Arbeidsflyt for High-innhold, Individuell Cell Kvantifisering av Fluorescent Markers fra Universal Microscope data, som støttes av Open Source Software

Summary

Presentert er en fleksibel informatikk arbeidsflyt slik at multiplex bildebasert analyse av fluorescensmerkede celler. Arbeidsflyten kvantifiserer atom og cytoplasmatiske markører og beregner markør translokasjon mellom disse rommene. Prosedyrer er gitt for forstyrrelse av celler ved hjelp av siRNA og pålitelig metode for markeringen deteksjon ved indirekte immunofluorescens i 96-brønners format.

Abstract

Fremskritt i forståelsen av de kontrollmekanismer som styrer oppførselen til cellene i heftpattedyr vevskulturstudier modellene blir stadig mer avhengige av moduser av encellede analyse. Metoder som leverer kompositt data som gjenspeiler gjennomsnittsverdiene av biomarkører fra celle populasjoner risikerer å miste undergruppe dynamikk som gjenspeiler mangfoldet i studert biologiske system. I tråd med dette, er tradisjonelle tilnærminger blir erstattet av, eller støttes med, mer sofistikerte former for cellulær analyse utviklet for å tillate vurdering av høyt innhold mikroskopi. Disse analysene potensielt generere et stort antall bilder av fluorescerende biomarkører som aktiveres av medfølgende proprietære programvarepakker, åpner for multi-para målinger per celle. Imidlertid har de relativt høye kapitalkostnader og overspecialization av mange av disse enhetene forhindret deres tilgjengelighet til mange etterforskere.

Beskrevet her er enuniverselt anvendbar arbeidsflyt for kvantifisering av flere fluorescerende markørintensitet fra spesifikke subcellulære regioner av enkeltceller som er egnet for bruk med bilder fra de fleste fluorescerende mikroskop. Nøkkelen til denne arbeidsflyten er gjennomføringen av fritt tilgjengelig Cell Profiler programvare ^en å skille enkeltceller i disse bildene, segment dem inn i definerte subcellulære regioner og levere fluorescens markør intensitet verdier spesifikt til disse regionene. Utvinningen av de enkelte celleintensitetsverdier fra bildedata er den sentrale hensikten med denne arbeidsflyten og vil bli illustrert med analyse av styredata fra en siRNA skjerm for G1 sjekkpunkt regulatorer i adherente humane celler. Imidlertid kan arbeidsflyten som presenteres her anvendes for analyse av data fra andre former for celle perturbasjon (f.eks sammensatte skjermer) og andre former for fluorescens-basert cellulære markører og dermed bør være nyttige for en rekke laboratorier.

Introduction

Arbeidet presenteres her beskriver bruk av fritt tilgjengelig programvare Cell Profiler for å utføre algoritmen styrt nedbryting av fluorescerende mikroskopi bilder av heftende celler for å identifisere individuelle celler og definerte subcellulære regioner. Denne fremgangsmåten, betegnet som bildesegmentering, tillater den påfølgende multi-parametrisk analyse av de avbildede celler ved å kvantifisere fluorescensmerkede markører lokalisert i hver celle eller subcellulære region (betegnet som segmenterte objekter). Denne arbeidsflyten gir grunnlag for å muliggjøre høy innholdsanalyse, og er ment som et verktøy som kan videreutvikles og endres for å passe multi-parametrisk, analyserer enkelt celle i laboratorier uten tilgang til spesialiserte høyt innhold instrumenter eller proprietær programvare. Filene som følger med dette manuskriptet er blant annet et testsett med relevante rå bildedata, algoritme innstillinger og støtter skript for å generere analysen beskrevet. Den gitt algoritme innstillinger feller Cell Profiler er optimalisert for eksempel datasettet og diskusjon avsnitt detaljer hvilke justeringer kan være nødvendig for å muliggjøre bruk av bildedata fra andre studier.

Når kvantitative data er hentet ved hjelp av Cell Profiler, kan forskjellige laboratorier har ulike krav til hvordan du kan bruke den informasjonen som presenteres av de enkelte celleverdier i rådata; vist her er en metode ved hvilke porter er påført på de rå data for hver analyse. Ved hjelp av disse portene, er dataene forvandlet til binære form av respons, slik visualisering av trender knytte ulike behandlinger med subpopulasjoner av celler som gjennomgår respons definert av portene. Portene er satt basert på observasjoner av datafordelinger innhentet for aktuelle negative og positive kontroller for hver relevant måling. Bruken av portene er bare ett eksempel på hvordan man skal håndtere den rå, cellebaserte målinger. Også vist her er bruk av kjernefysisk DNA intensitet megasurements i sin rå form som en sammenhengende rekke verdier i kombinasjon med gated data. Andre måter å håndtere bildeanalysedata bør vurderes, avhengig av naturen av studien; statistiske alternativ til å bruke portene for å tildele celler til subpopulasjoner er rapportert ^to og systematiske sammenligninger av strategier for å oppsummere høy innholdsdata på tvers av et stort antall parametere har blitt rapportert ^tre.

Høy innholds analyser av bildedata har funnet bruk i mobilnettet studier av narkotika-respons, reverse genetikk og miljømessige stress signaliserer ^4-6. Fortjeneste av høy innholdsanalyse stammer fra det faktum at algoritmiske analyse av fluorescensmikroskopi data tillater kvantitative og romlige parametre som skal behandles samtidig på tvers av individuelle celler ^7. På denne måten kan cellulære utfall for flere analyser bli sammen, differensial oppførsel av assay-defined celle subpopulasjoner kan spores innen eksperimentelle forhold og analyser kan omfatte vurdering av morfologiske variablene. Den strategier og analyser arbeidsflyt diskutert her, som for andre high-innhold tilnærminger, er i stand til å levere multiplekserte data som er kryss-referert til individuelle celler. Høy innhold metoder dress studier som genererer fluorescerende mikroskop bilder og gjelder for analyse av data som spenner fra titalls bilder produsert i lav gjennomstrømning konvensjonell fluorescens-basert mikros gjennom til de tusenvis av bilder produsert ved hjelp av automatiserte høyt innhold screening plattformer.

