Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Summary

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Abstract

Yapışık memeli doku kültürü modelleri hücrelerin davranışını yöneten kontrol mekanizmalarının anlaşılması gelişmeler tek hücreli analizi modları giderek daha bağımlı hale gelmektedir. Hücre popülasyonlarının gelen biyomarkerların ortalama değerleri yansıtan kompozit verileri teslim Yöntemleri çalışılan biyolojik sistemin heterojen yansıtan ICSI'nin dinamiklerini kaybetme riski. Bu doğrultuda, geleneksel yaklaşımlar yerini ediliyor, ya da yüksek içerik mikroskobu ile değerlendirmesini sağlamak için geliştirilmiştir hücresel tahlil, daha karmaşık formlar ile destekledi. Bu deneyler potansiyel özel yazılım paketleri eşlik tarafından etkin floresan belirteçler, görüntüleri çok sayıda oluşturmak hücre başına çok parametrik ölçümler için izin verir. Bununla birlikte, nispeten yüksek yatırım maliyetleri ve bu cihazların çoğunun aşırı uzmanlaşma birçok araştırmacı için erişilebilir önlemiştir.

Burada tarif a,floresan mikroskobu görüntüleri ile kullanım için uygun olan tek tek hücrelerin özel hücre içi bölgelerde birden fazla floresan markör yoğunluklarının ölçülmesi için evrensel olarak geçerli bir iş akışı. Bu iş akışı Key floresan işaretleyici yoğunluğunu bu görüntüler tek tek hücrelerin, hücre içi tanımlanan bölgelere bölüm ayırt ve teslim serbestçe kullanılabilir Hücre Profiler yazılımı ¹ uygulanması bu bölgelere özgü değerler olduğunu. görüntü verileri tek tek hücre yoğunluğu değerlerinin ekstraksiyon bu iş akışının merkezi amacı ve yapışık insan hücrelerinde G1 kontrol noktası düzenleyiciler için bir siRNA ekranından kontrol verilerinin analizi ile izah edilecektir. Bununla birlikte, burada sunulan akışı hücre pertürbasyon diğer araçlarla sağlanan verilerin analizi uygulanabilir (örneğin, bileşik, ekranlar) bu ve floresan bazlı hücresel belirteçlerinin diğer formları ve laboratuarlar arasında geniş bir aralığı için yararlı olacaktır.

Introduction

Burada sunulan çalışma tek tek hücreler ve belirlenen hücre içi bölgeleri belirlemek için yapışık hücreler floresan mikroskop görüntüleri algoritma güdümlü dökümü yapmak için serbestçe ulaşılabilen yazılımın Celi Profiler kullanımını tarif eder. Bölütlemesi olarak adlandırılır bu yaklaşım, her bir hücre ya da (haliyle bölümlere ayrılmış nesneler adlandırılır) hücre içi bölgesinde lokalize floresan işaretli belirteçleri miktarının tarafından görüntüsü hücrelerin daha sonra çok parametre analizi sağlar. Bu iş akışı, yüksek içerik analizi sağlamak için bir temel oluşturur ve daha gelişmiş ve çok parametrik uyacak şekilde modifiye, bireysel hücre özel yüksek-içerik araçların veya tescilli yazılım erişimi olmayan laboratuvarlarda analizleri edilebilir bir araç olarak hizmet etmek amaçlanmıştır. Bu yazının birlikte verilen dosyalar açıklanan analiz oluşturmak için ilgili ham görüntü verileri, algoritma ayarları ve destekleyici komut bir deney seti bulunmaktadır. verilen algoritma ayarları fveya Hücre Profiler ayarlamak örnek veriler ve ayarlar diğer çalışmalardan görüntü verilerinin kullanılmasını sağlamak için gerekli olabilir ne Tartışma bölümünde detayları için optimize edilmiştir.

Nicel veri Hücre Profiler kullanarak ekstre edildikten sonra, farklı laboratuvarlar ham veri bireysel hücre değerleri tarafından sunulan bilgilerin nasıl kullanılacağı için farklı gereksinimleri olabileceğini; Burada gösterilen girişler her bir deney için ham verilere uygulanan geldiği bir yaklaşımdır. Bu kapıları kullanarak, veri kapıları tarafından tanımlanan yanıtı geçiren hücrelerin alt popülasyonlar farklı tedaviler bağlayan eğilimlerin görselleştirme izin yanıt ikili açısından dönüşür. kapıları ilgili her ölçüm için uygun negatif ve pozitif kontroller için elde edilen verilerin dağılımlarının gözlemlerine dayalı ayarlanır. kapıları kullanımı, ham, hücre bazlı ölçümler yönetmek için nasıl sadece bir örnektir. Ayrıca burada gösterilen nükleer DNA yoğunluğu kullanımı benikapılı veriler ile bir arada değerleri sürekli bir dizi olarak, ham formunda asurements. Görüntü analiz verileri yönetmek Diğer yaklaşımlar çalışmanın niteliğine bağlı olarak, dikkate alınmalıdır; alt popülasyonlar hücreleri atanması için kapılarını kullanarak istatistiksel alternatifler parametrelerin çok sayıda ³ bildirilmiştir genelinde yüksek içerik verileri özetlemek için stratejiler ² ve sistematik karşılaştırmalar bildirilmiştir.

^{6 -} Görüntü verilerinin yüksek içerik analizleri ilaç yanıtının hücresel çalışmalarda kullanılmasını bulduk, genetik ve çevresel stres sinyalizasyon ⁴ ters. yüksek içerik analizi hak floresan mikroskop verilerinin analizi algoritmik nicel ve mekansal parametreler tek tek hücrelerin ⁷ genelinde eş zamanlı olarak dikkate alınması izin vermesinden kaynaklanıyor. Bu şekilde, birçok tahlil için hücresel sonuçları analiz: d çapraz referans diferansiyel davranış olabilirefined hücre alt popülasyonlar morfolojik değişkenlerin dikkate içerebilir deneysel koşullar ve tahlillerde izlenebilir. stratejileri ve analiz iş akışı diğer yüksek-içerik yaklaşımlar gibi, bireysel hücrelere çapraz başvurulan çoğaltılmış veri sunma yeteneğine sahiptir, burada ele. Floresan mikroskop görüntüleri oluşturmak ve binlerce görüntü kadar düşük kapasiteli geleneksel floresan tabanlı mikroskopi üretilen görüntülerin onlarca arasında değişen verilerin analizi için geçerli olan Yüksek içerik yöntemleri takım çalışmalar otomatik yüksek içerik tarama platformları kullanarak üretti.

akışı ayrı deneyler nükleer floresan markörü şiddet ya da sırasıyla, bir flüoresan raportör proteininin çekirdek / sitoplazmik translokasyon ya bakımından ölçüldüğü, örnek veri ile burada gösterilmiştir. iş akışı, bu deneyler, ayrı ayrı olarak ya da kombinasyon halinde EAC bağlı olması ile esnekh farklı araştırmacılar tarafından araştırma sorusunu verilen. örnek, veri RNA interferans (RNAi), deney (Şekil 1) bir parçası olarak üretilmektedir. Susturucu RNA oligonükleotidleri (siRNA), sikline bağımlı kinaz (CDK) aktivitesinin iki floresan haberci için değişikliklere neden HCT116 insan kolorektal karsinom hücrelerinde spesifik proteinlerin demonte etmek için kullanılır. Serin nükleer retinoblastoma 780 (p-S780 RB1) olarak CDK6-bağımlı fosfatlamanın antikor lekelemesi yoluyla değerlendirilir. Aynı hücrelerde, CDK2 aktivitesi (GFP CDK2 raportör) yeşil floresan protein etiketli raportör CDK2 etkinliğinin olmaması raportör çekirdekten sitoplazmaya ve CDK2 aktivasyon servisleri üzerinde bulunan sitoplazmik oranı nükleer değerlendirilir ^8. Buna ek olarak, her bir hücrenin nükleer DNA, bir DNA-ara boya kullanılarak lekelenmektedir, görüntüler çekirdek sınırları hücreleri belirlenmesi ve tanımlanması için bir araç olarak hizmet eder bisbenzimid, hem de birDNA, bolluk hücrenin hücre döngüsü durumuyla ilgili bilgileri sağlayan (Şekil 2) sa ölçer.

