Introduction
Hydra har blitt brukt til å studere regenerering, mønsterdannelse, og stamceller i omtrent 250 år 2 Hydra har et enkelt legeme plan som består av tre celleslektsnavn:. Ectodermal, endodermal epitelial epithelial og interstitiell. Det rørformede legeme er dannet av ectodermal og endodermal epitelceller i rett linje, hvor hver av disse er en enkeltcellelaget. Alle av de epiteliale celler i kroppen kolonnen er mitotisk. Når epitelceller blir forskjøvet inn i de tre ekstremiteter, hodet (munn og tentakler) ved oral ende eller foten (basalplate) ved aboral enden, de arrest i G2-fasen av cellesyklusen, og endrer celle skjebne 4. Cellene i den interstitielle avstamning ligge innenfor mellomrommene mellom epitelcellene. Denne linjen er støttet av multipotente stamceller som er plassert i den ectodermal epitellaget av legemet kolonne 5. De interstitielle stamceller gi opphav til tre somatisk celtyper l (nerver, kjertel celler, og nematocytes) og kjønnsceller 6,7.
Som medlem av phylum Cnidaria, søstergruppe til alle bilaterians, kan Hydra belyse grunnleggende biologiske prosesser delte blant flercellede dyr. Inntil nylig, ble disse forsøk hindret av mangel på pålitelige metoder for endringen av genfunksjon. Men med utviklingen av transgene metodikk 1, er vi nå i stand til å dra full nytte av Hydra å få en bedre forståelse av de grunnleggende mekanismene er felles for flercellede dyr, for eksempel stamcelle funksjon, gjenfødelse, og mønster. Transgen Hydra linjer etableres ved injeksjon av plasmid-DNA inn i embryo, noe som resulterer i tilfeldig integrasjon og chimeriske ekspresjon i en betydelig frekvens på unger. En linje med enhetlig uttrykk i en bestemt avstamning kan etableres ved aseksuell formering. Evnen til å clonally forplante transgenic Hydra linjer er en fordel i forhold til de fleste dyremodeller, noe som kan formeres bare av seksuell reproduksjon. I tillegg kan transgene celler spores lett in vivo på grunn av gjennomsiktigheten av dyret og fravær av endogene fluorescerende proteiner 8.
I de sju årene siden den første transgene Hydra linjer ble gjort en, slike linjer har blitt brukt i en rekke applikasjoner. Uttrykk av fluorescerende proteiner i ulike celletyper har gjort det mulig å spore celle bevegelse, observere endringer i cellen form, og spore celle skjebner både i vill type forhold og etter kjemisk perturbation 1,5,9-12. I tillegg, ekspresjon av forskjellige fluorescerende proteiner i de forskjellige linjene gjør det mulig for FACS isolering av spesifikke cellepopulasjoner. Denne teknikken har blitt benyttet for sekvensering av stem-cellespesifikke mRNA og ætt spesifikke RNAer små 13,14. Mens promotoren aven av de to Hydra aktin gener blitt mest brukte, noen få celletypespesifikke arrangører har blitt identifisert og brukes til å drive uttrykk for GFP i transgen Hydra 9,11,15,16. I fremtiden vil celle-typespesifikke arrangører tillate observasjon og innsamling av noe bestemt celletype. I tillegg ble en transgen tilnærming med hell brukes til å definere cis-virkende regulatoriske elementer i Wnt3 promoter 17..