Arbeidsflyten er illustrert her med eksempeldata som separate analyser måles i form av enten atom fluorescerende markør intensiteter eller kjernefysiske / cytoplasma translokasjon av et fluorescerende reporter protein, henholdsvis. Arbeidsflyten er fleksibel ved at disse analysene kan betraktes hver for seg eller i kombinasjon, avhengig av each gitt problemstilling ved forskjellige etterforskere. Eksempeldataene er produsert som en del av et RNA-interferens (RNAi) eksperiment (figur 1). Små interfererende RNA-oligonukleotider (siRNA) blir brukt til å knockdown spesifikke proteiner i HCT116 humane kolorektale carcinom-celler som resulterer i endringer for to lysrør reportere av cyklin-avhengig kinase (CDK) aktivitet. Den CDK6-avhengig fosforylering av atom retinoblastom protein ved serin 780 (P-S780 RB1) bestemmes ved antistoff-farging. I de samme celler, blir et grønt fluorescerende protein-merkede rapportør av CDK2-aktivitet (GFP-CDK2 reporter) bedømt ved dets atom til cytoplasma-forhold der i fravær av CDK2-aktivitet reporteren befinner seg i kjernen og ved CDK2 aktiveringstransport inn i cytoplasma ^8. I tillegg er DNA hos hver celle farget ved anvendelse av en DNA-interkalerende fargestoff, Bisbenzimide, som tjener som et middel for å identifisere celler og definerer grenser kjerner i bildene så vel enSA mål på DNA overflod gir informasjon om cellesyklusen stilling av cellen (figur 2).

Virksomheten til CDK6 og CDK2 kan påvises som celler transitt fra G1 til S-fasen av cellesyklusen ⁵ og lykkes hverandre ^9,10, og som sådan, er nært samsvar mellom de to journalistene i enkeltceller forventet. Demonstrasjonen datasettet anvendes her analyser som et eksempel på virkningen av siRNA rettet CDK6, retinoblastom protein (RB1) og en ikke-måls negativ kontroll (tabell 1). Knockdown av CDK6 vil avstedkomme både en nedsettelse av P-S780 RB1 epitop og en akkumulering av celler i G1-fasen av cellesyklusen. Den RB1 knockdown tjener som et reagens kontroll for spesifisiteten av fosfo-S780 antistoff. Fluorescens mikroskopbilder fra formalinfiksert ^11, fluorescensmerket farget HCT116 vevkulturceller brukes for algoritmisk bildeanalyse. Den resulterende numeriske data blir så brukt til åkryssreferanse journalistene og måle effekten av de ulike knockdown stater.

Den potensielle størrelsen på dataene som produseres av denne typen analyse kan være en utfordring til normale analyseverktøy. For eksempel kan de individuelle celledata være større enn noen regnearkprogrammer skal romme. Inkludert er Perl-skript som utfører enkle, svært repeterende, veiledet behandling av data for å hjelpe analyse av store datasett. Perl-skript er skrevet spesielt for utdatafiler produsert av Cell Profiler, ved behandling av bildefiler med en bestemt fil navnekonvensjon (figur 3), og gir mulighet for variable antall felt per brønn som skal brukes i analysen. Det er ofte viktig å port individuelle celleanalysedata til å spore trender i celle subpopulasjoner ⁵ og vist her er bruken av et Perl skript for å flagge hver celle på grunnlag av et sett portforutbestemt for hver analysetype. Det finnes også tilleggs Perl-skriptsom oppsummerer data resultat for de enkelte brønner (eller forhold), og leverer: prosentandel av celler i løpet av den innstilte porten og middelverdiene av de rå analyse score. Den sistnevnte, mer homogen måte å vise de data er gyldig der responser påvirker alle eller de fleste av cellene i en brønn. Som diskutert ovenfor, er mindre anvendelige enn det som gis av den enkelte celle data gating der responsen er begrenset til en undergruppe av celler i en populasjon som for vurdering.

Anvendeligheten av den beskrevne arbeids er ikke begrenset til perturbasjon av siRNA eller markør analysene beskrevet. Studier har brukt denne tilnærmingen til analysen responser i vevskulturstudier eksperimenter med kombinasjoner av siRNA, kjemiske hemmere og strålebehandling, og for vurdering av andre enn CDK6 markører og CDK2 aktivitet ^fem.

Konseptuelt kan det eksperimentelle strategi en rekke biologisk nyttige subcellulære regioner som skal registreres automatiski individuelle celler i fluorescerende mikroskop bilder. Som sådan, kan denne tilnærmingen gi kvantitative, multiplekserte data avslørende biologisk informasjon som kan være savnet gjennom teknikker som fokuserer på bestander i stedet for individuelle celler. Med mindre endringer, kan tilnærming og analyse arbeidsflyt beskrevet gi kvantitative, enkelte celle data for eventuelle fluorescens-basert analyse utganger og cellebiologiske reaksjoner, der kvantitativ vurdering av DNA-innhold, kvantifisering av kjernefysisk eller cytoplasma fluorescens eller skyt av markører mellom disse to avdelinger, enten individuelt eller i en multiplekset måte, er av interesse. Som publisering krav økende tendens mot innlevering av åpent tilgjengelig rådata, tilgang til og fortrolighet med gratis verktøy for mikroskopi bildeanalyse slik som de som er beskrevet her vil også være av direkte interesse for laboratorier som ønsker å Analyser på nytt publiserte data.