CDK6 ve CDK2 faaliyetleri hücre döngüsünün ⁵ S fazına G1 hücre geçiş tespit edilebilir ve bu, tek tek hücrelerin iki muhabir arasında yakın bir uyum beklendiği gibi, birbirine ^9,10 başarılı ve. Burada kullanılan gösterim veri kümesi siRNA etkisi CDK6, retinoblastom proteini (RB1) ve bir hedefleme negatif kontrol (Tablo 1) hedef bir örnek olarak analiz eder. CDK6 demonte p-S780 RB1 epitopunun bir azalmaya ve hücre döngüsünün G1 fazında hücrelerin birikmesi hem ortaya çıkarmak gerekir. RB1 Knockdown fosfo-S780 antikorunun özgünlük için bir reaktif kontrolü olarak hizmet vermektedir. Formalin floresan mikroskop görüntüleri floresan lekeli HCT116 doku kültürü hücreleri, algoritmik görüntü analizi için kullanılan, ¹¹ sabit. Elde edilen sayısal veriler için kullanılançapraz-referans muhabirleri ve farklı demonte devletlerin etkisini ölçmek.

Bu tür bir analiz tarafından üretilen verilerin potansiyel büyüklüğü normal analiz araçları bir meydan okuma sunabilir. Örneğin, bireysel hücre veri bazı elektronik tablo yazılımı karşılayacak daha büyük olabilir. Büyük veri setleri analizi yardımcı veri basit, yüksek tekrarlayıcı, denetimli işleme gerçekleştirmek Perl scriptleri dahildir. Perl script Belirli bir dosya adlandırma kuralı (Şekil 3) ile görüntü dosyalarını işlerken Hücre Profiler tarafından üretilen çıktı dosyaları için özel olarak yazılmış, ve analiz kullanılmak üzere kuyu başına alanların değişken numaralar için izin verir. Bu hücre alt ⁵ trendleri izlemek için kapı bireysel hücre deneyi verilerine sık önemlidir ve burada gösterilen her tahlil türü için önceden belirlenmiş bir dizi kapısı dayalı her hücre bayrak bir Perl script kullanımıdır. Da dahil isteğe Perl komut vardırhangi bireysel kuyuların (veya koşullar) veri sonuçlarını özetlemek, teslim: set kapısı içindeki hücrelerin ve ham tahlil puanları ortalama değerlerin yüzdesi. yanıtları tamamını veya bir kuyu içindeki hücrelerin çoğunluğunu etkileyen durumlarda veri görüntüleme ikinci, daha homojen şekilde geçerlidir. Yukarıda ele alındığı gibi, bu gibi değerlendirme yanıt olarak bir popülasyon içindeki hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı tek tek hücre veri gating ile elde daha az kullanışlıdır.

açıklanan iş akışı programı siRNA veya tarif işaretleyici deneyleri ile pertürbasyondan sınırlı değildir. Çalışmalar siRNA kombinasyonu, kimyasal inhibitörleri ve radyasyon tedavisi ile doku kültürü deneyleri ve CDK6 dışındaki belirteçler ve CDK2 aktivitesi ⁵ değerlendirilmesi için yanıtları analiz etmek için, bu yaklaşımı kullanmışlardır.

Kavramsal olarak, deneysel strateji biyolojik kullanışlı hücre içi bölgelerde çeşitli otomatik kayıt sağlarfloresan mikroskop görüntüleri mevcut olan tek tek hücrelerde. Gibi, bu yaklaşım nüfus ziyade bireysel hücreler üzerinde odaklanmak teknikleri ile atlanabilir nicel, çoğaltılmış veri ortaya biyolojik bilgiyi elde edebilirsiniz. Küçük modifikasyonlar ile tarif edilen bir yaklaşım ve analiz akışı bir floresans bazlı deney çıkışları ve hücre-biyolojik yanıtlar, kantitatif, tek tek hücre veriler sağlayabilir burada DNA içeriğinin nicel değerlendirme, çekirdek ya da sitoplazmik floresan ölçümü ya da bunların arasındaki belirteçlerin mekik İki bölme, ya tek tek ya da bir çok katlı bir şekilde ilgi çekmektedir. Yayınlama gereksinimleri artan bir şekilde yayınlanmış verileri yeniden analiz isteyen laboratuvarlar da doğrudan ilgilendiren olacak burada anlatılanlar gibi açıkça erişilebilir ham verilere erişimi ve mikroskopi görüntü analizi için ücretsiz araçlarımızdan ile aşinalık sunulması doğru eğilimi gibi.

Protocol

Tepki markerleri 1. Deneysel Perturbation ve Hücre Etiketleme (Ters Transfeksiyon siRNA Ekran)