Utviklingen av transgene metoder i Hydra gir en robust tilnærming for å teste funksjonen av gener ved ektopisk uttrykk, overekspresjon, og knockdown. Transgene dyr har blitt gjort som uttrykker fluorescently-merket proteiner for å undersøke både funksjon og cellulær lokalisering 18-20. I tillegg, ekspresjon av RNA hårnåler i 3'UTR av en GFP-transgenet fører til knockdown av målgener 21,22. I disse metodene GFP er nødvendig for å identifisereog spore den transgene vev under opprettelsen av den transgene linjen. Imidlertid er det sannsynlig at i noen tilfeller GFP-molekyl ville forstyrre funksjonen til den kodede protein. En fersk studie viser at Hydra gener kan ordnes i et operon konfigurasjon, dvs. er polycistronic transkripsjoner laget, som deretter separert ved trans-skjøtes lederen tillegg og oversatt separat 23. Ved å plassere et gen som koder for et protein eller et RNA hårnål i oppstrømsposisjon i et operon, og et fluorescerende protein-genet i den nedstrøms posisjon, kan en spore transgent vev uten å tagge genet som koder for protein eller RNA hårnål. Denne metoden har blitt brukt til å uttrykke en RNA hårnål i et operon konfigurasjon med DsRed2 for å oppnå genet knockdown 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av plasmid DNA, Needles, og injeksjon Retter
- Forbered plasmid DNA ved hjelp av en High Speed Maxi eller Midi kit og konsentrere DNA til 2,5 mg / ml ved hjelp av etanol nedbør. DNA-pelleten oppløses i nukleasefritt deionisert vann. Oppbevar DNA i 10-20 mL alikvoter ved -20 ° C. (Se utfyllende tabell 1 for en liste over tilgjengelige vektorer)
- Gjør en injeksjon rett med agarose å konstruere et trau for å holde embryoer i en 100 x 15 mm petriskål.
- Plasser en 75 x 50 glass objektglass i en 100 x 15 mm petriskål i en vinkel. Hell omtrent 50 ml 2% agarose smeltet i Hydra medium 24 inn i petriskål. Alternativt hell agarose i formen først og flyte en "Mikroinjeksjon Fish Mold" på toppen.
- Etter agarosen har stivnet, fjerne glass-slide eller mold. Hvis en glass-slide ble brukt, skjære vekk overflødig agarose med en barberhøvel blade for å danne en vegg. Hell Hydra medium i formen og bruke den umiddelbart, eller lagre den ved 4 ° C inntil nødvendig. Merk: Injeksjon retter kan gjenbrukes hvis det er lagret ved 4 ° C mellom bruker.
- Trekk nåler borsilikatglass kapillærer med en glødetråd på mikropipette avtrekker med følgende betingelser: varme 525, trekk 75, hastighet 100, tid 50. Oppbevar nåler ved å trykke dem inn i en smal stripe av leire i en petriskål slik at de er holdt parallelt med bunnen av fatet.
- For å fremstille injeksjonsløsningen, kombiner 3 ul av 2,5 mg / ml plasmid-DNA-oppløsning med 2 ul av 10% fenolrødt. Vortex løsningen raskt, og deretter spinner den i 10 minutter ved maksimal hastighet i en mikrosentrifuge for å fjerne eventuelle partikler som kan tette kanylen.
- Under en dissekere mikroskop, klipp nålen noen få millimeter fra spissen med tang for å lage en liten åpning. Merk: Det er en viss fleksibilitet i den riktige størrelse av den åpneing fordi trykket kan justeres i trinn 3.3 for å imøtekomme denne variasjonen.
- Plasser petriskål slik at den holder nålen i en vertikal posisjon med spissen ned. Laste nålen med ca 0,5 mL av injeksjon løsning ved pipettering væsken inn på baksiden enden av nålen. Tillat kapillarvirkning å trekke oppløsningen inn i spissen av nålen.
2. Utarbeidelse av embryoer for Injection
- På daglig basis skanne Hydra AEP belastning kultur for polypper som produserer egg. Samle disse polypper og sett dem til side i en egen kultur parabolen. Observere disse polypper noen få timer i løpet av dagen for å overvåke fremdriften for egg formasjon. Når egg bryte gjennom ektoderm og sitte på en ring av tilbaketrukne ectodermal celler de er klare for injeksjon 25. Plasser disse polypper i en skål med flere Hydra som har testiklene i minst 1 time før injeksjon for å tillate for befruktning. Hydra </ Em> menn vil slippe sperm uten noen spesiell manipulasjon.