Protocol

1. Experimental forstyrrelse og Cell Merking for Response Markers (Reverse Transfection siRNA Screen)

1. I et sterilt vevskultur hette pipette 70 ul av 200 nM siRNA i 1x siRNA-buffer i brønner i en steril, ren 96-brønners plate. Fortynn transfeksjon lipid i 40 volumdeler serumfritt DMEM medier og dispenser 105 ul i hver brønn inneholdende siRNA.
   MERK: Fortynning 262,5 ul lipid inn i 10,5 ml serumfritt DMEM gir en masterblanding egnet for en hel plate med 96 brønner over siRNA, og leverer 2.6 ul lipid per brønn. Bruk av 200 nM siRNA startkonsentrasjon på dette trinnet vil levere en fungerende konsentrasjon på 20 nM i trinn 1.3, men prosedyrer vil arbeide for å arbeide konsentrasjoner ned til 5 nM, med start konsentrasjon justert (dvs. 50 nM). Lavere arbeidskonsentrasjon kan redusere off-target falske positive score, selv om de kan redusere omfanget av on-target respons, fører til økning av on-TARGEt falske negative priser.
2. Bland platen ved forsiktig vibrering i ti minutter ved romtemperatur. Under dele de resulterende 175 ul i tre 50 mL replikater per mål på en ugjennomsiktig, vevskultur behandlede, 96-brønners plate med en gjennomsiktig base.
3. Omvendt transfeksjon ved dispensering av 8000 celler per brønn i 150 ul DMEM inneholdende 10% serum direkte på 50 ul lipid-siRNA komplekser. Bruk HCT116 menneskelige kolorektal celler som stabilt uttrykker en GFP-merket markør rapportering CDK2 aktivitet ^5,8. Ingen ytterligere blanding er nødvendig. Forsegl plate med en steril, klebende pustende membran for å kontrollere fuktighet og hindre plate 'kanteffekter' og plassere platen i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% _CO2 i 48 timer.
4. Aspireres media, slik at en liten restmengde av mediet forblir i brønnene. Fikser cellene ved tilsetning av 100 pl av 4% bufret formaldehyd til hver brønn og inkuberes i et avtrekksskap i 10 minutter ved værelses temperature.
5. Fjern fikseringsoppløsningen ved aspirering av platen. På dette tidspunkt enten stoppe eksperimentet ved å vaske platen tre ganger med 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS), og deretter lagre forseglet under 100 ul PBS i mørke ved 4 ° C i opptil en uke eller fortsette med permeabilization av cellene.
   MERK: Vi anbefaler behandling plater så snart som mulig etter fiksering, og generelt foretrekker lagring av ferdigbehandlede plater. Biocide konserveringsmidler slik som thimerosal, natrium-azid eller kommersielle alternativer kan tilsettes for å hindre micoroganismal vekst. Tilsetning av fosfatase-inhibitorer bidrar til å bevare fosfo-epitoper, og andre midler for å bevare proteinmodifikasjons tilstander kan være nyttig i analysen relevante sammenhenger
6. Fjern PBS fra platen og permeabilisere cellene ved tilsetning av 100 ul av permeabilization løsning. Inkuber i 10 minutter ved værelsetemperatur uten rysting. Aspirer permeabilization løsning ved hjelp av en MultiCHAnnel pipette. Gjenta dette trinnet tre ganger.
7. Blokkere cellene ved tilsetning av 100 ul per brønn blokk løsning i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern blokken løsning ved aspirering av plate, deretter probe med 50 ul av anti-P S780 RB1 antistoff fortynnet 500-fold i blokken løsningen i 2 timer i mørke ved romtemperatur.
8. Platen vaskes tre ganger med 100 ul vaskeløsning plate, slik at oppløsningen på platen i 5 minutter hver gang. Probe platen over natten i mørke ved 4 ° C med 50 ul fluorescensmerket-merket sekundært antistoff fortynnet 1000 ganger i blokk oppløsning supplert med 2 uM av kromatin-spesifikke DNA-fargestoff Bisbenzimide. Platen vaskes tre ganger som tidligere, og lagre forseglet under 100 ul PBS i mørke ved 4 ° C. Image plate i løpet av to uker.

2. Imaging and Image Segmentering

1. Bruk en confocal eller spinner-disk fluorescens mikroskop med en 20X objektiv til å ta egen 16-bit, gråskala TIFF-bilder i tre kanaler som tilsvarer DNA fargestoff, GFP og immunofarging fluorophores. Fange mange ikke-overlappende bildesett, referert til her som rammer, å avbilde ca. 1000-2000 celler per brønn.
2. Navngi bildefilene systematisk slik at hver fil navn er en unik kombinasjon av "eksperiment navn ',' vel adresse ',' rammenummer" og "kanalidentifikator ', i denne rekkefølgen (figur 3). Den eksempel datasettet bruker "Blue" (kromatin DNA flekker) eller "grønt" (GFP) eller "Red" (den immun-farget fluorophore) som kanalidentifikatorer. Brønnen adresse, bildenummer og kanalidentifikator er videre betegnet som bilde metadata. Bruk understrekings symbolet for å unngå forvirrende godt og ramme metadata.
3. Navngi filer med disse metadataelementer i den angitte rekkefølgen. Dette er nødvendig for å sikre at de etterfølgende trinn i programvaren Correctly gruppe sett med bilder for analyse.
4. Last ned og installer freeware Cell Profiler, Aktiv Perl Community Edition, R statistisk programmeringsmiljø og RStudio. Godta alle standardvalgene under installasjon; PC-brukere å installere Active Perl bør sette alle alternativene knyttet til PATH, filtype foreningen og script kartlegging der du blir bedt om. Aktiv Perl er valgfritt for Mac-brukere, men de ellers vil måtte kjøre Perl-skript i trinn 3.2 fra Terminal kommandolinjen fremfor å bruke ikonet klikke.
5. Åpne Cell Profiler programvare, klikk "Fil", "Import Pipeline" og deretter "Fra fil" og velg filen 3_channels_pipeline.cppipe (Tall S1A & S1B). Filen inneholder instruksjoner som er nødvendige for programvaren å tolke bildefil metadata fra filnavnet konvensjonen beskrevet. Celle Profiler relaterer nå bildene, trekker kjerne-DNA og antistoff intensiteter fra these og bruker GFP kanal for å beregne forholdet mellom atom versus cytoplasma intensiteten for hver celle registreres (figurene 4 og 5).
6. Klikk på knappen "Vis utgang innstillinger 'i nedre venstre hjørne av Cell Profiler vinduet. På toppen av den nye skjermen er tekstbokser merket "Standard Input Folder" og "Standard Output Folder". En av gangen, klikker du på mappe-ikonene til høyre for disse boksene og velge plasseringen av bildefiler for analyse og målet for datautdragene, henholdsvis (Figur S1C).
7. Begynn bildeanalyse ved å trykke på 'analysere bilder "-knappen i nedre venstre hjørne av Cell Profil. På bunnen av skjermen observere gjenværende tid for datauttrekk, den "Stopp Analysis" og "Pause" knappene. Om nødvendig stanse analyse ved å velge "Pause" -knappen når som helst, noe som er nyttignår du ser på bildene som blir analysert (beskrevet i trinn 2.8).
8. Eventuelt åpne vinduene for noen av bildeanalyse trinnene ved å klikke på øye-ikonene i panelet på ytterste venstre i programvinduet (figur S1D). Observere 'IdentifyPrimaryObjects' vinduet og de ​​som for 'Sekundære "og" tertiær Objects for å sjekke at de gjeldende innstillingene i Cell Profiler for å utføre bildesegmentering er egnet (se figur 1 og diskusjon om råd om å endre disse innstillingene).
9. Klikk "Ok" i meldingsboksen som vises når analysen er ferdig. Gå til plasseringen 'Standard Output Folder "der alle datafiler med resultatene lagres som kommaseparert-verdi (CSV) filer (Figur S2A).