1. Steril doku kültürü başlık pipet olarak steril, düz 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına 1x siRNA tampon maddesi içinde 200 nM siRNA 70 ul. Serumdan yoksun DMEM ortamı kullanılarak 40 hacim içine transfeksiyon lipid seyreltilir ve her bir oyuğa içeren siRNA içine 105 ul akıtın.
   Not: serumsuz DMEM 10.5 ml 262.5 ul lipid seyreltilmesi oyuk başına lipit 2.6 ul teslim siRNA bir bütün 96 oyuklu bir plaka için uygun olan bir ana karışımı elde edilir. Bu aşamada 200 nM siRNA başlangıç ​​konsantrasyonunun kullanımı adım 1.3 içinde 20 nM'ye bir çalışma konsantrasyonunu sağlar, ancak prosedürler göre ayarlanır başlangıç ​​konsantrasyonu (yani 50 nM), 5 nM kadar konsantrasyonlarda çalışmak için çalışacaktır. Onlar-hedef yanıt büyüklüğünü azaltabilir, ancak alt çalışma konsantrasyonu üzerinde Kalkanı artmasına yol açan, hedef dışı yanlış pozitif puanları azaltabiliryanlış negatif oranları t.
2. Oda sıcaklığında on dakika boyunca hafif bir titreşim plakasına karıştırın. Üç adet 50 ul verecek şekilde 175 ul Alt bölme şeffaf bir baz ile, 96 kuyucuklu plak tedavi opak, doku kültürü üzerine hedef başına çoğaltır.
3. 50 ul lipid siRNA kompleksleri doğrudan% 10 serum ihtiva eden 150 | il DMEM içinde oyuk başına 8,000 hücre dağıtarak Arka transfeksiyonu. Kullanım HCT116 insan kolorektal hücreleri stabil CDK2 aktivitesinin ^5,8 raporlama GFP-etiketli işaretleyici ifade. Daha başka bir karıştırma gereklidir. Nem kontrol etmek ve plakanın 'kenar etkileri önleyerek ve 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içine plaka yerleştirmek için steril, yapışkan nefes alabilen membran ile plaka kapatın.
4. Ortam küçük bir artık miktarı kuyu kalmasını ortamı, aspire. Her çukuruna% 4 tamponlu formaldehid 100 ul ekleyerek hücreleri saptamak ve oda t, 10 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde inkübeemperature.
5. Plaka aspire sabitleme çözüm çıkarın. Ya da bu noktada, plaka daha sonra 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkanarak deney durdurma bir haftaya kadar 4 ° C'de karanlıkta 100 ul PBS altında sızdırmaz kılınmış ya da devam depolamak hücre permeabilizasyon.
   NOT: Biz tespit sonrasında kısa sürede işleme tabak tavsiye ve genellikle tam işlenmiş plakalar depolama tercih. Örneğin timerosal, sodyum azit ya da ticari alternatif olarak biyosidal koruyucu micoroganismal büyümesini önlemek için eklenebilir. Fosfataz inhibitörleri ilave edilmesi, fosfo-epitoplar korumak için yardımcı olur, ve diğer yollarla ilgili deney bağlamlarda yararlı olabilir protein modifikasyonu durumlarını muhafaza
6. Plaka PBS çıkarın ve permeabilizasyon çözeltisi 100 ul ekleyerek hücreleri geçirgenliği. Çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir MultiCH kullanarak permeabilizasyon çözüm aspirefrekanslarını pipet. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
7. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 100 ul blok çözeltisi eklenerek hücrelerin bloke eder. Daha sonra, oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat süre ile blok çözeltisi içinde 500 kat sulandırılmış anti-p-S780 RB1 antikorun 50 ul prob, plaka aspire blok çözeltisini çıkarın.
8. 5 dakika her plaka üzerinde bir solüsyon, 100 ul plaka yıkama çözeltisi ile plaka üç kez yıkayın. Kromatin spesifik DNA boyası bisbenzimid 2 uM ile takviye edilmiş blok çözeltisi içinde 50 ul floresan etiketli ikincil antikor seyreltildi 1000 kat ile 4 ° C'de bir gece boyunca karanlıkta plaka kontrol edin. 4 ° C'de karanlıkta 100 ul PBS altında, önce ve mağaza sızdırmaz olarak plaka üç kez yıkayın. Görüntü iki hafta içinde plaka.

2. Görüntüleme ve Görüntü Segmentasyon

1. Ayrı almak için 20X amacı ile bir konfokal veya eğirme disk floresan mikroskop kullanın 16-bit, DNA boya, GFP ve bağışıklık boyama floroforlar karşılık gelen üç kanalda gri tonlama TIFF görüntüleri. Örtüşmeyen görüntü setleri birçok oyuk başına görüntü, çerçeveler gibi burada yaklaşık 1,000-2,000 hücreleri sevk yakalayın.
2. Her dosya adı 'deney adı', 'iyi adresi', bu sırada 'çerçeve sayısı' ve 'kanal tanımlayıcı', (Şekil 3) eşsiz bir birleşimi olduğunu, böylece sistematik görüntü dosyaları adlandırın. örnek veri seti "Mavi" (kromatin, DNA boyama) ya da "Yeşil" (GFP) ya da "Kırmızı" kanal belirleyicileri olarak (immün lekeli fluorofor) kullanır. kuyu adresi, çerçeve sayısı ve kanal tanımlayıcı ayrıca üzerinde görüntü meta olarak adlandırılır. Kafa karıştırıcı kuyu ve çerçeve meta önlemek için çizgi sembolünü kullanın.
3. Belirtilen sırayla bu meta elemanları ile dosyaları adlandırın. Bu sonraki yazılım adımları CORRE sağlamak için gereklianaliz için görüntülerin ctly grup setleri.
4. Ücretsiz Hücre Profiler indirin ve yükleyin, Aktif Perl Community Edition, R istatistik programlama ortamı ve RStudio. Kurulum sırasında tüm varsayılan seçenekleri kabul; Aktif Perl yükleme PC kullanıcıları istendiğinde nerede PATH, dosya uzantısı dernek ve komut dosyası eşlemesi ile ilgili tüm seçenekleri etkinleştirmeniz gerekir. Aktif Perl Mac kullanıcıları için isteğe bağlıdır, ama onlar başka türlü Terminal komut satırından adım 3.2 yerine simge tıklayarak kullanarak Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir.
5. 'Dosyasından' 'Dosya' sonra, 'İthalat Boru Hattı' tıklayın, Hücre Profiler yazılımı açın ve dosya 3_channels_pipeline.cppipe (Şekil S1A & S1B) seçin. Dosya açıklanan dosya adı kongre görüntü dosyası meta yorumlamak yazılımı için gerekli talimatları içerir. Hücre Profiler artık inci nükleer DNA ve antikor yoğunlukları ayıklar, görüntüleri ilgilidirese ve her hücrenin tespit (Şekil 4 ve 5) sitoplazma yoğunluğu karşı nükleer oranını hesaplamak için GFP kanalını kullanır.
6. Hücre Profiler penceresinin sol alt köşesindeki düğme 'isimli çıkış ayarlarını tıklayın. Yeni Ekranın üst kısmında 'Varsayılan Giriş Dosya' ve 'Varsayılan Çıktı Klasörü' etiketli metin kutuları vardır. Bir kerede, bu kutuların sağındaki klasör-simgeleri tıklatın ve (S1C Şekil) sırasıyla ekstre veriler, analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve hedefi seçin.
7. Hücre Profiler sol alt köşesindeki 'Analiz Görüntüler' düğmesine basarak görüntü analizi başlayın. Ekranın alt kısmında veri çıkarma, 'Dur Analizi' ve 'Pause' düğmeleri için kalan zaman gözlemlemek. Gerekirse yararlı herhangi bir zamanda, en 'Pause' düğmesine seçerek analiz duraklatmakGörüntüleri izlerken analiz edilirken (adım 2.8 tarif).
8. İsteğe bağlı olarak, program penceresinin (Şekil s1d) sol uç panelde göz simgeleri tıklayarak görüntü analiz herhangi bir aşaması için pencereleri açın. Hücre Profiler geçerli ayarlar görüntü segmentasyonu uygundur gerçekleştirmek (bu ayarlarını değiştirerek tavsiye için Şekil 1 ve Tartışma bakınız) kontrol etmek için 'IdentifyPrimaryObjects' penceresini ve 'Ortaöğretim' ve 'Tersiyer Nesneler' için bu gözlemleyin.
9. Analiz tamamlandığında görünen ileti kutusunda 'Tamam' ı tıklatın. Sonuçları ile tüm veri dosyaları virgülle ayrılmış değer (.csv) dosyaları (Şekil S2A) olarak kaydedilir yerin 'Varsayılan Çıktı Klasörü' gidin.

