Introduction
وقد استخدمت هيدرا لدراسة التجديد، وتشكيل نمط، والخلايا الجذعية لحوالي 250 سنة 2 هيدرا لديها خطة هيئة بسيطة تتألف من ثلاثة الأنساب الخلية: الظهارية الأديمي الظاهر، الأديم الباطن الظهارية، وفراغي. يتكون الجسم أنبوبي من الأدمة والأنساب الظهارية الأديم الباطن، كل منها عبارة عن طبقة خلية واحدة. كافة الخلايا الظهارية في عمود الجسم هي الإنقسامية. عندما نزحوا الخلايا الظهارية في الأطراف 3، ورئيس (الفم ومخالب) في نهاية شفوية أو القدم (القرص القاعدية) في نهاية مجافي الفم، فإنها تعتقل في المرحلة G2 من دورة الخلية وتغيير مصير الخلايا 4. خلايا النسب الخلالي يقيمون داخل الفجوات بين الخلايا الظهارية. ويدعم هذا النسب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الموجودة في طبقة الأدمة الظهارية العمود الجسم 5. الخلايا الجذعية الخلالي تؤدي إلى ثلاثة سل الجسديةأنواع ل (الأعصاب، وخلايا الغدة، وnematocytes) والخلايا الجرثومية 6،7.
كعضو في بعائلة القراصات، مجموعة شقيقة لجميع bilaterians، يمكن هيدرا تسليط الضوء على العمليات البيولوجية الأساسية المشتركة بين الحيوانات المتعددة الخلايا. حتى وقت قريب، تم عرقلة هذه الجهود من خلال عدم وجود طرق موثوقة لاضطراب في وظيفة الجين. ومع ذلك، مع تطوير منهجية المعدلة وراثيا 1، ونحن الآن قادرون على الاستفادة الكاملة من هيدرا للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المشتركة بين الحيوانات متعددة الخلايا، مثل وظيفة الخلايا الجذعية، تجديد، والزخرفة. يتم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا هيدرا عن طريق الحقن من DNA البلازميد إلى الأجنة، الأمر الذي يؤدي إلى تكامل عشوائي والتعبير خيالية في تردد كبير من سلحفاة صغيرة. يمكن إنشاء خط مع التعبير موحد في نسب معين عن طريق الإكثار اللاجنسي. القدرة على نشر clonally transgشبكة naric هيدرا خطوط هي ميزة على معظم النماذج الحيوانية، والتي يمكن نشرها إلا عن طريق التكاثر الجنسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع الخلايا المعدلة وراثيا بسهولة في الجسم الحي بسبب شفافية الحيوان وغياب البروتينات الفلورية الذاتية 8.
في سبع سنوات منذ أول خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تم إجراؤها 1، وقد تم استخدام هذه الخطوط لمجموعة متنوعة من التطبيقات. جعلت التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع مختلفة من الخلايا من الممكن لتتبع حركة الخلية، ومراقبة التغيرات في شكل الخلية، وتتبع مصائر خلية في كل الظروف نوع البرية وبعد اضطراب كيميائي 1،5،9-12. بالإضافة إلى ذلك، التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة في مختلف الأنساب يسمح لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزل السكان خلية معينة. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل من mRNAs محددة الخلايا الجذعية ونسب محددة الرنا 13،14 صغيرة. بينما مروجيواحد من اثنين هيدرا الجينات الأكتين وقد استخدم على نطاق واسع، وقد تم تحديد عدد قليل خلية من نوع المروجين محددة وتستخدم لدفع التعبير عن GFP المعدلة وراثيا في هيدرا 9،11،15،16. في المستقبل، سوف المروجين الخلية من نوع معين يسمح لمراقبة وجمع أي نوع من الخلايا المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نهج المعدلة وراثيا بنجاح لتحديد العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة تعمل من المروج Wnt3 17.