3. data Extraction

1. Finn den nye filen 'Nuclei.csv', som er inkludert blant deutgang fra Cell Profil. Denne filen inneholder enkelte celledata for fluorescerende atom antistoff intensitet, nukleært DNA intensitet og GFP-CDK2 reporter ratio verdier (figur 6A & S2A).
   MERK: Ulike laboratorier vil ønske å behandle denne type data som passer til innholdet i sine egne analyser. Foreslått for den nåværende data er gating av cellene fra hver behandling tilstand i henhold til antistoff data og GFP-CDK2 reporter verdier ved hjelp av den medfølgende Perl script '2_gate_classifier.pl'.
2. Kopier gitt Perl script file '2_gate_classifier.pl' i den samme mappen som "Nuclei.csv 'datafil (figur S2A). Dobbeltklikk på ikonet for Perl-skript, og når du blir bedt om, skriver hele navnet på datafilen etterfulgt av en ".csv" filnavn navn på filen der cellene skal gated og til slutt gate verdier for antistofffluorescens og GFP-CDK2 reporter data.
   MERK: Slik hovedsak bestemme gate innstillinger og bruke disse for analyse av data er omtalt nedenfor i representative data delen og Figur 6 (for å analysere dataene gitt bruk '0.004 "og" 1.5 ", henholdsvis). Mac-brukere bør kjøre Perl-skript fra Terminal kommandolinjen ved å skrive: "perl 2_gate_classifier.pl '.
3. Observere den nyopprettede filen som kombinerer rå individuelle celle analyseverdier fra den opprinnelige cellen Profiler data med etiketter sub-befolkningen som viser hvordan hver enkelt celle fra hver brønn utfører mot begge porter (figur 6C).
4. Plotte dataene for hver eksperimentell tilstand ved hjelp av de enkelte celle subpopulasjon etiketter ved å åpne RStudio programvare. Klikk "Fil" og "Åpne fil", velg deretter tilgjengelig 'analysis.r' fil. Observere kommandoene å plotte figur 6B, 8 i øvre venstre vinduet i RStudio (figur S2B). I det øvre venstre vindu, mellom de doble sitat symboler på linjene 5 og 6, skriver datamaskinen adressen til mappen som inneholder gated data. Inkluder stasjonsbokstaven og navnet på selve filen, henholdsvis (for eksempel "C: / analyse mappe / analyse output" og "nuclei_gated.csv").
   MERK: Hvis RStudio brukes for første gang på en gitt datamaskin, vil R-grafikk pakke 'ggplot2' må installeres først. Dette er en gang bare skritt for en ny installasjon av RStudio, etter som dette trinnet blir overflødig. Å installere 'ggplot2', klikk på fanen som heter "Pakker" over vinduet i nedre høyre hjørne av RStudio, klikker du installere pakker 'knappen som vises under dette. Et nytt vindu vil vises. Skriv 'ggplot2' (utelater sitater) inn i "pakker" sTempoet i denne nye vindu og til slutt klikker du på "Installer" knappen for å lukke vinduet, installere de nødvendige ggplot2 funksjoner og gå tilbake til hoved RStudio vinduet for å fortsette fra trinn 3.6.
5. Uthev linje 1 til og med 17 i øvre venstre vinduet i RStudio, klikk deretter "Kjør" -knappen. Dette vil gå inn eksperimentelle data, terskelverdier og godt sted detaljer i R (Figur S2C). R vil nå midlertidig ha de relevante data for plotting.
6. Heve enkeltblokker av de resterende kode under linje 17 og skape de tilsvarende tomter ved å klikke på "Kjør" knappen som før. Observere tomter i vinduet nederst i høyre hjørne av RStudio og lagre rekke formater ved å klikke på "Export" -knappen (figur S2D).
7. Under lukking RStudio, klikk "Ikke Lagre" når du blir bedt om. Dette hindrer forvirring på neste bruk av RStudio, som ellers vil holde datafra forrige sesjon.

Representative Results

Eksempelet satt av bilder generert ved hjelp av reverse-transfeksjon siRNA screening protokoll er utarbeidet for og analysert ved hjelp av Cell Profiler programvare. Den resulterende numeriske rådata er slik at hver celle er individuelt representert, sporbar tilbake til sitt image og godt opprinnelsesland og målt for flere fluorescens intensitet parametre (Figur 6A). For hver celle er identifisert den midlere atom fluorescensintensitet for P-S780 RB1 antistoff og det integrerte DNA intensiteten for DNA-fargestoff-definerte kjerne masker blir bestemt. Bety GFP intensitetsverdier for nucleus og cytoplasma regioner i hver celle er også registrert slik at beregningen av kjernefysisk versus cytoplasma fluorescens av GFP-CDK2 reporter. Nedstrøms for disse algoritmisk fluorescens intensitetsmålinger gjøres bruk av disse individuelle celledata for å definere porter for to analyser, kjerne antistoffarging og GFP-CDK2 reporter. Påfølgende annotering av cellene på the grunnlag av analyseutbytte og bruk av slike etiketter for å aktivere spesifikke subpopulasjoner skal videre karakterisert ved en tredje måling (nukleær DNA-innhold) er beskrevet.

Histogram plott av rå fluorescens intensitet data samlet for hver analyse er en effektiv måte å vurdere hvordan celle subpopulasjoner oppfører seg under forskjellige forhold. Histogrammene i figur 6B viser befolknings distribusjoner av enkelte celledata fra triplikatbrønner for hver RNAi knockdown tilstand. Til venstre er dataene for atom antistoff intensitet og til høyre er de tilsvarende data for GFP-CDK2 reporter. P-S780 RB1 antistoff data viser at cellene i stor grad foreligge i to populasjoner med hensyn til denne post-translasjonell modifikasjon, og at cellepopulasjoner med tap av RB1 fosforylert på S780 kan skilles som en venstre toppen av kjerne intensitet som er anriket når CDK6 blir slått ned av siRNA. Dette samme venstre topper sett når RB1 selv er den RNAi mål, noe som reflekterer den outright fjerning av protein og dermed P-S780 RB1 farging. I motsetning til dette, de samme forsøksbetingelser for de samme celler, når observert via GFP-CDK2 reporter assay, viser en annen dynamikk i de enkelte celledataene. En kontinuerlig fordeling er observert, med bare en enkelt topp, men siRNA som forstyrrer cellesyklus (siCDK6) og forårsaker akkumulering i G1 fase resulterer i en forlengelse av den høyre skulderen av at fordelingen (dvs. som indikerer forbedret tilstedeværelse av celler som viser en øke i atom / cytoplasma GFP ratio, plottet på X-aksen).