3. Veri çıkarımı

1. Arasında yer almaktadır yeni bir dosya 'Nuclei.csv', bulHücre Profiler çıkışı. Bu dosya floresan nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP-CDK2 muhabiri oranı değerleri (Şekil 6A ve S2A) için ayrı ayrı hücre verileri içerir.
   NOT: Farklı laboratuvarlar kendi testlerin doğasını uygun veri bu tür işlemek isteyeceksiniz. Antikor verileri ve sağlanan Perl betiği '2_gate_classifier.pl' kullanarak GFP-CDK2 muhabiri değerlerine göre her tedavi durumundan hücrelerin yolluk güncel veriler için Önerilen.
2. 'Nuclei.csv' veri dosyası (Şekil S2A) aynı klasöre verilen Perl komut dosyasını '2_gate_classifier.pl' kopyalayın. Çift tıklatın Perl komut simgesini ve istendiğinde, hücreler antikor nihayet kapı değerleri kapı ve edilecek olan dosya için bir '.csv' dosya adından sonra veri dosyasının tam adını yazınfloresans ve GFP-CDK2 raportör verileri.
   NOT: esas kapı ayarlarını belirlemek ve verilerin analizi için bu uygulama nasıl Temsilcisi Veri bölümünde ve Şekil 6 aşağıda açıklanmıştır (veri sağlanan kullanım '0.004' ve sırasıyla '1.5', analiz). Mac kullanıcıları yazarak Terminal komut satırından Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir: 'perl 2_gate_classifier.pl'.
3. Her kuyudan her hücre hem kapıları (Şekil 6C) karşı nasıl performans gösterir alt-nüfus etiketleri ile orijinal Hücre Profiler verilerinden ham bireysel hücre deneyi değerleri birleştiren yeni oluşturulan dosyayı gözlemleyin.
4. RStudio yazılımını açarak bireysel hücre ICSI'nin etiketleri kullanarak her deneysel koşul için veri çizilir. 'Dosya' ve 'Dosya Aç' ı tıklatın sonra verilen 'analysis.r' dosyasını seçin. Şekil 6B çizmek için komutları uyun, (Şekil S2B) sol üst pencerede trong> 7 ve 8. Sol üst pencerede, çizgiler 5 ve 6 çift tırnak sembolleri arasında, Geçitli verileri içeren klasörün bilgisayar adresini yazın. (": / Analiz klasör / analiz çıkışı C" ve "nuclei_gated.csv" örneğin,) sürücü harfini ve sırasıyla dosyanın kendisi, adını ekleyin.
   NOT: RStudio belirli bir bilgisayarda ilk kez kullanılıyorsa, R grafik paketi 'ggplot2 ilk yüklü olması gerekmektedir. Bu, adım gereksiz hale bundan sonra RStudio yeni bir kurulum için bir kez tek bir adımdır. 'Ggplot2' yüklemek için, RStudio sağ alt köşesindeki pencerenin üzerinde 'paketler' olarak adlandırılan sekmesini tıklatın Bu altında görünen 'Install paketleri' butonuna tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. 'Paketler' ın içine Tipi 'ggplot2' (atlayarak alıntılar)Bu yeni pencerede hızı ve nihayet adım 3.6 devam etmek için, pencereyi kapatmak gerekli ggplot2 fonksiyonları yüklemek ve ana RStudio penceresine dönmek için "Install" butonuna tıklayın.
5. RStudio sol üst pencerede 17 üzerinden satırları vurgulama 1, daha sonra 'Run' düğmesine tıklayın. Bu R (Şekil S2C) deneysel veriler, eşik değerleri ve iyi konum bilgilerini girecek. R şimdi geçici olarak komplo için ilgili verileri yapacak.
6. Hat 17 altında kalan kod bireysel blokları vurgulayın ve daha önce olduğu gibi 'Çalıştır' düğmesine tıklayarak gelen araziler oluşturmak. RStudio sağ alt köşesindeki pencerede araziler gözlemleyin ve 'İhracat' düğmesine (Şekil S2D) tıklatarak biçimlerinin numarasını kaydetmek.
7. RStudio kapanış yaparken, istendiğinde 'Kaydet etmeyin' tıklayın. Bu aksi takdirde veri yapacak RStudio sonraki kullanımı, karışıklığı önlerBir önceki oturumdan.

Representative Results

Görüntülerin set örneği için hazırlanmıştır ters-transfeksiyon siRNA tarama protokolü kullanılarak oluşturulan ve Hücre Profiler yazılımı kullanılarak analiz edildi. Elde edilen sayısal ham veriler, her hücre ayrı ayrı izlenebilir geri görüntü ve iyi kökenli, temsil ve çeşitli floresan yoğunluğu parametreleri (Şekil 6A) için ölçülür şekildedir. P-S780 RB1 antikor ve DNA boya tanımlanmış çekirdek maskeleri için entegre edilen DNA yoğunluğu ortalama nükleer floresan yoğunluğu, tanımlanan her bir hücre için belirlenir. Her hücrenin çekirdeği ve sitoplazma bölgeler için GFP yoğunluğu değerleri ortalama da GFP-CDK2 muhabiri sitoplazmik floresan karşı nükleer hesaplama izin kaydedilir. Bu algoritmik floresan yoğunluğu ölçümleri kullanım Alt iki deneyleri, nükleer antikor lekelemesi ve GFP-CDK2 muhabir kapılarını tanımlamak için bu bağımsız hücre verileri yapılır. Inci hücrelerin sonraki açıklamaDeney sonuçları ve belirli bir alt-popülasyonunu sağlamak için bu etiketlerin kullanımı temelini, daha ayrıntılı olarak anlatılmıştır, bir üçüncü ölçme (nükleer DNA içeriği) ile karakterize edilmektedir.

Her deney için toplanan ham floresan yoğunluğu verilerinin Histogram araziler hücre alt popülasyonlar farklı koşullar altında nasıl davrandığını değerlendirmek etkili bir yoldur. Şekil 6B'de histogramlar her RNAi demonte durum için üç kopya halindeki gözlerin tek tek hücre veri nüfus dağılımlarını gösterir. Sol tarafta nükleer antikor yoğunluğu ve sağdaki veri GFP-CDK2 muhabir için ilgili verileri vardır vardır. P-S780 RB1 antikor veri hücreleri genel olarak, bu post-translasyonel modifikasyon açısından ve S780 üzerinde fosforile RB1 kaybı ile hücre popülasyonları, iki popülasyonunda mevcut zenginleştirilmiş çekirdek yoğunluğu bir sol pik olarak ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir CDK6 siRNA tarafından devrilen zaman. Bu aynı sol tepeRB1 kendisi protein ve böylece P-S780 RB1 boyama düpedüz kaldırılmasını yansıtan, RNAi hedef olduğunda görülür. Bunun tersine, aynı hücreler için aynı deney koşulları, GFP CDK2 haberci deneyi ile gözlendiğinde, tek tek hücre verileri farklı dinamik göstermektedir. Sürekli bir dağılım, sadece tek bir tepe noktası ile gözlenmiştir fakat hücre döngüsünü (siCDK6) de etkiler ve (diğer bir deyişle dağıtım sağ omuz uzantısı G1 fazındaki sonuçlarında birikimine neden olur siRNA, yani bir gösteren hücrelerin gelişmiş varlığını gösteren Nükleer / sitoplazma oranı GFP artış) X ekseni üzerinde çizilen.

Şekil 6B histogram tahlil verilerinin her iki setleri dağılımları temelinde seçilir kapı değerleri (dikey çubuklar) vardır da gösterildiği. maksimum genişliği konumunu ana sol omzunda: P-S780 RB1 antikor verileri için kullanılan kural yarı-yükseklik gibi kapı konumunu tanımlamak içinNegatif kontrol hücre veri dikkate alındığında (sağda) tepe (siRNA olmayan hedefleme). Veri kırmızı Bu kapı ile tanımlanır düşük ve devamsızlık P-S780 RB1 ile hücreler vurgulanır. Oran değeri, dağılım ters omuz üzerine yerleştirilmiş benzer bir kapı GFP CDK2 muhabir kullanılır. eksikliği veya özellik azaltılmış CDK2'nin etkinliği ortaya çıkan yüksek oran subpopülasyonu hücreleri, yeşil gösterilmiştir. İki testlerin çoklu analiz göstermek için Şekil 6C aşağıda açıklamalı dosya halinde ham veriyi (Şekil 6A) dönüştürmek için 2_gate_classifier.pl Perl kullanarak iki kapı değerlerinin uygulanmasını gösterir. Bu yeni dosya (sırasıyla, kullanılan antikor veri 0.004 ve GFP-CDK2 muhabiri için 1.5 bu durumda kapılarında) her hücre için sınıf etiketleri yeni bir sütun ve bunları ayırt etmek için kullanılan iki kapı değerleri yanında özgün verileri içeren .

