롯을 산란 도표 RNAi의 세 조건을 설정 데이터로부터 예 CDK2 분석. 산점도 사분면에 주석 번호는 최저 문맥 전체에 각 게이트 된 모집단의 상대적인 비율을 표시하고 상기 클래스 라벨을 사용하여 R 생성된다. 이러한 플롯의 siRNA (도 7B)은, siCDK6 형질 세포 그물 데이터 분배를 공개 비 - 타겟팅 형질 감염된 세포에 비해 (세린 780에서 RB1 인산화의 부재를 나타냄) 및 우측에 Y 축상의 하향 모두 시프트 밝히지 X 축에 (도 7C, 낮은 CDK2 활성을 나타냄). 이러한 변화는 모두이 목표의 최저 예상된다. SIR에서 이것에 대하여, 데이터B1 형질 감염된 세포 GFP에 더 큰 영향을 제안하지 siRNA의 비 표적 형질 대조군과 비교 CDK2 리포터위한 데이터 분포 (도 7A) 에피토프의 손실과 조화 항체 염색의 손실을 보여 주지만, 거의 영향 -CDK2 기자 RB1 최저에서 발생한다.

또한 개별 셀 데이터, 하위 집단의 분류 ​​및 분석 다중 그림 8의 사용을 탐구하는 것은 통합 된 DNA 강도 그림 7 (c)와 함께 짝을 히스토그램 프로필에서 siCDK6 데이터에 대한 산포도를 보여줍니다. 히스토그램 쌍 항체 강도 (산점도 오른쪽)-CDK2 또는 GFP 리포터 비율 값 (산점도 위)의 어느 하나에 기초하여 나누어 전체 인구의 대향하는 반쪽에 관한 것이다. 이러한 인구 핵 DNA 강도의 정량화는 각각 왼쪽과 오른쪽 봉우리로 2N와 4N DNA 내용의 특성이 피크를 보여줍니다. 내가도에 도시 된 게이트 ntentions 6, 7 및 8 세포 P-S780 RB1 위해 낮은 식별되도록 설정된다 (표지 : P-S780-) 또는 GFP-CDK2 리포터에서 높은 비율 값 (표지 : G1) 것 세포주기의 G1 단계에서있을. 사실, 이러한 분석 중 하나를 사용하여 확인 된 하위 집단에 대한 DNA 프로파일 히스토그램은 주로 2N DNA 컨텐츠와 세포가 포함되어 있습니다. 반대로 게이트 인구의 DNA 프로파일 (레이블 : P-S780 + 또는 비 G1) 2N에서 4N에 이르기까지 분포와 세포를 포함, 이러한 세포는 세포주기의 범위를 채용과 유지에 포스트-G1 단계를 배치합니다.

여기서 포커스는 생성 및 형광 염색 이미지에서 개별 셀 데이터의 분석 하였지만,이 복제하고 성능 간의 변동을 모니터링하기 위해 이러한 데이터를 가지고 잘 바이 웰 기초 각 분석을 요약 할 수있는 유용 데이터의 전체 판에 걸쳐 주어진 모든 분석 웰. 데이터) P-S780의 RB1 데이터 및 B) GFP-CDK2 리포터 데이터를 나타낸다. A와 B에 그려진 값은이 원고와 함께 제공된 두 개의 추가 Perl 스크립트에 의해 생성된다; 각각 'antibody_fluorescence_summary.pl'와 'G1assay_summary.pl'. 이러한 스크립트는 웰) I로 당 측정 총 세포를 웰당 원시 세포 프로파일 (Nuclei.csv)에 의해 생성 된 데이터 및 보고서 데이터를 사용하여, ii) 상기 게이트 내의 세포 수, ⅲ) 게이트 내의 퍼센트 세포 및 IV) 산수 물론 그에 대한 측정, 원시 데이터를 의미한다. 에 도시 된 바와 같이이 분석에서 대량의 데이터 세트에 걸쳐보고 적합한 옵션, 종래 개별 셀 데이터의 다중화를 사용하여 각각의 평가 처리에 초점 데이터에 포함되어 8에 도시한다. 차트는 그림 6B에서 히스토그램의 P-S780 RB1 및 GFP-CDK2 데이터를 볼 수있는 비 일반적인 데이터 분포에 맞게 모두 분석에 대한 '게이트 내 III) %의 세포를'여기 플롯을 표시. 이 스크립트는 또한 계산 'IV)이 아니라에 대한 측정, 원시 데이터의 산술 평균'균질 인구 반응과 전 실험 섭동 후 일반 데이터 분배를위한 데이터의 분석에 맞게 것이다.