Også vist på histogrammene i figur 6B er port verdier (vertikale søyler) som er valgt på basis av fordelingen av begge sett av analysedata. Den regel som brukes for P-S780 RB1 antistoff data er å definere porten posisjon som den halve høyde: maksimal breddeposisjon på venstre skulder av hoved(Høyre) peak når de vurderer de negative kontroll celledata (ikke-målretting siRNA). Data uthevet rød er celler med redusert og fraværende P-S780 RB1, som er identifisert med denne gate. En tilsvarende port er plassert på den motsatte skulder av forholdet verdifordeling brukes for GFP-CDK2 reporter. De resulterende høy-ratio undergruppe celler, som mangler eller funksjon redusert CDK2 aktivitet, er vist i grønt. For å illustrere multiplexed analyse av de to analysene figur 6C viser gjennomføringen av begge gate verdi med 2_gate_classifier.pl perl skript for å konvertere rådata (Figur 6A) i den kommenterte filen nedenfor. Denne nye filen omfatter de opprinnelige data sammen med en ny kolonne med klassemerker for hver celle, og de to sluseverdier som brukes for å skille dem (i dette tilfellet portene til 0.004 for de antistoff-data og 1,5 for GFP-CDK2 reporter ble benyttet, henholdsvis) .

Etter å ha klassifisert de enkelte cellene fROM hver knockdown tilstand på grunnlag av de to analysene er det nå mulig å bruke disse klassemerker for å bistå annotering av plott av analysedata. Figur 7 viser spredningsplott av individuelle celledata for P-S780 RB1 og GFP- CDK2 essay fra eksempeldatasettet for alle tre RNAi forhold. Numrene du kommenterer kvadrantene på scatterplots viser de relative prosenter av hver gated undergruppe til hele for at knockdown sammenheng og blir generert i R ved hjelp av klasse etiketter som er beskrevet ovenfor. Disse plott viser at, sammenlignet med celler transfektert med ikke-målsøkende siRNA (figur 7B), celler transfektert med siCDK6 viser en netto datafordeling forskjøvet både nedover på Y-aksen (som indikerer fravær av RB1 fosforylering på serin 780) og til høyre på X-aksen (som indikerer lav CDK2-aktivitet, figur 7C). Begge disse forskyvninger er forventet for knockdown av dette målet. I kontrast til dette, data fra SirB1 transfekterte celler (figur 7A) viser et tap av antistoffarging i overensstemmelse med tapet av epitopen, men liten virkning i datafordeling for CDK2 reporter sammenlignet med kontroller transfektert med ikke-målsøkende siRNA, noe som tyder på ingen stor virkning på GFP -CDK2 reporter oppstår fra RB1 knockdown.

Å undersøke bruk av individuell celle data, undergruppe klassifisering og analyse multipleksing Figur 8 viser videre spredningsplottet for siCDK6 data fra figur 7C sammen sammenkoblede histogram profiler for integrert DNA intensitet. Parene av histogrammer forholder seg til motstående halvdeler av hele populasjonen, delt på basis av enten antistoffet intensitet (til høyre på scatterplot) eller GFP-CDK2 reporter forholdsverdier (over scatterplot). Kvantifisering av nukleært DNA intensitet for disse populasjonene viser to topper karakteristiske 2N og 4N DNA innhold som venstre og høyre topper, henholdsvis. Det jegntentions av portene som er vist i figurene 6, 7 og 8 er slik at celler identifisert som lav for P-S780 RB1 (merket: P-S780-) eller med et høyt forhold verdi fra GFP-CDK2 reporter (merket: G1) vil være i G1-fasen av cellesyklusen. Faktisk er de DNA-profil histogrammer for subpopulasjoner identifisert med en av disse assays hovedsakelig inneholder celler med 2N DNA-innhold. DNA-profiler av den motstå gated populasjonen (merket: P-S780 + eller ikke-G1) inneholder celler med fordelinger som strekker seg fra 2N til 4N, i samsvar med slike celler i bruk en rekke cellesyklus posisjonerer post-G1 fase.

Selv om det her har vært fokus genereringen og analyse av individuelle celledata fra fluorescently fargede bilder, er det også nyttig å være i stand til å ta disse data og oppsummere hver analyse på en brønn-til-godt grunnlag for å overvåke variasjonen mellom replikater og ytelsen av alle brønner for en gitt analyse på tvers av en hel plate av data. A) P-S780 Rb1 data og b) GFP-CDK2 reporter data. Verdiene plottes i A og B er produsert av to ekstra Perl-skript som følger med dette manuskriptet; 'Antibody_fluorescence_summary.pl' og 'G1assay_summary.pl', henholdsvis. Disse skriptene bruke rådata som er opprettet av Cell Profiler (Nuclei.csv) og rapportdata per brønn som i) samlet celler målt per brønn, ii) antall celler innenfor porten, iii) prosent celler i gate og iv) det aritmetiske bety av de målte, rådata for at også. Dette inngår som et alternativ som passer for ser over store sett med analysedata, før fokus på individuelle behandlingsdata ved hjelp av multiplex vurdering av enkelte celle data som illustrert i 8. Listene vises her tomten 'iii) prosent celler innenfor porten' for begge analysene, som passer de ikke-normale datafordelinger sett for P-S780 RB1 og GFP-CDK2 data i histogrammene i figur 6B. Disse skriptene også beregne 'iv) det aritmetiske gjennomsnitt av de målte, rådata for at godt', som ville passe analyse av data for homogene befolknings svar og normal datafordelingen før og etter eksperimentell forstyrrelse.