F bireysel hücrelerin sınıflandırılmış olmasırom bu tahlil verilerinin arsa şerhi yardımcı olmak için bu sınıf etiketleri kullanmak artık mümkün iki tahlillerin temelinde her devirme durum. 7 gösterileri P-S780 RB1 ve GFP- için bireysel hücre veri araziler dağılım Şekil Üç RNAi koşullar için ayarlanır, örneğin veri CDK2 tahlilleri. Scatterplots üzerinde kadran annotating Numaraları o yok etme bağlamında için bütün her kapı alt populasyonun göreli yüzdelerini göstermektedir ve yukarıda anlatılan sınıf etiketleri kullanılarak R oluşturulur. Bu grafikler, siRNA (Şekil 7B), siCDK6 ile transfekte edilmiş hücreler, bir net veri dağılımı ortaya olmayan hedefleme ile transfekte edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında (serin 780 de RB1 fosforilasyon olmadığını gösteren) ve sağ y-ekseni üzerinde aşağı doğru her iki kaymış ortaya koymaktadır X ekseni üzerinde (Şekil 7C, düşük CDK2 aktivitesi gösteren). Bu kaymaların ikisi de bu hedefin demonte için bekleniyor. SiR bu tersine, veriB1 transfekte edilmiş hücreler GFP üzerinde büyük bir etki göstermektedir, siRNA olmayan hedefleme ile transfekte edilmiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında CDK2 raportör için veri dağıtım içinde (Şekil 7A) epitopunun kaybı uygun olarak antikor boyama kaybı gösterir, ancak çok az etkisi -CDK2 raportör RB1 demonte ortaya çıkar.

Ayrıca bireysel hücre veri, subpopülasyonu sınıflandırma ve tahlil çoğullama Şekil 8 kullanımını araştırmak için entegre DNA yoğunluğu Şekil 7C yanında eşleştirilen histogram profillerinden siCDK6 veri dağılım grafiğini göstermektedir. histogramlar çiftleri antikor yoğunluğunun (ScatterPlot hakkı) veya GFP-CDK2 muhabiri oranı değerleri (ScatterPlot yukarıda) ya göre bölünmüş, tüm nüfusun karşıt yarısı, ilgilidir. Bu nüfus nükleer DNA yoğunluğu miktarının belirlenmesi, sırasıyla, sol ve sağ zirveleri gibi 2N ve 4N DNA içeriği karakteristik iki tepe gösterir. benŞekillerde gösterilen kapılarının ntentions 6, 7 ve 8, hücreler, P-S780 RB1 gibi düşük tanımlanan şekildedir (etiketli P S780-) ya da GFP CDK2 muhabir yüksek oran değeriyle (etiketli G1) olacak hücre döngüsünün G1 fazında olabilir. Gerçekten de, bu deneylerin herhangi biri ile tanımlanan alt popülasyonları için DNA profili histogramları ağırlıklı 2N DNA içeriğine sahip hücrelerin içerir. Karşıt kapı nüfusun DNA profilleri (etiketli P-S780 + veya olmayan G1) 2N gelen 4N arasında dağılımına sahip hücreleri içermektedir, bu hücreler, hücre döngüsünün bir dizi kabul uygun olarak sonrası G1 fazı konumlandırır.

Burada odaklama üretimi ve floresan lekeli görüntüden gelen tek tek hücre veri analizi yapılmış olmasına rağmen, bu kez tekrarlanmış ve performans arasındaki farkı izlemek için bu bilgileri almak ve iyi yan oyuk olarak her bir deney özetlemek edebilmek için de yararlıdır Verilerin bir bütün plaka üzerinde belirli bir deney için tüm oyuklara arasında. A uygulanan kapıları içinde yüzde hücreleri için üç kopya halindeki gözlerin elde edilen ortalama değerler olarak özetlenen her bir siRNA tedavi verileri) p-S780 RB1 veri ve B) GFP CDK2 raportör verileri gösterir. A ve B çizilen değerleri bu yazının ile sağlanan iki ek Perl script tarafından üretilen; Sırasıyla 'antibody_fluorescence_summary.pl' ve 'G1assay_summary.pl'. Bu komut de) i olarak başına ölçülen toplam hücreleri de başına ham Hücre Profiler (Nuclei.csv) tarafından oluşturulan veri ve rapor verilerini kullanmak, ii) kapının içindeki hücrelerin sayısı, iii) kapısı içinde yüzde hücreleri ve iv) aritmetik iyi ki ölçülür, ham veri anlamına gelir. Gösterildiği gibi bu deney verilerinin büyük setleri arasında seyir için uygun bir seçenek, önce tek tek hücre veri çoğaltılmış değerlendirmesini kullanarak bireysel tedavi verilerine odaklanan olarak dahil edilmiştir 8 Şekil. çizelgeleri Şekil 6B histogramlar P-S780 RB1'in ve GFP-CDK2'nin veri görülen normal olmayan veri dağılımları uygun analizlerde, için 'kapısı içinde iii) yüzde hücrelerini' Burada arsa görüntülenir. Bu komut ayrıca hesaplamak 'iv) de ölçülen, ham verilerin aritmetik ortalaması' homojen nüfus yanıtları öncesi ve deneysel bozulduktan sonra normal veri dağıtımı için veri analizi uygun olur.