도 1 :. 정량적 현미경 형광 표지 된 화상 데이터를 분석하는 작업 흐름에서의 단계의 개요는 워크 플로우의 네 단계로 여기에 표시된다 (A) 첫 번째 실험으로부터 형광 이미징 세포를 준비하는 것이 필요하다.. 여기에 설명 된 예는의를입니다siRNA를 처리 한 접착 인간 종양 세포를 96- 웰 조직 배양 접시에 48 시간 동안 고정하고 염색 성장하는 화면. RNAi의 다른 조건은 별도로 플레이트 내의 웰에 삼중으로 존재한다. 세포는 DNA 염료, CDK4에 인산화 RB1 6 선택적 대상 사이트 세린-780 (P-S780의 RB1)에 대한 특이적인 항체로 염색하고도 안정적으로 G1 세포주기 출구를보고, GFP-CDK2-기자를 표현하고 있습니다. 이를 모두 형광 프로브는 두 분석 별도로 흐름 내에 치료를 구성하고있다. (B) 각각의 형광 프로브 (채널)에 대한 병렬 현미경 이미지를 생성하고 이미지 분석 소프트웨어는 데이터를 구성 할 수있는 내용을 포함하도록 이러한 명명한다. (C) 이미지 파일은 세 가지 알고리즘 형광 프로브는 검출을위한 세기 측정을 수득하기 전에 개개의 세포 및 핵의 관련된 쌍을 식별하는 세포질 세포 프로파일 소프트웨어에로드각 ED. (D)는 마지막으로, 펄 스크립트 제조 원료 정량 데이터를 구성하는데 사용된다. 이 단계는 효과적으로 추적 및 교차 조사, 플롯 할 수 있습니다 소집단으로 세포를, 비닝, 각 셀의 형광 강도 데이터에 게이트를 적용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2 : 실험 데이터는 화상 해석에 의해 수득되는 고정 siRNA를 처리, 형광 표지 된 세포를 이미지화 및 대응하는 세기 측정 셀당 찍은 설정 데이터로부터 예.. 대표 화상 데이터를 화상 해석 기록 중에 각 매개 변수에 대해 나타낸다 (A) 핵 DNA 강도 :. 핵 DNA 염료의 염색 강도로 사용되는 핵 당 DNA의 측정치를 수득 하였다 (B) 포스 RB1의 핵 강도 :. 면역 염색 차 (블랙) 항체를 이용하여 형광 이차 항체 (적색) 태그에 RB1 인산화의 강도 측정을 가능 P-S780의 RB1 특정 . 핵 당 S780 (C) CDK2-GFP 리포터 : 안정적으로 세포주기와 세트 패턴 핵과 세포질 사이 옭 GFP 표지 된 리포터 단백질을 발현 세포를 사용. 각 셀에 대한 한 쌍의 핵 및 세포질 GFP 듀얼 강도 측정은 세포주기의 G1 단계에서 나머지를 구별하는 데 사용할 수있는 셀당 비율의 계산을 허용한다. 세 가지의 siRNA는 표적 분석을 설명하기 위해 사용된다; 음성 대조군 siRNA의 비 표적; RB1 인산화 및 세포주기 진행을 교란에서 양성 대조군으로 CDK6의 siRNA; RB1의 siRNA는 항체 특이성을 설정합니다.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 : 조직 이미지의 이미지 분석에 앞서 파일 조직 배양 접시에서 촬영 화상을 화상 해석 소프트웨어가 다시 원래의 실험 문맥 화상 데이터를 연관시키는 허용하기 위해 체계적으로 명명된다.. 이 정보는 각 화상의 파일명 내에서 배치된다. (A) 웰 실험 접시에 각 같이 다른 RNAi의 대상 또는 치료, 파일명의 웰 어드레스 일부를 형성에 대응할 수있다. (B) 프레임 번호가 파일명의 일부 . 각 웰 여러 개의 비 중첩 프레임 (C)를 ​​수집하기 위해 이미징 때 각 프레임에서 형광 프로브는 별도로 이미지를 만들; 결과적으로 파일 이름은 각 이미지에 관한 어떤 채널을 반영 할 필요가있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 :. 세포 프로파일을 사용하여 핵 DNA 및 항체 염색을 측정하도록 제공되는 파이프 라인 파일의 설정 (3_channels_pipeline.cppipe), 핵 DNA 및 대 세포 프로파일 이미지 분석 소프트웨어 측정 형광 강도 값과 각각의 세포에 관한 항체 - 결합 . (A) 핵 스테인드 DNA의 '블루'채널 이미지에서 확인된다. (B)를 < / strong>을 DNA 염색 핵의 위치는 임시로 '핵 마스크'에서 개최된다. 핵 마스크는 다음 (C) 마스크와 중복 이미지 세그먼트에서 파란색과 빨간색 채널 이미지 (각각 DNA 항체 형광 데이터) 및 형광 값이 식별 된 각 셀에 대해 기록을 입혔다된다. 별도로, 인접 핵의 성공적인 식별을 육안 핵 마스크의 모양에 평가 될 수있다. 설명을 위해,이 마스크 이미지의 원으로 도시 된 알고리즘에 대한 선택 설정을 하나의 핵으로서 잘못 식별 된 인접 핵이 예이다. 토론 섹션에서 소개되는 이러한 이벤트를 최소화하기 위해 알고리즘 설정을 조정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