- Hvis det blir funnet kvinner i AEP koloni med fullt dannet egg, som er ca 400 mikrometer i diameter 25, eller 1 til 8-cellestadiet embryoer, også samle disse for injeksjon. Umiddelbart injisere embryoer som har startet spalte. Merk: Det er ikke mulig å se forskjell mellom fullt dannet egg og encellede zygotes, og dermed disse bør inkuberes med menn før injeksjon.
- Før injeksjon fjerne mesteparten av foreldre vev over og under embryo ved hjelp av en skalpell med en # 15 blad. La bare embryo med en liten del av kroppen kolonne festet, for å bli brukt til å manipulere embryoet med pinsett om nødvendig. Merk: vev som er dissekert bort fra embryo vil fornye og bør lagres for å sikre at kvinner forblir i Hydra kolonien.
- Ved hjelp av en Pasteur-pipette, beveger embryoene injeksjonsantenne, å arrangere dem parallelt med veggen avagarose trau.
3. Mikroinjeksjon av plasmid DNA
- Monter microinjector på en magnetisk stativ som sitter på en jernplate. Monter injeksjon holderen, som er den del av microinjector som holder nålen, på en styrespak mikromanipulator. Monter joystick manipulator til jernplate, med en magnetisk stativ. Plasser denne Hele oppsettet på høyre side av et disseksjonsmikroskop, og plassere injeksjonsholderen slik at den er synlig i observasjonsfeltet.
- Plasser injeksjon fatet med embryoer under disseksjonsmikroskop, orientert slik at den vertikale vegg av agarose trau er til venstre. Stikk nålen inn i injeksjons holderen og senk nålespissen inn i Hydra medium i fatet.
- Sakte vri knotten av sprøyten i klokkens retning inntil mineralolje fyller toppen av nål og en jevn strøm av injeksjon løsning er observert spennende nålen inn i Hydret medium. Hvis strømmen er for sterk, senke trykket ved å dreie knappen mot klokken. Øv dette trinnet for å rutinemessig skaffe en egnet trykk, som avhenger av størrelsen av nålen åpning (dvs. hvor nålen ble avkuttet i trinn 1.5). Merk: Hvis strømmen er for sterk, vil embryoet ikke overleve injeksjonen.
- Mens ser gjennom disseksjonsmikroskop, beveger injeksjons fatet slik at den første embryo er i sentrum av feltet. Flytt nålen slik at det er rørende at embryo. Bruk mikromanipluatoren å pierce embryo med nålen. Merk: Den vertikale vegg av agarose trau vil holde embryoet fra å bli skjøvet til side av nålen.
- La injeksjonsoppløsningen å strømme inn i embryoet 1 eller 2 sek og deretter fjerne nålen raskt. Hvis embryoet har mer enn en celle, injisere hver celle individuelt. Bruk pinsett til å reorientere embryoet å justere den neste cellen med tuppen av nålen.
- Etter den første Embryo injiseres, flytte parabolen slik at neste embryo er i sprøyte posisjon og gjenta prosedyren; fortsette inntil alle embryoer er blitt injisert.
4. dyrking og klekking av embryo
- Flytt alle de injiserte embryoene i en tallerken med noen Hydra som har testiklene (dette er å sikre at alle embryoer er befruktet). Inkuber embryoene i en 18 ° C inkubator mens de fortsetter embryogenesen.
- Når hårstråene stadium er nådd, beveger hver injisert embryo til en individuell brønn på en 24-brønns plate som er fylt med Hydra medium.
- Inkuber de injiserte embryoer i 2 uker i mørke ved 18 ° C.
- Etter 2 ukers inkubasjonstid, sjekke hver injisert embryo under dissekere mikroskop. Oppmerksom på eventuelle tilfeller der hårstråene-trinns embryo har løsrevet fra den lille stykke foreldre vev og foreldre vev har regenerert. Fjern dette regenerert polypp umiddelbart slik at det ikke er mistaken for en ny hatchling.
- Flytt rett av injisert embryoer under en akvarium lys ved RT. Sjekk platene hver dag og hente hatchlings. Nye hatchlings vil være hvit fordi den typiske rosa fargen på Hydra polypper kommer fra Artemia de spiser.