Şekil 1:. Kantitatif floresan etiketli mikroskop görüntü verilerini analiz etmek iş akışı adımların Bakış iş akışı dört adımlar olarak burada temsil edilir (A) Önce deneysel floresan görüntüleme için hücreleri hazırlamak için gereklidir.. Burada tarif edilen örnek arasında olmasıdırsiRNA ile muamele edilmiş yapışkan insan tümör hücreleri, bir 96-yuvalı doku kültürü plakasında, 48 saat süre ile üretilir ve sabit lekeli edildiği ekranı. Farklı RNAi koşullar plaka içinde ayrı kuyu üç kez mevcuttur. Hücreler, bir DNA boyası, CDK4 ile fosforile RB1 ve 6 seçici hedef site serin-780 (P-S780 RB1) 'e özgü antikor ile boyanmış ve bu da kararlı bir şekilde G1 hücre döngüsü çıkış bildirdiği bir GFP CDK2-muhabir eksprese eder. Toplu bu floresan sondalar iki tahliller ayrı iş akışı içinde değerlendirilir oluşturmaktadır. (B) her floresan prob (kanal) için Paralel mikroskop görüntüleri oluşturulan ve görüntü analiz yazılımı verileri organize edebilirsiniz hangi ayrıntıları içerecek gibi adlandırılır. (C) görüntü dosyaları algoritmik üç floresan sondalar tespit için yoğunluk ölçümleri elde önce tek tek hücrelerin ve çekirdeklerin ilişkili çiftlerini ve sitoplazma tanımlayan Hücre Profiler yazılımı, içine yüklenirHer ed. (D) Son olarak, bir Perl betiği üretilen ham nicel verileri düzenlemek için kullanılır. Bu adım etkin bir şekilde izlenmesini ve çapraz sorguya, çizilebilir alt popülasyonlar içine hücreleri, binning, her bir hücre için floresan yoğunluğu verilerine kapıları geçerlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Deney verileri resim analizi ile elde edilen sabit olmak üzere, siRNA ile muamele edilmiş, floresanla işaretlenmiş hücreleri görüntülenmiş ve karşılık gelen yoğunluk ölçümleri hücre başına alındı ​​ayarlamak, örneğin veri.. Örnek görüntü verileri, görüntü analizi sırasında kaydedilen her bir parametre için gösterilir (A) Nükleer çekirdekteki DNA, yoğunluk:., Nükleer DNA boyanın boyama yoğunluğu için kullanılan çekirdeğin başına DNA bir önlem verim (B) fosfo-RB1 Nükleer yoğunluğunu:. Immuno-boyanarak birincil (siyah) antikor kullanarak ve floresan ikincil antikor (kırmızı) etiketli bir RB1 fosforilasyon bir yoğunluk ölçümü etkinleştirmek P-S780 RB1 için özel . çekirdeğin başına S780 (C) GFP-CDK2 muhabiri: stabil hücre döngüsü ile bir dizi desen nukleus ve sitoplazma arasında translocates GFP-etiketli muhabiri proteini ifade kullanılan hücreler. Her bir hücre için eşleştirilmiş çekirdek ve sitoplazmik GFP yoğunluğu çift ölçüm hücre döngüsünün geri kalanı G1 fazı ayırt etmek için kullanılabilir, hücre başına bir oranda hesaplanmasına izin verir. Üç SiRNA hedefleri analizi göstermek için kullanılacaktır; Bir negatif kontrol siRNA olmayan hedefleme; RB1 fosforilasyonu ve hücre döngüsü ilerlemesini bozucu bir pozitif kontrol olarak CDK6 siRNA; RB1 siRNA antikor özelliklerini kurmak.k "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3: Organizasyon görüntünün görüntü analiz öncesi dosyaları doku kültürü plakası alınan görüntüleri, görüntü analizi yazılımı özgün deney bağlamında görüntü verilerini ilgili izin vermek için sistematik olarak adlandırılır.. Bu bilgiler her resim için dosya içinde yer alıyor. (A) de deney plaka üzerinde her gibi farklı RNAi hedefleri ya da tedavi, dosya iyi adresi formları parçası tekabül edebilir. (B) kare numarası dosya parçasıdır . Her iyi çoklu, örtüşmeyen kare (C) toplamak için görüntülü olarak her çerçeveden Floresan sondalar ayrı görüntülü; dolayısıyla dosya isimleri de her görüntü ile ilgilidir hangi kanalın yansıtması gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. Celi Profiler kullanımı nükleer DNA ve antikor lekeleme ölçmek üzere, boru hattı dosyasındaki ayarlar (3_channels_pipeline.cppipe), nükleer DNA ve Hücre Profiler görüntü analiz yazılımı önlemler floresan yoğunluk değerleri ile tek tek hücreler ile ilgili antikor bağlayıcı . (A) çekirdekler lekeli DNA 'mavi' kanal görüntüde tespit edilir. (B) < / Strong> DNA lekeli çekirdeklerin pozisyonları geçici bir 'Çekirdekler maske' düzenlenmektedir. Çekirdekler maskesi sonra (C) maske ile örtüşen görüntü segmentleri mavi ve kırmızı kanal görüntüleri (sırasıyla, DNA ve antikor floresan verileri) ve floresan değerleri her tanımlanan hücrenin karşı kaydedilir üzerine bindirilir. Ayrı komşu çekirdek başarıyla kimlik görsel çekirdekler maskenin görünüşte değerlendirilebilir. Resimde için, bu maske görüntüsünde çember gösterilen, algoritma için seçilen ayarlar tek bir çekirdeği olarak yanlış tespit komşu çekirdekleri vardır örneklerdir. Tartışma bölümünde tanıtıldı, bu olayları en aza indirmek için algoritma ayarlarının. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
Şekil 5: Kullanım Hücre Profiler nükleer ve sitoplazmik GFP yoğunlukları ölçmek için GFP-etiketli CDK2 muhabiri hücrelerinin hücre döngüsü konumuna ilişkin çekirdek ve sitoplazma arasında translocates.. Hücre Profiler her hücrenin DNA ve antikor nükleer yoğunlukları hesaplama, aynı zamanda (Şekil 4), aynı zamanda, her bir hücre için, GFP şiddetlerinin sitoplazma oranı nükleer hesaplar. (A) her bir görüntü için bir DNA boya verileri oluşturmak için kullanılan Bir Çekirdekler maskesi. (B) Hücre Profiler çekirdekler hücre konumunu tohum GFP CDK2 muhabir GFP görüntü ile bağlantılı olarak maske kullanır ve daha sonra her bir hücrenin tüm izlerini tahmin etmek için her bir hücrenin çevre genişler. Bu çekirdekler maske Celi maskesi çıkarılır, yeni bir "Hücre maskesi. (C) haline sitoplazma bir halka-benzeri bir dizi ana hatlarıyla elde edilebilir hale gelir'Sitoplazma maske'. (D) çekirdekler maske ve sitoplazma maske nükleer ve sitoplazmik GFP değerleri çiftleri ölçmek için Hücre Profiler tarafından kullanılmaktadır. Bu eşleştirilmiş değerler daha sonra hücre döngüsündeki her hücrenin konumuna olarak bilgilendirmek oranları hesaplamak için Hücre Profiler tarafından kullanılmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6:. Veri çıkarımı - tahlil değerleri kapıları empoze ham bireysel hücre veri işleme antikor boyama ve GFP-CDK2 muhabiri deneyleri için bireysel hücre veri Biyolojik eğilimler ekstre kapılı verileri kullanıyor. Ham veri histogramlarını uygun kapı değerlerinin belirlenmesini mümkün kılmaktadır. Bunlar daha sonra bir Perl script ile uygulanmaktadır. (A)Hücre Profiler için sağlanan ayarları ile görüntü dosyaları analiz nihai ürün virgülle ayrılmış değer (.csv) dosyaları vardır. Farklı alt-hücresel kollarının her biri için bağımsız hücre veri ontain Bu dosyalar, c. Dosya 'Nuclei.csv' çekirdekler maske kullanımı ile ilgili tüm seçilen ölçümleri içerir. Bu ölçümler, nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP oranı (çekirdek / sitoplazma) bulunmaktadır. Nükleer antikor yoğunluğu (sol) ve GFP CDK2 raportör oranları (sağ), her bir siRNA yok etme durum için bireysel hücre verilerinden çizilmiştir (B) Histogramlar . Görüntülenen histogramlar barlar, bu deneyleri için istenen kapı pozisyonlarını göstermektedir. Histogramlar renkli veriler kapılı subpopülasyonunun gösterir. (C) B gösterilen iki tahliller için kapıları Perl betiğin '2_gate_classifier.pl' kullanarak ham verilere uygulanır. senaryosonraki komplo yardımcı olmak için özgün Hücre Profiler çıkışı (Nuclei.csv) dosyası değiştirilmiş kopyasını oluşturur. İki kapı değerleri yeni (burada renkte vurgulanır) dosyası ve yeni bir 'Etiket' sütunu eklendi kaydedilir. etiketler bin, her bir hücre için, iki kapı deney değerlerine göre dört olası alt birine her bir hücre. Bu etiketler, her alt popülasyonun yanı sıra Hücre Profiler oluşturulan ek parametrelerin çapraz referans katkıları hesaplamaları özelliği sonraki araziler kullanılmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7:. Ayrı ayrı hücre ve kapı pozisyonları için ham verileri gösteren her bir siRNA durum için dağılım grafikleri Indivi araziler DağılımsiRNA koşulları için tüm görüntüler için çift hücre veri eder: (A) siRB1 (B) Sinon hedefleme negatif kontrol (C) siCDK6. Anti-P-S780 RB1 boyama nükleer floresan değerleri Y ekseni karşı çizilen. X-eksenleri karşı çizilen GFP-CDK2 muhabir hesaplanan karşılık gelen oran değerleridir. kırmızı ve yeşil çubuklar sırasıyla, P-S780 RB1 kapısı için kapıları ve GFP-CDK2 muhabiri kapıları konumlarını göstermektedir. İki kapıları dört alt popülasyonlar halinde hücreleri bölmek ve elde edilen kadran üzerindeki sayılar bu her birinden hücrelerinin yüzde sayısıdır. A eksenler etrafında Açıklamalar 2_gate_classifier.pl Perl komut dosyası tarafından her bir hücreye uygulanan dört olası etiket elemanları göstermektedir. Bu etiketler ilgili deney kapısı ile ilgili olarak gösterilen ve 6, 7, Şekil araziler oluşturmak için R-komut dosyası (analysis.r) kullanılır ve Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8: İki G1 geçiş deneyleri tarafından tanımlanan hücre alt popülasyonlar tahlil sonucu doğrultusunda 2N ve 4N DNA profilleri göstermek siCDK6 hücreleri için veri dağılım grafiği Şekil 7C tekrarlanır.. Dağılım arsa çevreleyen nüfusun alt kümeleri ile ilgili entegre nükleer DNA yoğunluğu histogramlardır. ScatterPlot üzerinde olanlar, GFP CDK2 haberci deneyi ile ilgilidir. ScatterPlot sağında olanlar yalnız nükleer fosfo-RB1 antikor ölçümleri ile ilgilidir. renkli kapı hatları histogramlarına onların ilişkisini göstermek için genişletilmiştir. Hücre veri bu ek araziler için seçilen hangi Kapısı etiketleri de gösterilir. (Düşük CDK2 aktivitesi gösteren) serin 780 (p-S780-) ve sitoplazmik oranına göre yüksek GFP CDK2 raportör nükleer olan ile fosforile RB1 kaybı olan hücreler her bir ilgili analiz için zıt meslektaşları ise, esas olarak, 2N-benzeri DNA profilleri gösterir 2N ve 4N, hücrelerin karışık, post-G1 fazı nüfusun karakteristik bir dağılım göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9:. Kapı (A) p-S780 RB1 verileri ve her siRNA yok etme koşulu için üç kopya halindeki gözlerin (B) GFP-CDK2 her veri siRNA durumu özet veriler araziler için kapı deney değerlerinin özeti araziler. Değerler kullanarak ham Hücre Profiler çıkışı (Nuclei.csv) hesaplandıPerl scriptleri, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) ya da 'G1assay_summary.pl' (B). çizilen değerler her deneyde uygulanan kapı içinde yüzde hücre araçlardır. Barlar üçlü kuyulardan hesaplanan standart hataları göstermektedir. P <0.001 (**) P <0.05 (*). Nerede siRNA olmayan hedefleme göre her devirme durum için çiftleşmemiş, homoskedastik t-testi P değerleri çizilen veriler üzerinde gösterilir tıklayınız Bu büyük bir versiyonunu görmek için rakam.