도 5를 사용하여 세포의 프로파일은 세포질 및 핵 GFP 강도를 측정하는 GFP-CDK2 태그 기자 세포의 세포주기 위치 관련 핵과 세포질 사이 옭.. 셀 프로필러 셀당 DNA 항체 핵 강도를 계산하는 동시에 (도 4)에서, 또한 각 셀에 대한 GFP 강도의 세포질 비율 핵을 계산한다. (A)가 각 화상 DNA 염료 데이터가 생성하는 데 사용되는 핵 마스크. (B) 셀 프로필러 핵 각 셀의 위치를 시드 GFP-CDK2 리포터에서 GFP 이미지와 함께 마스크를 사용하고, 각 셀의 전체 면적을 추정하기 위해 각 셀의 경계를 확장한다. 이것은 핵 마스크 셀 마스크로부터 감산되어 새로운 '셀 마스크'. (C)이되고 세포질의 도넛 형상 시리즈 외곽선을 수득된다'세포질 마스크'. (D) 핵 마스크와 세포질 마스크는 핵 및 세포질 GFP 값의 쌍을 측정하는 셀 프로파일에 의해 사용됩니다. 이 한 쌍의 값은 다음 세포주기의 각 셀의 위치에 대해 알려 비율을 계산하는 셀 프로파일에 의해 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 :. 데이터 추출 - 분석 값에 게이트를 부과함으로써 원료 개별 셀 데이터를 처리 항체 염색 및 GFP-CDK2 기자 분석에 대한 개별 셀 데이터에서 생물학적 경향은 추출 된 문이 데이터를 사용하고 있습니다. 원시 데이터의 히스토그램은 적절한 게이트 값을 식별 할 수 있습니다. 이것들은 펄 스크립트로 부과됩니다. (A)셀 프로파일에 대한 제공 설정으로 이미지 파일을 분석하는 최종 제품은 쉼표로 구분 된 값 (.csv) 파일입니다. 다른 세포 이하 세그먼트의 각각에 관한 개별 셀 데이터 ontain 이러한 파일의 C. 파일 'Nuclei.csv는'핵 마스크의 사용과 관련된 모든 선택한 측정을 포함하고 있습니다. 이러한 측정은 핵 항체 강도, 핵 DNA 강도 및 GFP 비 (핵 / 세포질)을 포함한다. 핵 항체 강도 (왼쪽) 및 GFP-CDK2 리포터 비 (우측) 각각의 siRNA 녹다운 조건 개별 셀 데이터로부터 플롯의 (B) 히스토그램 . 표시된 막대 그래프의 막대는 이러한 분석에 대해 원하는 게이트 위치를 보여줍니다. 히스토그램에 컬러 데이터는 게이트 부분 집단을 나타냅니다. (C)를 ​​B에 도시 된 두 개의 분석을위한 게이트는 펄 스크립트 '2_gate_classifier.pl'를 사용하여 원시 데이터에 적용됩니다. 스크립트이후 플로팅을 지원하기 위해 원래의 셀 프로파일 출력 (Nuclei.csv) 파일의 수정 된 복사본을 만듭니다. 2 개의 게이트 새로운 값 (여기서는 색으로 강조) 파일 '새로운 레이블'항목이 추가 기록된다. 라벨 빈 셀마다 두 게이트 된 분석 값에 기초하여 네 개의 가능한 서브 그룹 중 하나에 각각의 셀. 이 레이블은 각 하위 집단뿐만 아니라 셀 프로파일 생성 추가 매개 변수의 상호 참조의 기여의 계산 기능이 이후의 플롯에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7 :. 각각의 세포 및 게이트 위치에 대한 원시 데이터를 묘사 각각의 siRNA 조건에 대한 산포도 INDIVI의 플롯을 분산 형siRNA의 조건에서 사진 이중 셀이 표시 데이터 : (A) siRB1 (B) 시논 타겟팅 음성 대조군 (C) siCDK6. 안티 P-S780의 RB1 염색에서 핵의 형광 값은 Y 축에 대해 플롯 된. X 축에 대해 도시는 CDK2-GFP 리포터로부터 산출 해당 비율 값이다. 빨간색과 녹색 막대는 각각 P-S780의 RB1 게이트의 게이트 및 GFP-CDK2 기자 게이트의 위치를​​ 나타냅니다. 2 개의 게이트 네 소집단으로 셀을 분할하여 얻어진 사분면 위에 숫자는 이들 각각의 세포의 수 퍼센트이다. A의 축 주위에 주석 2_gate_classifier.pl Perl 스크립트에 의해 각 셀에 적용되는 네 가지 라벨 요소를 나타냅니다. 이 레이블은 해당 분석 게이트에 관련하여 도시되고도 6,도 7의 그래프를 생성하기 위해 R-스크립트 (analysis.r)에서 사용되며 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8 : 두 G1 교통 분석에 의해 정의 된 세포 개체군은 분석 결과와 유지에 2N와 4N DNA 프로파일을 보여 siCDK6 세포에 대한 데이터의 산점도는 그림 7 (c)에서 반복된다.. 산포도 주변 인구의 부분 집합에 관한 통합 된 핵 DNA 강도에 대한 히스토그램이다. 산점도 위의 사람들은 GFP-CDK2 기자 분석에 관한 것이다. 산점도 오른쪽 이들은 단독 핵 포스 RB1 항체 측정에 관한 것이다. 게이트 라인 컬러 히스토그램은 그들의 관계를 나타 내기 위해 확장된다. 셀 데이터는 이러한 추가 플롯 선정 된 게이트에 의해 라벨은 또한 도시. (낮은 CDK2 활성을 나타내는) 세린 780 (P-S780-) 또는 세포질 비율이 높은 GFP-CDK2 기자 핵을 가진 사람들에 인산화 RB1의 손실 세포는 각각의 분석에 대한 자신의 반대 대응하는 반면, 주로 2N 같은 DNA 프로필을 보여 2N와 4N, 세포의 혼합, 포스트-G1 상 인구의 특성의 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9 :. 게이트 (A) P-S780의 RB1 데이터와 각 siRNA의 최저 조건에 대한 세중의 우물에서 (B) GFP-CDK2 데이터의 각 siRNA의 조건 요약 데이터 그림에 대한 문 분석 값의 요약 플롯. 값은을 사용하여 원시 세포 프로파일 출력 (Nuclei.csv)으로부터 계산되었습니다펄 스크립트 'antibody_fluorescence_summary.pl'(A) 또는 'G1assay_summary.pl'(B). 플롯 값은 각 분석에인가되는 게이트 내의 세포의 백분율 수단이다. 바 세중 우물에서 계산 된 표준 오차를 나타냅니다. P <0.001 (**) 및 P <0.05 (*)는. 어디 siRNA를 비 대상과 비교하여 각각의 최저 조건에서 페어, homoscedastic T 테스트 P 값은 플롯 데이터 위에 표시됩니다 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 그림.