يوفر تطوير أساليب المعدلة وراثيا في هيدرا نهج قوي لاختبار وظيفة الجينات التي التعبير خارج الرحم، overexpression، وضربة قاضية. وقد بذلت الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الموسومة fluorescently، من أجل دراسة كل وظيفة وتوطين الخلوية 18-20. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن دبابيس الشعر RNA في 3'UTR من التحوير GFP يؤدي الى ضربة قاضية من الجينات المستهدفة 21،22. في هذه النهج مطلوب لتحديد GFPوتتبع أنسجة معدلة وراثيا أثناء إنشاء خط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فمن المرجح أن جزيء GFP أن تتدخل في بعض الحالات مع وظيفة البروتين الموسومة. توضح دراسة حديثة أن الجينات هيدرا يمكن ترتيب في تكوين الاوبرون، أي مصنوعة النصوص متعدد المقارين، والتي يتم فصلها بواسطة المهدرجة تقسم بالإضافة زعيم وترجمتها على حدة 23. عن طريق وضع الجينات ترميز البروتين أو دبوس RNA في موقف المنبع من الاوبرون والجين ببروتين في موقف المصب، يمكن للمرء أن تتبع الأنسجة المعدلة وراثيا دون الحاجة لوضع علامة على الجينات التي تشفر البروتين أو RNA القاسي. وقد استخدم هذا الأسلوب لإبداء دبوس RNA في تكوين الاوبرون مع DsRed2 من أجل تحقيق ضربة قاضية الجين 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد DNA البلازميد، إبر، وأطباق حقن
- إعداد DNA البلازميد باستخدام طقم ماكسي عالية السرعة أو ميدي وتركيز الحمض النووي إلى 2.5 ملغ / مل باستخدام الإيثانول هطول الأمطار. يجب حل بيليه الحمض النووي في nuclease خالية من الماء منزوع الأيونات. تخزين الحمض النووي في 10-20 مكل في -20 درجة مئوية. (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة من ناقلات المتاحة)
- جعل طبق الحقن باستخدام الاغاروز لبناء حوض لعقد الأجنة في 100 × 15 مم طبق بتري.
- وضع المجهر الشريحة 75 × 50 الزجاج إلى 100 × 15 مم طبق بتري في زاوية. صب حوالي 50 مل من 2٪ الاغاروز ذاب في حيدرة المتوسطة 24 في طبق بيتري. بدلا من ذلك، صب الاغاروز في طبق أولا وتعويم "القالب حقن مكروي الأسماك" على القمة.
- بعد أن عززت agarose، إزالة شريحة زجاجية أو القالب. إذا تم استخدام شريحة زجاجية، وقطع بعيدا الاغاروز الزائد مع بلوخ الحلاقةدي لتشكيل الجدار. صب هيدرا المتوسطة في طبق واستخدامه فورا أو تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. يمكن إعادة استخدام الأطباق حقن إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات: مذكرة.
- سحب الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط على مجتذب micropipette باستخدام الشروط التالية: حرارة 525، وسحب 75، سرعة 100، والوقت 50. مخزن الإبر عن طريق الضغط عليها في شريط ضيق من الطين في طبق بتري بحيث أنها الموازية التي عقدت في قاع الطبق.
- لتحضير محلول الحقن، والجمع بين 3 ميكرولتر من 2.5 ملغ / مل حل DNA البلازميد مع 2 ميكرولتر من 10٪ الفينول الأحمر. دوامة الحل لفترة قصيرة ثم تدور لمدة 10 دقيقة في السرعة القصوى في microcentrifuge لإزالة أي الجزيئات التي قد تسد إبرة.
- تحت المجهر تشريح، مقطع الإبرة بضعة ملليمترات من غيض مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة. ملاحظة: هناك بعض المرونة في الحجم المناسب للمفتوحاجي لأن الضغط يمكن تعديلها في الخطوة 3.3 لاستيعاب هذا الاختلاف.
- وضع طبق بتري بحيث انها تحتجز الإبرة في وضع عمودي مع أسفل الحافة. تحميل إبرة مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن بواسطة pipetting السائل في نهاية الجزء الخلفي من الإبرة. السماح للعمل شعري لسحب الحل في رأس الإبرة.