Şekil S1. Görüntü analizi için Hücre Profiler yazılımını kurma. Hücre Profiler (A) Ekran herhangi bir görüntü analizi ayarları girilir önce. (B) Ekran Hücre Profiler '3_channels_pipeline.cppipe' içerdiği algoritma ayrıntıları yüklendikten sonra. yüksek sol üst köşede yanan sekme bu ekran analizi 'LoadImages' aşaması için parametreleri gösterir gösterir. Bu aşağıdaki listeden diğer bölgelerinde tıklamak analizde sonraki adımlar için ayrıntıları ortaya çıkaracaktır. Giriş Klasör ve Klasör girdi Çıktı için ayrıntıları ile Hücre Profiler (C) ekran görüntüsü. (D) Hücre Profiler Screenshot sonra 'Analiz images 'düğmesine analizi başlamak için tıklandığında edilmiştir. Analiz edilen görüntülerden yazılım tarafından oluşturulan algoritmik üretilen maskeler gösteren üç yeni pencereler Superimposed vardır. Bu pencereler ana Hücre Profiler penceresinin sol üst köşesinde, bir sonraki analizde ilgili adımlar açık pozisyona 'göz' simgeleri tıklayarak ulaşılabilir. Bu görünümler konfeti renkli maskeler üreten ayarlar ekli, orijinal, gri tonlar verilerle kabul edip kullanıcı doğrulamak için yardımcı olur.

ent "> kapı bireysel hücre veri Perl ve RStudio Şekil S2. Kullanım ve arsa ortaya çıkan hücre alt popülasyonlar. (A) sağ panel Hücre Profiler analiz çıkışın .csv dosyalarını (yeşil simgeler) almak için seçilen klasörü gösterir. Yazının (mavi simgeler) ile sağlanan Perl scriptleri bu klasöre kopyalanır. Vurgulanan çift tıklandığında sol panelde diyalog kutusunu üretmek için fare ile olmuştur '2_gate_classifier.pl' Perl script olduğunu. Gösterildiği vardır hemen 'analysis.R' komut yükledikten sonra RStudio kapısı 'Nuclei.csv' dosyasından ayrı hücre veri gerekli istemleri ve yazdığınız ilgili cevaplar. (B) ekran görüntüsü. Vurgulanan içine A dan Geçitli verileri yüklemek için komutlar önceki hatları 5 ve 6'da not ayrıntıları (komplo yazılım kapı veri bilgi işlem üzerinde bulunan yere göre ayarlanması gerekiranaliz için kullanılan r). (RStudio C) Ekran veri yükledi edildikten sonra. (RStudio gösteren D) Ekran sağ alt pencerede gösterilen arsa üretmek için gerekli kod bloğunu vurgulanır. Her parsel için Kodları boş çizgilerle ayrılmış ve arsa türüne göre gruplandırılmış.

siRNA hedef	Plaka kuyu adresleri
Sigara hedefleme (NT)	E5, F5, G5,
Retinoblastom (RB)	E7, F7, G7
Siklin bağımlı kinaz 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tablo 1: Peki adresleri ve set örnek verileri kullanılan karşılık siRNA koşulları.

Discussion

tarif akışı siRNA, daha sonra etiket algılama kullanarak hücrelerin çukurlu bir perturbance için bir yöntem teşkil eder ve son olarak elde edilen floresan mikroskobu görüntülerinden sayısal verilerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için yazılım destekli bir dizi aşama kullanımı. yaklaşım, birçok hücre tabanlı uygulamalarda geniş pratik uygulama vardır tek tek hücrelerin nükleer ve sitoplazmik yoğunluk değerlerinin teslim, odaklanmıştır. Burada kullanılan örnek, veri G1 fazındaki hücre döngüsü geçiş için iki floresan deneyleri test edilmiş ve geri nükleer DNA içeriğinin daha doğrudan bir biyofiziksel ölçüye ilişkili olan bir siRNA ekran ortamda elde edilmiştir.

bireysel hücrelerin belirlenmesini sağlar ve ortaya çıkan 'Çekirdekler maske' ilgili cytoplasmi tanımlamak için başlangıç ​​noktası olarak hizmet gibi görüntü nükleer DNA'ya bir floresan DNA leke kullanımı, görüntü segmentasyonu sürecinde vazgeçilmez bir adımdırC bölgeleri. Kararlı biçimde hücrelerde ifade edilir GFP etiketli CDK2 raportör, ancak bu bölme tarif edilebilir tarafından sitoplazma içerisinde arka plan sinyali sürekli olarak daha yüksek bir değişken verir. Aynı analiz boru hattı için diğer uygun floresan bağlanmış habercilerin ve perturbance tepkilerini kullanılarak protein translokasyon olayların analizi için geçerli olmalıdır. Ayrıca, sitoplazma özel floresan boyalar ile GFP-CDK2 muhabiri ikame bu algoritmanın alternatif kullanım sitoplazmasında boyutlarını ve görüntüleri hücrelerin göreceli boyutlarını ölçmek için izin verecek.