그림 S1. 이미지 분석을위한 세포 프로파일 러 소프트웨어를 설정. 셀 프로파일의 (A) 스크린은 모든 이미지 분석 설정이 입력되기 전에. (B) 스크린 샷 셀 프로파일의 '3_channels_pipeline.cppipe'에 포함 된 알고리즘 세부 사항은로드 된 후. 고 왼쪽 상단 모서리에 조명 탭이 화면이 분석의 'LoadImages'단계에 대한 매개 변수를 보여줍니다 있음을 나타냅니다. 이 아래 목록의 다른 부분을 클릭하면 분석의 다음 단계에 대한 세부 사항을 발표 할 예정이다. 입력 폴더 및 폴더 입력 출력에 대한 세부 셀 프로파일의 (C) 스크린 샷. (D) 셀 프로파일 러의 스크린 샷 후 '분석 이미지 '버튼 분석을 시작을 클릭하고있다. 분석중인 이미지에서 소프트웨어에 의해 생성 알고리즘 생산 마스크를 나타내는 세 개의 새 창 겹쳐있다. 이 창 주 셀 프로파일 러 창의 왼쪽 상단에 옆 분석 관련 단계에 열린 위치로 '눈'아이콘을 클릭하여 액세스 할 수 있습니다. 이러한 뷰는 색종이 색 마스크를 생성하는 설정이 첨부 된 원본, 그레이 스케일 데이터에 동의하는지 여부를 사용자가 확인하는 데 도움이됩니다.