2. إعداد الأجنة للحقن
- على أساس يومي مسح الثقافة سلالة هيدرا AEP عن الاورام الحميدة إنتاج البيض. جمع هذه الاورام الحميدة وتضعها جانبا في طبق منفصل الثقافة. مراعاة هذه الاورام الحميدة كل بضع ساعات خلال اليوم لرصد التقدم المحرز في تشكيل البيض. عندما كسر البيض من خلال الأديم الظاهر والجلوس على حلقة من خلايا الأدمة تراجع انهم مستعدون للحقن 25. ضع هذه الاورام الحميدة في طبق مع عدة هيدرا التي لها الخصيتين لا يقل عن 1 ساعة قبل حقن للسماح للإخصاب. هيدرا </ EM> الذكور ستفرج الحيوانات المنوية دون أي تلاعب خاص.
- إذا تم العثور على الإناث في مستعمرة AEP مع البيض تشكيلها بالكامل، والتي هي حوالي 400 ميكرون في القطر 25، أو 1- إلى 8 خلايا الأجنة المرحلة، أيضا جمع هذه للحقن. حقن فورا الأجنة التي بدأت الانفطار. ملاحظة: ليس من الممكن ان نقول للفرق بين البيض تشكيلها بالكامل وبيضات ملقحة وحيدة الخلية، وبالتالي يجب حضنت هذه مع الذكور قبل الحقن.
- قبل الحقن، وإزالة معظم الأنسجة الأبوية فوق وتحت الجنين باستخدام مشرط بشفرة # 15. ترك فقط الجنين مع قطعة صغيرة من العمود الجسم المرفقة، لاستخدامها لمعالجة الجنين بالملقط إذا لزم الأمر. ملاحظة: الأنسجة التي يتم تشريح بعيدا عن الجنين وتجديد ويجب حفظ لضمان أن الإناث تبقى في مستعمرة هيدرا.
- باستخدام ماصة باستور، نقل الأجنة إلى طبق الحقن، وترتيبها موازية لجدارحوض الاغاروز.
3. Microinjection من البلازميد DNA
- تركيب microinjector على الوقوف المغناطيسي الذي يجلس على صفيحة الحديد. جبل حامل الحقن، وهو جزء من microinjector الذي يحمل الإبرة، على micromanipulator عصا التحكم. تركيب مناور عصا التحكم على لوحة الحديد، مع الوقوف المغناطيسي. ضع هذا كله مجموعة المتابعة على الجانب الأيمن من مجهر تشريح ووضع حامل حقن بحيث كان مرئيا في مجال المراقبة.
- وضع الطبق مع حقن الأجنة تحت المجهر تشريح، الموجهة مثل أن الجدار الرأسي للحوض الاغاروز هو اليسار. ادخال الإبرة في حامل الحقن وخفض رأس الإبرة في المتوسط هيدرا في الطبق.
- تتحول ببطء مقبض من الحقنة في اتجاه عقارب الساعة حتى تملأ الزيوت المعدنية أعلى الإبرة وجود تدفق مستمر من محلول الحقن لوحظ خروج الإبرة في HYDRوسيلة. إذا كان تيار قوي جدا، وانخفاض الضغط من خلال تحويل مقبض عكس عقارب الساعة. ممارسة هذه الخطوة بشكل روتيني للحصول على ضغط مناسب، والذي يعتمد على حجم الفتحة إبرة (أي كيف كان يثقب الإبرة في الخطوة 1.5). ملاحظة: إذا كان تيار قوي جدا، فإن الجنين لم تنج من الحقن.
- أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، حرك طبق حقن بحيث الجنين الأول في وسط الميدان. تحريك الإبرة بحيث أنه لمس أن الجنين. استخدام مياداة مجهرية لاختراق الجنين مع الإبرة. ملاحظة: ستكون الجدار الرأسي للحوض الاغاروز حفاظ على الجنين من يتم دفعها جانبا الإبرة.
