Introduction
Hydra er blevet brugt til at studere regeneration, mønsterdannelse og stamceller til cirka 250 år 2 Hydra har en enkel kropsplan bestående af tre cellelinier:. Ektodermal epitel, endoderm epitel og interstitiel. Det rørformede legeme er dannet af ektodermal og endodermale epiteliale cellelinier, som hver er et enkelt cellelag. Alle de epiteliale celler i kroppen kolonnen er mitotisk. Når epitelceller forskydes i ekstremiteterne 3, hovedet (mund og fangarme) ved den mundtlige ende eller foden (basal disk) i aboral ende, de arrestere i G2-fasen af cellens cyklus og ændre celle skæbne 4. Cellerne i det interstitielle afstamning opholde sig mellemrummene mellem epitelceller. Denne slægt understøttes af multipotente stamceller, der er placeret i det ektodermale epitel lag af kroppen kolonne 5. De interstitielle stamceller giver anledning til tre somatiske cell typer (nerver, kirtel celler og nematocytes) og kønsceller 6,7.
Som medlem af phylum Cnidaria, søster gruppe til alle bilaterians kan Hydra kaste lys over de grundlæggende biologiske processer deles blandt flercellede dyr. Indtil for nylig blev disse bestræbelser hæmmes af manglen på pålidelige metoder til forstyrrelse af genfunktion. Men med udviklingen af transgene metode 1, er vi nu i stand til at drage fuld fordel af Hydra at få en bedre forståelse af de grundlæggende mekanismer er fælles for flercellede dyr, såsom stamceller funktion, regenerering og mønster. Transgene Hydra linjer er etableret ved injektion af plasmid DNA i embryoer, hvilket resulterer i tilfældig integration og kimære ekspression i en betydelig hyppighed af larver. En linje med ensartet udtryk i en bestemt slægt kan etableres ved ukønnet formering. Evnen til klonalt forplante transgENIC Hydra linjer er en fordel i forhold til flertallet af dyremodeller, som kan formeres kun ved seksuel reproduktion. Endvidere kan transgene celler spores let in vivo på grund af gennemsigtigheden af dyret og fraværet af endogene fluorescerende proteiner 8.
I de syv år, siden den første transgene Hydra linjer blev foretaget 1, sådanne linjer er blevet brugt til en lang række applikationer. Ekspression af fluorescerende proteiner i forskellige celletyper har gjort det muligt at spore celle bevægelse, observere ændringer i celleform og spore celleskæbner både vildtype betingelser og efter kemisk forstyrrelse 1,5,9-12. Desuden ekspressionen af forskellige fluorescerende proteiner i de forskellige afstamninger muliggør FACS isolering af specifikke cellepopulationer. Denne teknik er blevet anvendt til sekventering af stamceller specifikke mRNA og slægt-specifikke små RNA 13,14. Mens promotorenen af de to Hydra aktin gener har været mest udbredt, et par celletype-specifikke promotorer er blevet identificeret og anvendt til at drive ekspression af GFP i transgen Hydra 9,11,15,16. I fremtiden vil celletype-specifikke promotorer tillader observation og indsamling af en specifik celletype. Desuden blev en transgen tilgang med held anvendt til at definere de cis-virkende regulatoriske elementer af det Wnt3 promotoren 17.
Udviklingen af transgene metoder Hydra giver en robust metode til at teste funktionen af gener ved ektopisk ekspression, overekspression og knockdown. Transgene dyr er blevet gjort, som udtrykker fluorescens-mærkede proteiner for at undersøge både funktion og cellulær lokalisering 18-20. Hertil kommer, at ekspressionen af RNA-hårnåle i 3'UTR af GFP transgen fører til knockdown af målgener 21,22. I disse fremgangsmåder er påkrævet GFP at identificereog spore transgene væv under oprettelsen af den transgene linje. Det er imidlertid sandsynligt, at GFP-molekylet i nogle tilfælde ville interferere med funktionen af det mærkede protein. En nylig undersøgelse viser, at Hydra gener kan være anbragt i en operon-konfiguration, dvs er polycistroniske transkripter fremstillet, som derefter separeres ved trans-splejset leder tilsætning og oversat separat 23. Ved at placere et gen, der koder et protein eller et RNA hårnål i opstrøms position en operon og en fluorescerende protein-gen i den nedstrøms position, kan man spore transgene væv uden at mærke det gen der koder for proteinet eller RNA hårnål. Denne metode er blevet anvendt til at udtrykke en RNA hårnål i en operon konfiguration med DsRed2 for at opnå genet Knockdown 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af plasmid-DNA, nåle og Injection Dishes
- Forbered plasmid-DNA ved hjælp af et High Speed Maxi eller Midi kit og koncentrere DNA'et til 2,5 mg / ml ved anvendelse af ethanol udfældning. DNA-pelleten bør opløses i nuklease-frit deioniseret vand. Opbevar DNA i 10 til 20 ul alikvoter ved -20 ° C. (Se Supplerende Tabel 1 for en liste over tilgængelige vektorer)
- Lav en indsprøjtning skålen ved at bruge agarose at konstruere et trug til at holde embryoer i en 100 x 15 mm petriskål.
- Anbring en 75 x 50 objektglas i en 100 x 15 mm petriskål i en vinkel. Hæld ca. 50 ml 2% agarose smeltet i Hydra medium 24 ind i petriskålen. Alternativt hæld agarose i fadet først og flyde en "Mikroinjektion fisk Mold" på toppen.