ENT "> 게이트 개별 셀 데이터에 펄과 RStudio의 그림 S2. 사용 및 플롯 결과 세포 개체군은. (A)는 오른쪽 패널 셀 프로파일 분석을 출력 .CSV 파일 (녹색 아이콘)를 수신하기 위해 선택 폴더를 보여줍니다. 원고 (파란색 아이콘)와 함께 제공되는 Perl 스크립트는이 폴더에 복사됩니다. 강조 더블 클릭 왼쪽 패널에있는 대화 상자를 생산하는 마우스와 함께왔다 '2_gate_classifier.pl'펄 스크립트입니다. 표시됨이다 바로 'analysis.R'스크립트를로드 한 후 RStudio의 게이트 'Nuclei.csv'파일에서 개별 셀 데이터에 필요한 프롬프트 및 입력에 대응 답. (B) 스크린 샷. 강조는로에서 문이 데이터를 업로드 할 수있는 명령입니다 이전에 선 5와 6의 노트 세부 사항 (플로팅에 소프트웨어 게이트 된 데이터가 계산에서의 위치에 따라 조정해야합니다분석에 사용 r)이. (RStudio의 C) 스크린 샷 데이터가 업로드 된 후에는. (RStudio 게재의 D) 스크린 샷은 오른쪽 창에 표시된 그래프를 생성하는 데 필요한 코드의 블록을 강조했다. 각각의 플롯에 대한 코드는 빈 줄로 구분 플롯의 유형으로 분류된다.