Burada anlatılan görüntü segmentasyonu stratejisi başka tasarım dikkate DNA ölçümü için entegre yoğunluk değerlerini sunmak için Hücre Profiler kullanılmasıdır. Yoğunluk Entegrasyon boyama verileri nukleus boyutunda olası varyasyonlar için izin nükleer DNA için değerleri ve görülen miktar profilleri için yakın bir maç temsiliçin, propidyum iyodür lekeli FACS verileri. Bununla birlikte, Entegre edilen yoğunluk, antijen floresans ortalama yoğunluğu ile örneklenen ortalama konsantrasyon, daha fazla biyolojik olarak, bir hücre bölmesi içinde protein (ve ilgili floresan) entegre toplam miktarına göre uygun olduğu proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için uygun bir araç sağlar olmayabilir. Bu nedenle yoğunluk değerleri P-S780 RB1 ve GFP verileri kullanılmıştır anlamına gelir. seçeneği Hücre Profiler yazılımı 'ExportToSpreadsheet' panelinde bulunan iki mod (ortalama veya entegre) veri değerlendirme arasında değiştirmek için.

3_channels_pipeline.cppipe dosyasındaki analiz ayarları örnek veri setinde görüntüler için optimize edilmiştir. Bu protokol ile yeni görüntüler setleri analizi dosya adları adlandırma kuralı yukarıda (Şekil 3) tarif kabul gerektirecektir. Ayrıca, duyarlılık arka nükleer DNA boyama ve eşik parlaklığını uygun değerleriYeni görüntü setleri şiddetler Hücre Profiler ayarları içinde ayarlanması gerekebilir. DNA boyama çeşitli görüntü segmentasyonu maskeleri oluşturmak için geçerlidir kilit rolü göz önüne alındığında, bu kanal için doğru hassasiyet ayarları uygulama Hücre Profiler yazılımı ile yeni görüntü verilerinin analizine başarılı anahtarıdır. sağlanan Hücre Profiler ayarları dosyası (3_channels_pipeline.cppipe) yeni verilere analizi uyarlanması için en sık yararlı parametreler üzerine notlar içermektedir. Bu notlar Hücre Profiler ana penceresinde ekranın üst kısmındaki metin kutusuna ve hassasiyet ayarlarını değiştirme ve kanal sayısı analiz edilecek ayarlama konusunda rehberlik dahildir. Yeni görüntü verileri ayarlarını test etmek Protokol bölümünde 2.8, olarak suçlanan gibi (Şekil s1d '... belirleyin Nesneler' her biri için 'göz' simgeleri açık tıklayarak protokol adımlarını görüntü analizi sırasında görüntü segmentasyonu gözlemlemek için gerekli olabilir

Hücre Profiler bireysel hücre veri ham çıktı, diğer çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Burada gösterilen veriler biyolojik eğilimleri ayıklanması yardımcı olmak amacıyla hücre başına ölçülen parametrelerin iki kapılarını uygulamak için bir Perl script kullanımıEk ölçümlerle belirlenen alt popülasyonlar d izni çapraz referans. O Hücre Profiler çerçevesinde yolluk unsurları içerir eşit mümkün olsa da, burada kullanılan alternatif rota büyük veri setleri değerlendirilmesi gerekir, özellikle eğer, daha fazla esneklik ve hız sağlar. Mevcut protokol sonrası görüntü elde etme aşamalarında yavaş sahne Hücre Profiler yazılımı çalışan olduğunu. Gerekirse Hücre profil burada farklı kapı değerleri ile iteratif, daha hızlı sonraki Perl script ile tekrar analiz edilebilir bir un-kapılı ham veri seti üretmek için kapıları empoze olmadan çalıştırmak ve. Tüm çalışmalar bu gibi uygun kapı değerleri potansiyel zamanla herhangi bir veri kümesi verilen üzerinde reaktif ile değişebilir önceden bilecek. Dolayısıyla, uygun bir kapı valu belirlemek için pozitif bir kontrol ve sahte tedirgin hücreleri için hücre Profiler elde edilen ham veri dağılımı gösteren histogramlar oluşturmak için önerilirilgi parametrelerinin es.

Perl script Hücre Profiler veri değişmez bir sütun yapısını kabul yazılır ve bir kullanıcı 'ExportToSpreadsheet' ayarlarını kullanarak Hücre Profiler ile parametreler çıkış sayısını değiştirir eğer durmasına olabilir. Notlar Perl komut dosyaları içinde yer alan ayarları değişiklik uygulamak yardımcı olmak. Bu bir metin editörü komut görüntülemek görmek için, tercihen bir programcı metin editörü (örneğin, http://www.activestate.com/komodo-edit) renk kodu Perl elemanları ayarlanır. Veri formatında değişikliklere uyum için komut dosyası ayarlamak için nereye Bu notlar gösterir. Perl script benzer, görüntü analiz verilerinden rakamlar komplo için talimatlar içeren sağlanan Ar-kod dosyası (analysis.r), kullanım ve adaptasyon ek notlar görmek için bir metin editörü veya RStudio yazılımında okunabilir. Bu notlar düzenli ifadeler ve Perl <ayrıntıları ile takviye edilebilirsup> 12 ve veri okuma açıklamalı ve sırasıyla, çizilen nasıl temelini oluşturan her ikisi de R için ggplot2 ¹³ paket.

Floresan mikroskobu kullanarak yeni çalışmalar yanı sıra açık kaynak yayınlar tevdi ham veriler, burada tarif edilen analiz yöntemleri ile tedavi edilebilir. yüksek içerik verilerinin doğası herhangi bir gözlemci araştırma çıkarlarına bağlı olarak farklı analitik vurguları ile özyinelemeli analiz için oldukça rahat. Veri istenebilir sorular başlangıçta kullanılan prob ile sınırlı olmasına rağmen, görüntü verileri genellikle anlamlı onları üretilen çalışmaların kapsamı dışında tekrar analiz edilebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars negative control siRNA	Qiagen	1027280	Negative control siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.
Nulcease-free water (non-DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	For dilution of siRNA buffer.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfection lipid.
DMEM	Life Technologies	41966052	Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.
96 well tissue culture plate	Falcon	3072	Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.
Breathable membrane	Alpha Labs	LW2783	Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Non-ionic detergent

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	For plate wash solution.
Anti-P-S780 RB1 antibody	Abcam	ab32513	Rabbit monoclonal
AlexaFluor647 Anti-rabbit	Invitrogen	A21245	Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.
Hoechst 33342 (Bisbenzimide)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.
Permeabilization solution	NA	NA	0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.
Plate wash solution	NA	NA	Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.
Block solution	NA	NA	5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R programming environment	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/