Figur 1:. Oversikt over trinnene i arbeidsflyten til kvantitativt analysere fluorescensmerkede mikroskop bildedata er Arbeidsflyten representert her som fire trinn (A) Først er det nødvendig å eksperimentelt forberede celler for fluorescerende bildebehandling.. Det eksempel som er beskrevet her er at enskjermen hvori siRNA-behandlede adherente humane tumorceller blir dyrket i 48 timer, fiksert og farget på en 96-brønns vevskulturplate. Forskjellige RNAi betingelser er tilstede i triplikat i separate brønner i platen. Cellene er farget med en DNA fargestoff, et antistoff spesifikt for RB1 fosforylert på CDK4 og 6 selektiv målområde Serine-780 (P-S780 RB1) og de også stabilt uttrykker en GFP-CDK2-reporter, rapportering G1 cellesyklus exit. Kollektivt disse fluorescerende prober utgjør to assays separat vurderes innenfor arbeidsflyten. (B) som er parallell mikroskopbilder for hver fluorescerende probe (kanal) blir generert og navngitt som å inkludere detaljer ved hvilken bildeanalyseprogramvaren kan organisere dataene. (C) Det bildefiler er lastet inn i cellen Profiler programvare, som algoritmisk identifiserer individuelle celler, og de tilhørende par av kjerner og cytoplasma før man oppnådde intensitetsmålinger for de tre fluorescerende prober detektereed i hver. (D) Til slutt, er et Perl-skript brukes til å organisere de rå kvantitative data produsert. Dette trinnet gjelder portene til fluorescens intensitet data for hver celle, effektivt binning cellene i delpopulasjoner, som kan plottes, spores og kryssforhørt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Eksperimentelle data som kan oppnås ved billedanalyse De faste, siRNA-behandlede, fluorescerende merkede celler fra eksempelet datasettet ble fotografert og tilsvarende intensitetsmålinger tatt per celle.. Representative bildedata som er vist for hver parameter registreres ved bildeanalyse (A) Kjerne DNA intensitet:. Intensiteten av farving av nukleær DNA-fargestoff brukes til å gi et mål på DNA per kjerne (B) Nuclear intensitet av fosfor-RB1. Immuno-flekker spesifikt for P-S780 RB1 bruker en primær (svart) antistoff og fluorescently merket sekundært antistoff (rød) gjør en intensitet måling av RB1 fosforylering på . S780 per kjernen (C) GFP-CDK2 reporter: Cellene som brukes som stabilt uttrykker GFP-merket rapportørprotein som translocates mellom kjernen og cytoplasmaet i et bestemt mønster med cellesyklusen. Dual måling av den sammenkoblede nukleær og cytoplasmisk GFP intensiteten for hver celle tillater beregning av et forhold per celle som kan benyttes til å skille G1 fase fra resten av cellesyklusen. Tre siRNA mål vil bli brukt til å illustrere analyse; en ikke-måls negativ kontroll siRNA; CDK6 siRNA som en positiv kontroll i perturbing RB1 fosforylering og cellesyklus fremgang; RB1 siRNA å etablere antistoffspesifisiteten.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Filer Organisering av bilde før bildeanalyse Bildene er tatt fra vevskulturplaten er oppkalt systematisk for å tillate bildeanalyse programvare for å forholde bildedataene tilbake til den opprinnelige eksperimentell sammenheng: Figur 3.. Denne informasjonen er plassert i filnavnet for hvert bilde. (A) Som hver brønn på eksperimentet plate kan tilsvare forskjellige RNAi mål eller behandlinger, godt adresse former en del av filnavnet. (B) Rammenummeret er en del av filnavnet . i hver brønn avbildes for å samle inn flere, ikke-overlappende rammer (C) fluorescerende prober fra hver ramme blir avbildet separat; følgelig filnavnene må også gjenspeile hvilken kanal hvert bilde er relatert til. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4:. Bruk av Cell Profiler for å måle kjernefysisk DNA og antistoffarging Med innstillingene i den medfølgende rørledning fil (3_channels_pipeline.cppipe), de Cell Profiler bildeanalyse programvare tiltak fluorescens intensitet verdier for kjerne-DNA og antistoff-binding knyttet til individuelle celler . (A) Nuclei er identifisert i den "blå" kanal bilde av farget DNA. (B) < / Strong> Plasseringen av DNA farget atomkjerner er midlertidig holdt i en "Nuclei maske". Kjernene masken blir så lagt over (C) de blå og røde kanal bilder (DNA og antistoff fluorescens data, henholdsvis) og fluorescens-verdier fra bildesegmenter som overlapper med masken er ført mot hver identifiserte cellen. Vellykket identifikasjon av separate, nærliggende kjerner kan bli vurdert visuelt i utseendet av kjernene maske. For illustrasjon, vist sirklet i denne masken bildet, er eksempler hvor de valgte innstillingene for algoritmen har mis-identifiserte nabo kjerner som en enkelt kjerne. Justere algoritmen innstillinger for å minimere disse hendelsene er innført i diskusjonskapittelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Anvendelse av celle Profiler for å måle kjernefysiske og cytoplasmiske GFP intensiteter GFP-merket CDK2 reporter translocates mellom kjernen og cytoplasmaet i forhold til cellesyklus stilling av cellene.. På samme tid som celle Profiler beregner DNA og nukleære antistoff intensitet pr celle (figur 4), beregner den også atom til cytoplasma-forhold på GFP intensiteter for hver celle. (A) DNA-fargestoff-dataene for hvert bilde blir brukt til å generere Kjerner en maske. (B) Cell Profiler bruker Nuclei maske i forbindelse med GFP bildet fra GFP-CDK2 reporter til frø posisjonen til hver celle og deretter utvides til hver celle sin omkrets for å beregne hele fotavtrykk av hver celle. Dette blir en ny, 'Cell maske ". (C) Det kjerner masken blir subtrahert fra Celle maske for å gi en smultringlignende serie av cytoplasma skisserer, som bliden "Cytoplasm maske". (D) kjerner maske og cytoplasma mask brukes av Cell Profiler for å måle par av kjernefysiske og cytoplasma GFP verdier. Disse sammenkoblede Verdiene brukes deretter av Cell Profiler for å beregne prosenter, som forteller om hver celle posisjon i cellesyklusen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6:. Datautvinning - Behandler rå enkelte celle data ved å pålegge portene på analyseverdier Biologiske trender fra de enkelte celledata for antistoffarging og GFP-CDK2 reporter analysene er hentet ved hjelp av gated data. Histogrammer av rådata mulig å identifisere egnede gate verdier. Disse blir deretter pålagt med et Perl-skript. (A)Sluttproduktet av å analysere bildefiler med de angitte innstillingene for Cell Profiler er kommaseparert-verdi (CSV) filer. Disse filene c ontain individuelle celle data relatert til hver av de forskjellige sub-cellulære segmenter. Filen 'Nuclei.csv' inneholder alle de valgte målingene relatert til bruk av kjernene maske. Disse målingene inkluderer atom antistoff intensitet, nukleært DNA intensitet og GFP ratio (nucleus / cytoplasma). (B) Histograms av kjernefysisk antistoff intensitet (til venstre) og GFP-CDK2 reporter forholdstall (høyre) plottet fra enkelte celledata for hver siRNA knockdown tilstand . Barene på de viste histogrammer viser de ønskede portposisjonene for disse analysene. Fargede data om histogrammer indikere gated undergruppene. (C) Portene for de to analysene er vist i B brukes til rådata hjelp av Perl-skript '2_gate_classifier.pl'. Skriptetskaper en modifisert kopi av den opprinnelige Cell Profiler utgang (Nuclei.csv) fil å bistå påfølgende plotting. De to gate verdiene blir registrert i den nye filen (uthevet i farge her) og en ny "etikett" kolonnen er lagt til. Den etiketter bin hver celle i en av fire mulige undergrupper basert på de to gated analyseverdier for hver celle. Disse etikettene er brukt i senere tomter som har beregninger av bidrag fra hver undergruppe samt kryssreferanser av flere parametere som genereres i Cell Profil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7:. Spredningsplott for hver siRNA tilstand som viser rådata for individuelle celler og portposisjonene Scatter plott av indidual celle data fra alle bildene for siRNA forhold indikert: (A) siRB1, (B) sinon målretting negativ kontroll, (C) siCDK6. Plottet mot Y-aksene er verdier av atom fluorescens fra anti-P-S780 RB1 farging. Plottet mot X-aksene er de tilsvarende ratio verdier beregnet fra GFP-CDK2 reporter. De røde og grønne linjene viser posisjonene til portene for P-S780 RB1 gate og GFP-CDK2 reporter porter, henholdsvis. De to porter dele cellene i fire underpopulasjoner og tallene over den resulterende kvadranter er den prosentvise antall celler fra hver av disse. Merknader rundt aksene for A indikere de fire mulige label-elementer som brukes for hver celle av 2_gate_classifier.pl Perl-skript. Disse merkene er vist i forhold til deres respektive analyse port og brukes i R-script (analysis.r) for å generere plottene i figurene 6, 7 og Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: Cell subpopulasjoner definert av de to G1 transitt analyser viser 2N og 4N DNA-profiler i tråd med analysen Utbytte spredningsplott av data for de siCDK6 celler gjentas fra figur 7C.. Rundt spredningsplott er histogrammer for integrert kjerne-DNA intensitet knyttet til undergrupper av befolkningen. De ovenfor scatterplot relatert til GFP-CDK2 reporter assay. De til høyre for spredningsplott vedrører atom fosfo-RB1 antistoffmålinger alene. De fargede gate linjer er utvidet til å vise sin relasjon til histogrammene. Gate etiketter der celledata ble valgt for disse ekstra tomter er også vist. Celler med tap av RB1 fosforylerte på serin 780 (P-S780-) eller de med en høy GFP-CDK2 reporter atom til cytoplasma-forhold (som indikerer lav CDK2-aktivitet) viser hovedsakelig 2N-lignende DNA-profiler, mens deres motstående motstykker for hvert respektive analyse viser en fordeling av 2N og 4N, karakteristisk for en blandet, post-G1 fase populasjon av celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9: Oppsummering plott av gated analyseverdier for hver siRNA tilstand Oppsummering data plott av gated (A) P-S780 Rb1 data og (B) GFP-CDK2 data fra triplikatbrønner for hver siRNA knockdown tilstand.. Verdiene ble beregnet fra den rå celle Profiler utgang (Nuclei.csv) ved hjelp avPerl-skript, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) eller 'G1assay_summary.pl' (B). De plottede verdiene er gjennomsnitt av prosent celler i porten påført på hver analyse. Linjene indikerer standardfeil regnet fra triplikatbrønner. Uparede, homoscedastic T-Test P-verdier for hver knockdown tilstand sammenlignet med ikke-måls siRNA er vist ovenfor de plottede data der P <0,001 (**) og P <0,05 (*). Klikk her for å se en større versjon av dette figur.