siRNA의 대상	플레이트 웰 주소
비 타겟팅 (NT)	E5, F5, G5
망막 모세포종 (RB)	E7, F7, G7
사이클린 의존성 키나제 6 (CDK6)	B2, C2, D2

표 1 : 음 주소 및 설정 예 데이터에 사용 된 siRNA 대응하는 조건.

Discussion

설명한 워크 플로우의 siRNA, 후속 마커 검출을 통해 세포의 멀티 웰 동요하는 절차를 구성하고, 최종적으로 얻어진 형광 현미경 이미지에서 정량적 데이터의 추출을 용이하게하기 위해 소프트웨어를 지원하는 일련의 단계의 사용. 접근 방식은 많은 셀 기반 응용 프로그램의 광범위한 실용적인 응용 프로그램을 가지고 각각의 세포 핵 및 세포질 강도 값의 전달에 초점을 맞추고 있습니다. 여기에 사용되는 예시적인 데이터는 G1 단계에서 세포주기 통과 두 형광 분석법을 시험하고 다시 핵 DNA 함량의 직접적인 상관 관계를 측정하기 위해 생물 물리학 된 siRNA의 설정 화면이 생성 되었음.

그것은 개별 셀을 식별 할 수있게하고, 생성 된 '핵 마스크'대응 cytoplasmi를 식별 할 시작점 역할로서 화상 핵 DNA에 형광 DNA 얼룩의 사용은 이미지 분할 과정에서 필수적인 단계이다C 지역. 안정적으로 세포에서 발현되는 GFP-CDK2 태그 기자, 아직이 구획 묘사 될 수있는 세포질 배경 신호보다 일관되게 더 높은 변수를 제공한다. 동일한 분석 파이프 라인은 다른 적합한 형광 결합 기자 동요 그들의 응답을 이용하여 단백질 전좌 이벤트의 분석에 적용 할 수 있어야한다. 또한, 세포질 특정 형광 염료로 GFP 리포터-CDK2 치환하면이 알고리즘의 대안적인 사용은 세포질의 치수와 이미지의 상대적인 세포의 크기를 측정 할 수있는 것이다.

여기에 설명 된 영상 분할 전략 디자인의 또 다른 고려 사항은 DNA 정량화 통합 강도 값들을 제공하는 셀 프로파일의 사용이다. 강도의 통합 염색 데이터가 핵의 크기는 가능한 변화를 허용 핵 DNA에 대한 값 및 본 정량 프로파일 근접한을 나타냅니다대한 프로피 디움 요오드 스테인드 FACS 데이터. 그러나, 통합 강도는 항원 형광의 평균 강도로 예시 평균 농도가 더 생물학적 세포 구획 내 단백질 (및 관련 형광)의 집적 총량보다 중요한 곳 단백질 기능을 평가하는 적절한 수단을 제공하지 않을 수있다. 따라서 강도 값이 P-S780 RB1 및 GFP 데이터에 사용 된 것을 의미한다. 이 옵션은 셀 프로파일 러 소프트웨어의 'ExportToSpreadsheet'패널에서 발견되는 두 가지 모드 (평균 또는 통합) 데이터 평가의 사이에 변경합니다.

3_channels_pipeline.cppipe 파일 분석 설정은 예를 들어 데이터 세트의 이미지에 대해 최적화된다. 이 프로토콜을 사용하여 새 이미지 세트의 분석은 파일 이름이 명명 규칙은 위의 (그림 3) 기술 채택 할 것을 요구합니다. 또한, 감도는 배경에 대한 핵 DNA 염색 및 임계 값의 밝기에 맞게 값새 이미지 세트의 강도가 셀 프로파일 설정에서 조정해야 할 수도 있습니다. DNA 염색은 다양한 이미지 분할 마스크를 구축하기위한 보유 중요한 역할을 감안할 때,이 채널에 대한 정확한 감도 설정의인가는 셀 프로파일 소프트웨어와 새로운 영상 데이터의 성공적인 분석에 중요하다. 제공되는 셀 프로파일 설정 파일 (3_channels_pipeline.cppipe)는 새로운 데이터에 대한 분석을 적응에 가장 자주 유용한 매개 변수에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이 노트는 셀 프로파일 메인 윈도우 화면 상단의 텍스트 박스에 있고 민감도 설정을 변경하고 채널 수가 분석 될 조정에 대한 지침을 포함한다. 새로운 이미지 데이터에 대한 설정을 테스트하는 프로토콜의 2.8 절에 기소로 (그림 S1D '... 확인 된 개체'의 각각에 대해 '눈'아이콘을 열고 클릭하여 프로토콜 단계를 이미지 분석시 이미지 분할을 관찰 할 필요가있다