- Observer hatchlings under et fluorescens mikroskop for å oppdage transgene uttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av transgene Hydra linjer
Mate transgene hatchlings hver 2-3 dager med Artemia nauplier. Hatchlings noen ganger ikke spise for en dag eller to etter klekking. Noen nye hatchlings vil aldri spise, og dermed vil ikke overleve. Dersom hatchling er transgene i enten ectodermal (figur 1A) eller endodermal epitelvev, tillater dyret å knopp og samle knopper som har den mest transgent vev (figur 1B, C). Fortsett å gjøre dette med de nye knopper inntil en transgen linje er etablert med ensartet ekspresjon av transgenet i enten ectodermal (figur 1D) eller endodermal epitelial avstamning. Samtidig kan en annen linje etableres som ikke inneholder transgenet, men er ellers genetisk identiske (Figur 1B). Denne linjen tjener som en negativ kontroll for fremtidige eksperimenter. Hvis den transgene vev ikke beveger seg into et bud, er det noen ganger mulig å kutte dyret og la den regenerere slik at den transgene vevet vil være i den nye spirende sonen. Imidlertid, hvis den transgene vev er for nær ekstremiteter vil det sannsynligvis bli tapt som den fortrenges under normal vekst av dyret. Ofte er det ingenting som kan gjøres i dette tilfellet. I våre hender, hvis transgenet er nøytralt (dvs. har ingen innvirkning på biologisk funksjon) vi er i stand til å etablere en enhetlig epithelial linje fra ca 30% av Hydra at luke med epitel transgen vev. De resterende 70% enten dø eller det transgene vev er tapt. En endodermal linjen er ca 2-3 ganger så vanlig som en ectodermal linje. Hvis et transgen blir brukt som forstyrrer biologisk funksjon, kan dette ha en innvirkning på mulighetene for å realisere en enhetlig linje. I slike tilfeller vil induserbare arrangører være viktige tilskudd til verktøysettet.
Hvis hatchling er transgenei interstitiell avstamning, at dyret kan knopp og samle hatchlings med et økende antall av transgene celler i interstitiell avstamning. Vær oppmerksom på at noen ganger er det ikke umiddelbart klart at et dyr er transgene i interstitiell avstamning, spesielt hvis det er også transgene i en epitelial avstamning. Det er svært usannsynlig at en linje helt transgen i interstitiell avstamning vil bli etablert ved å spirende. Hvis det er nødvendig at interstitiell avstamning være fullt transgen, kan dette oppnås ved kloning i aggregater fra interstitiell stamcelle-utarmet dyrene slik at hele linjen er etablert fra en enkelt transgen stamcelle 7.
I tilfeller hvor en vevskulturer eller celletype-spesifikk promotor benyttes til å drive ekspresjon av et fluorescerende protein, kan transgene dyr som ikke er tydelig i utgangspunktet. For eksempel hvis en promoter som er aktiv kun i tentakler er brukt og den første oppdateringen av transgenvev i kroppen kolonne, ingen fluorescerende celler vil sees i hatchling. Så alle hatchlings trenger å bli forplantet til å tillate transgent vev til å forskyves inn i de tentakler og bli avdekket.