Figur S1. Sette opp Cell Profiler programvare for bildeanalyse. (A) Skjermbilde av Cell Profiler før noen bildeanalyse innstillingene er lagt inn. (B) Skjermbilde av Cell Profiler etter algoritmen detaljene som finnes i '3_channels_pipeline.cppipe' har blitt lastet. Den høye tent fanen øverst i venstre hjørne viser at denne skjermen viser parametrene for 'LoadImages' stadium av analysen. Ved å klikke på de andre delene av listen nedenfor dette vil avsløre detaljene for de påfølgende trinnene i analysen. (C) Skjermbilde av Cell Profiler med detaljer for Input Folder og Output Folder inn. (D) Skjermbilde av Cell Profiler etter 'Analyser bilder 'knappen har blitt klikket for å begynne analysen. Lagret er tre nye vinduer illustrerer algoritmisk-produserte masker generert av programvaren fra bilder under analyse. Disse vinduene er tilgjengelig ved å klikke på 'øye' ikoner til åpen stilling ved siden av de aktuelle trinnene i analysen, i øvre venstre hjørne av hoved Cell Profiler vinduet. Disse synspunktene hjelpe brukeren til å kontrollere om innstillingene som genererer konfetti-farget masker enig med de medfølgende, opprinnelige, gråtone data.

ent "> Figur S2. Bruk av Perl og RStudio til gate individuell celle data og plott inn resulterende celle undergruppene. (A) Høyre panel viser mappen valgt å motta utgang .csv filer (grønne ikoner) fra Celle Profiler analyse. Perl-skript som følger med manuskriptet (blå ikoner) er kopiert inn i denne mappen. Uthevet er "2_gate_classifier.pl 'Perl-skript, som har vært dobbelt-klikket med musen for å produsere dialogboksen i venstre panel. Vist er den ledetekster og tilsvarende skrevet svar nødvendige for å gate de enkelte celle data fra "Nuclei.csv 'fil. (B) Skjermbilde av RStudio umiddelbart etter lasting av' analysis.R 'script. Uthevet er kommandoene for å laste opp gated data fra A til programvaren før plotting (note detaljer i linjer 5 og 6, må bli justert i henhold til hvor gated data er plassert på databehandlingsr brukes for analyse). (C) Skjermbilde av RStudio når data har blitt lastet opp. (D) Skjermbilde av RStudio viser uthevet blokken med kode som kreves for å produsere plottet vist i nedre høyre vinduet. Koder for hver tomt er atskilt med blanke linjer og gruppert etter type plot.

siRNA mål	Plate vel adresser
Non-targeting (NT)	E5, F5, G5
Retinoblastom (RB)	E7, F7, G7
Cyklinavhengig kinase 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabell 1: Brønnadresser og korresponderende siRNA betingelser anvendt i eksemplet datasettet.

Discussion

Arbeidsflyten beskrevet utgjør en prosedyre for flere brønner perturbance av celler ved hjelp av siRNA, da etterfølgende deteksjon og endelig bruk av en serie av software-støttet trinn for å lette ekstraksjon av kvantitative data fra den resulterende fluorescens mikroskopi bilder. Tilnærmingen er fokusert på leveranse av kjernefysiske og cytoplasmatiske intensitetsverdier for enkeltceller, som har bred praktisk anvendelse i mange celle-baserte applikasjoner. De eksempeldata som brukes her ble generert på et siRNA-skjermen ramme der to fluoriserende analyser for G1 fasecellesyklus transitt testes og korreleres tilbake til en mer direkte måling av biofysiske nukleært DNA-innhold.