셀 프로파일에서 개별 셀 데이터의 출력은 원시 다른 연구의 요구에 맞는 다양한 방식으로 분석 될 수있다. 여기에 도시 한 데이터로부터 생물학적 경향을 추출 돕기 위해 셀에 따라 측정 파라미터의 2 개에 게이트를 적용하는 펄 스크립트의 사용이다추가 측정으로 확인 된 개체군의 개발 허가 상호 참조. 그것이 셀 프로파일의 프레임 워크 내에서 게이팅의 요소를 포함 할 수도 있지만 동등하게, 여기서 사용되는 대체 경로가 큰 데이터 세트가 평가 될 필요가있는 경우 특히, 유연성 및 속도를 제공한다. 현재 프로토콜의 사후 이미지 수집 단계에서 가장 느린 단계는 셀 프로파일 러 소프트웨어의 실행이다. 필요한 경우 셀 프로파일 러는 여기에 다른 게이트 값을 반복적으로,보다 신속하게 후속 펄 스크립트를 재분석 할 수있는 게이팅 원시 데이터 세트를 생성하기 위해 게이트를 부과하지 않고 실행됩니다. 모든 연구는이 같은 적합한 게이트 값이 잠재적으로 시간이 지남에 따라 데이터의 특정 세트에 시약과 다를 수 있고 사전에 알 수 있습니다. 이 때문에, 적합한 가치있는 게이트를 식별하기 위해 양성 대조군 및 모델 섭동 전지용 셀 프로파일로부터 얻어진 원시 데이터 분포를 나타내는 히스토그램을 생성하는 추천관심의 매개 변수에 대한 말이지.

펄 스크립트는 셀 프로파일의 데이터를 엄격하게 정의 된 열 구조를 받아 작성하고 사용자가 'ExportToSpreadsheet'설정을 사용하여 셀 프로파일에 의해 매개 변수 출력의 수를 수정하는 경우 작동하지 않을 수 있습니다. 노트 펄 스크립트 파일에 포함 된 설정의 수정을 구현하는 데 도움합니다. 이러한 텍스트 편집기에서 스크립트보기를 참조하기 위해, 바람직하게는 프로그래머의 텍스트 편집기 (예를 들어, http://www.activestate.com/komodo-edit) 컬러 코드 펄 요소로 설정. 데이터 형식의 변화에​​ 적응하기 위해 스크립트를 조정하는 곳이 노트를 나타냅니다. 펄 스크립트와 유사하게, 이미지 분석 데이터로부터 인물 플로팅 명령을 포함 제공된 R-코드 파일 (analysis.r)는, 사용 및 적응에 대한 추가적인 정보를 참조하는 텍스트 편집기 또는 RStudio 소프트웨어에서 판독 할 수있다. 이 노트는 정규 표현식 펄 <에 대한 자세한 내용을 보충 할 수있다SUP> (12) 및 데이터 판독 주석 각각 플롯 방법에 대한 기초를 형성하는 둘 R, ¹³ 대 ggplot2 패키지.

형광 현미경을 사용하여 새로운 연구뿐만 아니라 오픈 소스 공보 증착 원 데이터는 여기에 기재된 것과 같은 분석 방법 의무이다. 하이 콘텐츠 데이터의 본질은 임의의 주어진 관찰자의 연구 분야에 따라 다른 분석 역점으로 재귀 분석 빌려 준다. 상기 데이터의 요청받을 수 질문 원래 사용 프로브에 의해 제한되지만, 화상 데이터는 종종 의미들을 생성 연구 다루지 재분석 될 수있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars negative control siRNA	Qiagen	1027280	Negative control siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.
Nulcease-free water (non-DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	For dilution of siRNA buffer.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfection lipid.
DMEM	Life Technologies	41966052	Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.
96 well tissue culture plate	Falcon	3072	Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.
Breathable membrane	Alpha Labs	LW2783	Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Non-ionic detergent

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	For plate wash solution.
Anti-P-S780 RB1 antibody	Abcam	ab32513	Rabbit monoclonal
AlexaFluor647 Anti-rabbit	Invitrogen	A21245	Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.
Hoechst 33342 (Bisbenzimide)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.
Permeabilization solution	NA	NA	0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.
Plate wash solution	NA	NA	Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.
Block solution	NA	NA	5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R programming environment	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/