Figur 1. Etablering av en transgen linje med uniform ectodermal epithelial uttrykk for DsRed2. (A) En hatchling med kimere uttrykk for en DsRed2 transgen under kontroll av en aktin promoter i en oppdatering av ectodermal epitelceller. (B) En første-generasjons bud fra hatchling i panel A produserer nå to nye knopper. Den knopp merket med en stjerne har ingen transgent vev og ble brukt som grunnla dyret for en styreledning som er genetisk identiske med den transgene linje, med unntak av nærvær av transgenet. (C) En andre generasjon knoppprodusert fra Hydra i panel B. (D) Et eksempel på en polypp fra den transgene linjen som ble etablert med DsRed2 uttrykk gjennom ektoderm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra reproduserer rutinemessig aseksuelt, men krever miljømessige stimuli for å begynne å produsere kjønnsceller. Disse stimuli er ikke godt definert for de fleste Hydra arter og kan avvike fra stamme til stamme. En betydelig hinder til produksjon av transgene Hydra er å skaffe embryoer på regelmessig basis, fordi det kan være vanskelig i et laboratorium setting for å indusere Hydra å bli seksuelt. Den AEP stammen 25, men produserer kjønnscellene lett i laboratoriet, og dette er den eneste belastningen som har vært brukt så langt for å lage transgene linjer. Den vanligste metoden for å indusere gamete produksjon er ved diett manipulasjon. Som tidligere beskrevet, bør dyrene mates daglig i tre uker, sultet i 5 dager, og deretter matet to ganger i uken i løpet av hvilken tid gameter vil bli produsert 1. Det har også vært vår erfaring at dyrking av AEP Hydra på vertikale plater i et akvarium 26, kanskje simulere en more naturlige miljø, fører til eggproduksjon selv når dyrene blir matet med jevne mellomrom. I tillegg linjer hentet fra AEP selv krysser noen ganger produsere kjønnsceller mer regelmessig enn moderstammen. Således å etablere en linje av AEP F1 er en annen mulig metode for å oppnå en mer pålitelig kilde for embryoer.
Prosentandelen av embryoer som overlever injeksjon og utvikler til hårstråene stadium avhenger av helsen til embryoene, mengden av injisert oppløsning, og mengden av skade gjort ved injeksjon. Med konstant strømningsinjeksjon set-up som er beskrevet i denne protokollen, er det vanskelig å kontrollere mengden av løsning som injiseres inn i embryo. I våre hender, omtrent halvparten av embryoene injisert som beskrevet her fullføre embryogenesen og danne en skjellaget. Av disse 50-75% luke, og av de som luke, vil omtrent 50% har minst noen transgent vev. Derfor, 10-20% av de opprinnelig injiserte embryoer utbytteen F1 Hydra med transgen vev. Mengden av injisert oppløsning kan kontrolleres nøyaktig med mer kostbart utstyr slik som IM-300 microinjector. De opprinnelige transgene linjer ble gjort med utstyr fra Eppendorf, noe som gir en stor presisjon i å manipulere og injisering av embryo. Selv om denne grad av nøyaktighet kan gi en høyere overlevelsesrate for injiserte embryoer er denne regning ikke nødvendig for rutinemessig etablering av transgene linjer.
Integreringen av transgenet er tilfeldig og kan potensielt skje på flere steder i genomet eller i en tandem oppstilling på ett sted. Basert på Southern blot analyse, ble antall integrasjoner anslått til fem i en epitelial transgen linje opprettet tidligere en. I en mellomliggende avstamning transgen linje hvori transgenet gjennomgår kimlinje-overføring, har det blitt demonstrert av genomet sekvense at bare et enkelt kopi av transgenet var integrated (CE Dana og RE Steele, upublisert observasjon). Men bortsett fra disse to eksemplene, det er ingen informasjon tilgjengelig om transgene integrering nettsteder og kopiere nummer. Siden det er mulig at et transgen kunne avbryte genfunksjon ved insertional mutagenese, bør mer enn en transgen linje bli gjort ved analyse fenotyper fra, for eksempel, RNAi eller overekspresjon konstruksjoner. Det er også viktig å merke seg at transgen ekspresjon er konstitutiv når det drives av den vanlig brukte aktin-gen-promoteren, og således transgener som fører til alvorlige eller livsfarlige fenotyper når det uttrykkes konstitutivt vil ikke bli opprettholdt. I fremtiden vil det være viktig å utvikle en induserbar system av transgene ekspresjon for å omgå dette problemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en G. Harold & Leila Y. Mathers Award til HL og en NIH stipend (R24 GM080527) til RESCEJ var en NRSA Postdoktor (NIH F32GM9037222) og støttes av en mentor Forsker Development Award fra National Institute on Aging (K01AG04435). Vi vil gjerne takke anmelderne for nyttige kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