- يسمح الحل الحقن لتتدفق الجنين 1 أو 2 ثانية ثم قم بإزالة الإبرة بسرعة. إذا كان الجنين لديه أكثر من خلية واحدة، وضخ كل خلية على حدة. استخدام ملقط لإعادة توجيه الجنين لمحاذاة الخلية التالية مع رأس الإبرة.
- بعد امبري الأوليتم حقن س، نقل الطبق بحيث الجنين القادم في موضع الحقن وكرر الإجراء. تستمر حتى تم حقن جميع الأجنة.
4. التثقيف والتفقيس من الأجنة
- نقل كل من الأجنة المحقونة في صحن مع قليل من هيدرا التي لها الخصيتين (وهذا هو لضمان أن جميع الأجنة المخصبة). احتضان الأجنة في 18 ° C حاضنة في حين أنها لا تزال مرحلة التطور الجنيني.
- مرة واحدة يتم الوصول إلى مرحلة بشرة، نقل كل الأجنة لحقن بئر الفردي من 24 لوحة جيدا مليئة هيدرا المتوسطة.
- احتضان الأجنة المحقونة لمدة 2 أسابيع في الظلام في 18 ° C.
- بعد فترة الحضانة 2 الاسبوع، والتحقق من كل حقن الجنين تحت المجهر تشريح. ملاحظة أي الحالات التي فصل الجنين مرحلة بشرة من قطعة صغيرة من الأنسجة الأبوية وإعادة إحياء النسيج الأبوية. إزالة هذا سليلة مجدد فورا حتى أنه لا ميstaken لفقس البيض الجديد.
- نقل طبق من الأجنة المحقونة تحت ضوء حوض السمك في RT. تحقق لوحات كل يوم، وجمع سلحفاة صغيرة. سلحفاة صغيرة جديدة سوف تكون بيضاء لأن اللون الوردي نموذجية من الاورام الحميدة هيدرا يأتي من الأرتيميا يأكلون.
- مراقبة سلحفاة صغيرة تحت المجهر مضان للكشف عن التحوير التعبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إنشاء خطوط هيدرا المعدلة وراثيا
تغذية سلحفاة صغيرة المعدلة وراثيا كل 2-3 أيام مع يرقات الأرتيميا. سلحفاة صغيرة أحيانا لا تأكل لمدة يوم أو اثنين بعد الفقس. فإن بعض سلحفاة صغيرة جديدة تأكل أبدا، وبالتالي لن البقاء على قيد الحياة. إذا فقس البيض غير المعدلة وراثيا إما في الأدمة (الشكل 1A) أو الأنسجة الظهارية الأديم الباطن، والسماح للحيوان لبرعم وجمع البراعم التي تحتوي على الأنسجة الأكثر المعدلة وراثيا (الشكل 1B، C). مواصلة القيام بذلك مع براعم جديدة حتى يتم تأسيس خط المعدلة وراثيا مع التعبير الموحد للالتحوير سواء في الأدمة (الشكل 1D) أو النسب الظهارية الأديم الباطن. في نفس الوقت، يمكن إنشاء الخط الثاني الذي لا يحتوي على التحوير ولكن غير متطابقة وراثيا غير ذلك (الشكل 1B). يخدم هذا الخط كعنصر تحكم السلبية للتجارب المستقبلية. إذا لم الأنسجة المعدلة وراثيا ينتقل طn لبرعم، فمن الممكن في بعض الأحيان أن يقطع الحيوان والسماح لها لتجديد بحيث الأنسجة المعدلة وراثيا ستكون في منطقة جديدة في مهدها. ومع ذلك، إذا الأنسجة المعدلة وراثيا هي قريبة جدا من الحدود القصوى من المرجح أن تضيع عليه كما هو النازحين أثناء النمو الطبيعي للحيوان. غالبا ليس هناك ما يمكن القيام به في هذه الحالة. في أيدينا، إذا كان التحوير محايد (أي لا يوجد لديه تأثير على الوظيفة البيولوجية) ونحن قادرون على إنشاء خط الظهارية موحد من حوالي 30٪ من هيدرا أن يفقس مع الأنسجة الظهارية المعدلة وراثيا. 70٪ الباقية إما يموت أو يتم فقدان الأنسجة المعدلة وراثيا. خط الأديم الباطن ما يقرب من 2-3 أضعاف المشتركة باعتبارها خط الأدمة. إذا كان يتم استخدام التحوير الذي يعطل وظيفة بيولوجية، وهذا قد يكون لها تأثير على جدوى إنشاء خط موحد. في مثل هذه الحالات، سوف يكون المروجين محرض الإضافات الضرورية للأدوات.