Bruken av et fluorescerende DNA-flekken til bilde nukleært DNA er en uunnværlig trinn i bildet segmenteringsprosessen som det tillater identifisering av de enkelte celler, og den resulterende 'Nuclei maske' tjener som utgangspunkt for å identifisere tilsvarende cytoplasmic regioner. GFP-merket CDK2 reporter, som blir stabilt uttrykt i cellene, gir en variabel, men konsekvent høyere enn bakgrunnssignalet i cytoplasma etter som dette rom kan være avgrenset. Den samme analysen rørledningen skal gjelde for analyse av protein trans hendelser ved hjelp av andre egnede fluorescens-linked journalister og deres respons på perturbance. Også anvendelse av GFP-CDK2 reporter med cytoplasma-spesifikke fluorescerende fargestoffer ville tillate alternativ bruk av denne algoritme for å måle dimensjonene av cytoplasma og de relative størrelser av cellene i bildene.

En annen utforming hensyn ved bilde segmentering strategi som beskrives her er bruken av celleProfil for å levere integrerte intensitetsverdier for DNA-kvantifisering. Integrering av intensiteten verdier for atom DNA flekker data tillate for mulige variasjoner i nucleus størrelse, og representerer en tett kamp for kvantifisering profiler settfor propidiumjodid farget FACS data. Imidlertid kan integrerte intensiteten ikke gir et hensiktsmessig middel for å vurdere proteinfunksjon der gjennomsnittlig konsentrasjon, eksemplifisert ved midlere intensitet av fluorescens-antigen, er mer biologisk relevant enn den integrerte totale mengden av protein (og tilhørende fluorescens) i et cellerommet. Derfor betyr intensitetsverdier ble anvendt for P-S780 RB1 og GFP-data. Muligheten for å endre mellom de to modusene (gjennomsnittlig eller integrert) av data vurderingen er funnet på 'ExportToSpreadsheet' panel av Cell Profiler programvare.

Innstillingene analyse i 3_channels_pipeline.cppipe filen er optimalisert for bildene i eksempeldatasettet. Analyse av nye bilder sett med denne protokollen vil kreve at filnavnene vedta navnekonvensjonen beskrevet ovenfor (figur 3). Også, verdier følsomhet som passer lysstyrken nukleært DNA farging og terskler for bakgrunnenintensiteter i de nye bildesettene må kanskje justeres innenfor Cell Profiler innstillinger. Gitt nøkkelrolle DNA farging holder for å bygge de ulike bildesegmenterings masker, er anvendelsen av riktige følsomhetsinnstillinger for denne kanalen nøkkelen til vellykket analyse av nye bildedata med Cell Profiler programvare. Den medfølgende Cell Profiler innstillingsfil (3_channels_pipeline.cppipe) inneholder notater på de mest nyttige parametre for å tilpasse analysen til nye data. Disse notatene er i tekstboksen øverst på skjermen i Cell Profiler i hovedvinduet og inkluderer veiledning om hvordan du endrer følsomhetsinnstillinger og justering av antall kanaler som skal analyseres. Som tiltalt i protokoll avsnitt 2.8, for å teste innstillingene for nye bildedata kan det være nødvendig å observere bildesegmentering under bildeanalyse ved å klikke åpne 'øye' ikoner for hver av "Identifiser ... Objects 'protokolltrinn (figur S1D

Den rå produksjonen av enkelte celle data fra Cell Profiler kan analyseres i varierende måter å dekke behovene til andre studier. Vist her er bruken av et Perl skript å anvende portene til to av de målte parametrene per celle for å hjelpe til å trekke ut biologiske trender fra en datad tillatelse kryssreferanser av de identifiserte subpopulasjoner med ytterligere målinger. Selv om det er like mulig å inkludere elementer av gating innenfor rammen av Cell Profiler, den alternative ruten som brukes her gir større fleksibilitet og hastighet, spesielt hvis store datasett må vurderes. Den tregeste scenen i etter image oppkjøpet faser av gjeldende protokollen er driften av Cell Profiler programvare. Cell profiler her kjøres uten å innføre porter for å frembringe en un-gated rådatasett som kan analyseres på nytt med påfølgende Perl script raskere og, om nødvendig, iterativt med forskjellige port verdier. Ikke alle studier vil vite på forhånd egnet gate verdier som dette kan variere med reagenser på en gitt sett av data, og potensielt over tid. Det er derfor anbefalt å generere histogrammer som viser rådata distribusjon innhentet fra Cell Profiler for positive kontroller og mock-forstyrrede celler for å identifisere passende gate values for parametrene av interesse.

Perl-skript er skrevet en strengt definert kolonne struktur av data fra Cell Profiler for å akseptere og kan slutte å virke hvis en bruker endrer antall parametere produksjonen av Cell Profiler hjelp av 'ExportToSpreadsheet' innstillinger. For å gjennomføre endring av innstillingene notater er inkludert i Perl script-filer. For å se disse se manuset i en tekst editor, fortrinnsvis en programmerer tekst editor satt til fargekode Perl-elementer (f.eks http://www.activestate.com/komodo-edit). Disse notatene viser hvor du skal justere skript for å tilpasse seg endringer i dataformat. I likhet med Perl-skript, R-kode-filen som følger (analysis.r), som inneholder instruksjoner for å plotte tallene fra bildeanalyse data, kan leses i en teksteditor eller RStudio programvare for å se flere notater på bruk og tilpasning. Disse notatene kan bli supplert med informasjon om regulære uttrykk og Perl <sup> 12 og ggplot2 ¹³ pakke for R, som begge danner grunnlaget for hvordan dataene er lest, kommentert og plottet, henholdsvis.

Nye studier ved hjelp av fluorescens mikroskopi, så vel som rådata deponert med fri publikasjoner er mottagelig for analysemetoder, slik som de som er beskrevet her. Selve innholdet av høy innholdsdata gir seg til rekursiv analyse med ulike analytiske vektlegging avhengig av forskningsinteresser av enhver observatør. Selv om de spørsmål som kan bli stilt av data er begrenset av sondene opprinnelig brukt, bildedata kan ofte være menings reanalysert utenfor rammen av studiene som genererte dem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars negative control siRNA	Qiagen	1027280	Negative control siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.
Nulcease-free water (non-DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	For dilution of siRNA buffer.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfection lipid.
DMEM	Life Technologies	41966052	Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.
96 well tissue culture plate	Falcon	3072	Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.
Breathable membrane	Alpha Labs	LW2783	Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Non-ionic detergent

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	For plate wash solution.
Anti-P-S780 RB1 antibody	Abcam	ab32513	Rabbit monoclonal
AlexaFluor647 Anti-rabbit	Invitrogen	A21245	Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.
Hoechst 33342 (Bisbenzimide)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.
Permeabilization solution	NA	NA	0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.
Plate wash solution	NA	NA	Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.
Block solution	NA	NA	5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R programming environment	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/