إذا فقس البيض غير المعدلة وراثيافي النسب الخلالي، والسماح للحيوان لبرعم وجمع سلحفاة صغيرة مع زيادة عدد الخلايا المعدلة وراثيا في النسب الخلالي. أن ندرك أنه في بعض الأحيان ليس من الواضح على الفور أن وجود حيوان المعدلة وراثيا في النسب الخلالي، لا سيما إذا كان هو أيضا المعدلة وراثيا في النسب الظهارية. فمن المستبعد جدا أن خط المعدلة وراثيا تماما في النسب الخلالي سيتم إنشاء ببساطة عن طريق مهدها. إذا كان المطلوب أن يكون النسب الخلالي تماما المعدلة وراثيا، وهذا يمكن أن يتحقق عن طريق الاستنساخ في المجاميع الجذعية من خلالي الحيوانات المنضب الخلية بحيث يتم تأسيس سلالة كامل من الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا واحدة 7.
في الحالات التي يتم استخدام نوع معين المروج نسيجيا أو خلية لدفع التعبير عن بروتين فلوري، قد لا تكون الحيوانات المعدلة وراثيا واضحا في البداية. على سبيل المثال إذا تم استخدام المروج التي تنشط فقط في مخالب والتصحيح الأولي المعدلة وراثياهو في عمود الجسم، سوف ينظر أي خلايا الأنسجة الفلورسنت في فقس البيض. لذلك تحتاج كل سلحفاة صغيرة ليتم نشرها للسماح الأنسجة المعدلة وراثيا إلى أن نزوح إلى مخالب وأصبح واضحا.
الرقم 1. إنشاء خط المعدلة وراثيا مع التعبير موحد الظهارية الأديمي الظاهر من DsRed2. (A) لفقس البيض مع التعبير خيالية من التحوير DsRed2 تحت السيطرة على المروج الأكتين في رقعة من الخلايا الظهارية الأدمة. (B) والجيل الأول من برعم من فقس البيض في لوحة وتنتج الآن اثنين من البراعم الجديدة. المهد المسمى مع علامة النجمة ليس لديه الأنسجة المعدلة وراثيا، وكان يستخدم كما الحيوان المؤسسين لخط السيطرة مطابق وراثيا إلى خط المعدلة وراثيا، باستثناء وجود التحوير. (C) والجيل الثاني من برعمالمنتجة من هيدرا في لوحة B. (D) مثال على سليلة من خط المعدلة وراثيا التي تأسست مع DsRed2 التعبير في جميع أنحاء الأديم الظاهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هيدرا يستنسخ بشكل روتيني لاجنسيا، ولكنها تتطلب محفزات البيئية للبدء في إنتاج الأمشاج. لا تعرف جيدا هذه المحفزات لمعظم الأنواع وهيدرا قد تختلف من سلالة إلى سلالة. وهناك عقبة كبيرة في إنتاج المعدلة وراثيا هيدرا هو الحصول على الأجنة على أساس منتظم لأنه قد يكون من الصعب في إعداد مختبر للحث هيدرا ليصبح الجنسي. سلالة AEP 25، ومع ذلك، تنتج الأمشاج بسهولة في المختبر وهذه هي السلالة الوحيدة التي استخدمت حتى الآن لصنع خطوط المعدلة وراثيا. الأسلوب الأكثر شيوعا لإحداث إنتاج الأمشاج هو التلاعب من قبل النظام الغذائي. كما هو موضح سابقا، ويجب أن تغذى الحيوانات يوميا لمدة ثلاثة أسابيع والتجويع لمدة 5 أيام، ومن ثم تغذيتها مرتين في الأسبوع، حيث سيتم إنتاج الأمشاج الوقت 1. فقد كان أيضا تجربتنا أن زراعة AEP هيدرا على لوحات رأسية في حوض للماء 26، وربما محاكاة مورالبيئة الطبيعية الإلكترونية، يؤدي إلى إنتاج البيض حتى عندما يتم تغذية الحيوانات على فترات منتظمة. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول عليها من خطوط AEP الصلبان الذاتي تنتج أحيانا الأمشاج بانتظام أكثر من السلالة الأم. وبالتالي إنشاء خط F1 من AEP هي طريقة لآخر ممكن للحصول على مصدر أكثر موثوقية من الأجنة.
النسبة المئوية للأجنة التي تعيش الحقن وتطوير للمرحلة بشرة تعتمد على صحة الأجنة، وكمية من محلول يحقن، ومقدار الضرر الناجم عن الحقن. مع التدفق المستمر حقن انشاء الموصوفة في هذا البروتوكول، فإنه من الصعب التحكم في كمية الحل الذي يتم حقنه في جنين. في أيدينا، ما يقرب من نصف الأجنة حقن كما هو موضح هنا مرحلة التطور الجنيني كامل بنجاح وتشكيل بشرة. من هذه، 50-75٪ يفقس وتلك التي يفقس، وحوالي 50٪ يتلقى بعض الأنسجة المعدلة وراثيا على الأقل. ولذلك، 10-20٪ من الأجنة المحقونة في البداية تسفروهيدرا F1 مع الأنسجة المعدلة وراثيا. كمية المحلول المحقون يمكن التحكم بدقة مع معدات أكثر تكلفة مثل microinjector IM-300. وقدمت خطوط المعدلة وراثيا الأصلية مع المعدات من إيبندورف، والذي يسمح قدرا كبيرا من الدقة في معالجة وحقن الجنين. في حين أن هذا المستوى من الدقة قد يعطي معدل البقاء على قيد الحياة أعلى من الأجنة المحقونة، هذه النفقات ليست ضرورية لإنشاء الروتيني للخطوط المعدلة وراثيا.
دمج التحوير هو عشوائي ويحتمل أن تحدث في مواقع متعددة في الجينوم أو في مجموعة جنبا إلى جنب في مكان واحد. على أساس تحليل لطخة الجنوبي، وقدرت عدد التكامل في خمسة في خط المعدلة وراثيا الظهارية واحدة تم إنشاؤها مسبقا 1. في خط النسب المعدلة وراثيا الخلالي فيها التحوير يخضع انتقال سلالة الجرثومية، وقد تجلى ذلك من خلال تسلسل الجينوم التي كانت فقط نسخة واحدة من التحوير كثافة العملياتegrated (CE دانا وRE ستيل، والمراقبة غير منشورة). ومع ذلك، وبصرف النظر عن هذين المثالين، لا يوجد المعلومات المتاحة عن مواقع التكامل التحوير وعدد نسخها. لأنه من الممكن أن التحوير يمكن أن يقطع وظيفة الجين بواسطة الطفرات إقحامي، ينبغي بذل خط المعدلة وراثيا أكثر من واحدة عند تحليل الظواهر من بينها، على سبيل المثال، أو overexpression رني بنيات. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن التعبير التحوير هو التأسيسي عندما مدفوعا تستخدم عادة المروج الأكتين الجينات، وبالتالي الجينات المحورة التي تؤدي إلى الظواهر خطيرة أو قاتلة عندما أعرب جوهري لن يتم الحفاظ عليها. في المستقبل، سيكون من المهم وضع نظام محرض من التحوير التعبير للتحايل على هذه المشكلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل هارولد اند ليلى جائزة G. Y. ماذرز لHL ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R24 GM080527) إلى RESCEJ كان زميل ما بعد الدكتوراه NRSA (NIH F32GM9037222) ويدعم حاليا من قبل على جائزة تنمية عالم أبحاث إرشادهم من الوطني معهد للشيخوخة (K01AG04435). نود أن نشكر المراجعين للتعليقات مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