- Efter agarosen er størknet, fjernes objektglasset eller formen. Hvis et objektglas blev anvendt skåret væk overskydende agarose med et barberblad blade at danne en væg. Hæld Hydra medium i skålen og bruge det med det samme eller gemme det ved 4 ° C indtil brug. Bemærk: Injection retter kan genbruges, hvis de opbevares ved 4 ° C mellem anvendelser.
- Træk nåle fra borsilikatglas kapillærer med et filament på mikropipette aftrækker anvendelse af følgende betingelser: varme 525, træk 75, hastighed 100, tid 50. Opbevar nåle ved at trykke dem ind i en smal strimmel af ler i en petriskål, således at de er holdes parallelt med bunden af skålen.
- Til fremstilling af injektionsopløsningen, kombinere 3 pi 2,5 mg / ml plasmid-DNA-opløsning med 2 pi 10% phenolrødt. Vortex løsningen kort og derefter dreje det i 10 min ved maksimal hastighed i en mikrocentrifuge for at fjerne eventuelle partikler, der kan tilstoppe nålen.
- Under et dissektionsmikroskop, klip nålen nogle få millimeter fra spidsen med en pincet til at skabe en lille åbning. Bemærk: Der er en vis fleksibilitet i den passende størrelse af den åbneing fordi trykket kan justeres i trin 3.3 til at rumme denne variation.
- Anbring petriskålen, således at den holder kanylen i en lodret stilling med spidsen nedad. Læg nålen med cirka 0,5 pi injektionsopløsning ved pipettering væsken ind i bagenden af nålen. Tillad kapillarvirkning for at trække opløsningen op i spidsen af nålen.
2. Udarbejdelse af embryoner til injektion
- På daglig basis scanne Hydra AEP stammen kultur for polypper, der producerer æg. Saml disse polypper og sæt dem til side i en separat kultur fad. Overhold disse polypper hver par timer i løbet af dagen til at overvåge udviklingen af æg dannelse. Når æggene bryde igennem ectoderm og sidde på en ring af tilbagetrukne ektodermal celler de er klar til injektion 25. Placer disse polypper i et fad med flere Hydra, der har testikler i mindst 1 time før injektionen for at muliggøre befrugtning. Hydra </ Em> hanner vil frigive sæd uden nogen særlig manipulation.
- Hvis der findes kvinder i AEP koloni med fuldt dannede æg, som er ca 400 um i diameter 25, eller på 1 til 8-celle stadiet embryoner også samle disse til injektion. Umiddelbart injicere embryoner, der er begyndt spaltning. Bemærk: Det er ikke muligt at se forskel på fuldt dannede æg og encellede zygoter, således disse skal inkuberes med hanner før injektion.
- Før injektion, fjerne det meste af forældrenes væv over og under foster ved hjælp af en skalpel med en # 15 klinge. Lad kun embryoet med et lille stykke af kroppen kolonne fastgjort, skal anvendes til at manipulere embryo med en pincet, hvis nødvendigt. Bemærk: Det væv, der dissekeres væk fra foster vil regenerere og skal gemmes for at sikre, at kvinder fortsat er i Hydra koloni.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette, flytte embryoner på injektion skålen, arrangere dem parallelt med væggen afagarose truget.
3. Mikroinjektion af plasmid-DNA
- Monter mikroinjektor på et magnetisk stativ, der sidder på en jernplade. Monter indehaveren injektion, som er den del af mikroinjektor der holder nålen på et joystick mikromanipulator. Monter joystick manipulator til jernplade, med en magnetisk stativ. Anbring hele denne opsætning på højre side af et dissektionsmikroskop og placer indehaveren injektion, således at det er synligt på observation område.
- Placer injektion skål med embryoner under dissektionsmikroskop, orienteret således, at den lodrette væg af agarose trug er til venstre. Stik nålen ind i holderen injektionen og sænke spidsen af nålen i Hydra medium i skålen.
- Langsomt dreje knappen af sprøjten i urets retning, indtil mineralolie fylder toppen af nålen, og en konstant strøm af injektionsopløsning observeres afslutter kanylen i Hydret medium. Hvis strømmen er for stærk, sænke trykket ved at dreje knappen mod uret. Øv dette trin for rutinemæssigt at opnå et passende tryk, som afhænger af størrelsen af nålen åbning (dvs. hvor nålen blev klippet i trin 1.5). Bemærk: Hvis strømmen er for stærk, vil embryonet ikke overleve injektionen.
- Mens du ser gennem dissektionsmikroskop flytte indsprøjtning skålen, så det første foster er i midten af feltet. Flytte nålen, så den rører det foster. Brug mikromanipulator at gennembore foster med nålen. Bemærk: Den lodrette væg af agarose truget vil holde embryonet bliver skubbet til side af nålen.
- Lad injektionsopløsningen at strømme ind i embryo 1 eller 2 sek, og derefter fjernes kanylen hurtigt. Hvis fosteret har mere end én celle, injiceres hver celle individuelt. Brug pincet til at omlægge foster for at tilpasse den næste celle med spidsen af nålen.
- Efter den første Embryo injiceres flytte skålen, så den næste foster er i injektion position og gentag proceduren; fortsætte, indtil alle fostre er blevet injiceret.
4. Dyrkning og klækning af embryoner
- Flyt alle de injicerede embryoner i en skål med et par Hydra, der har testiklerne (dette er at sikre, at alle embryoner befrugtet). Inkubér embryoner i en 18 ° C inkubator, mens de fortsætter embryogenese.
- Når kutikula stadium er nået, flytte hver injiceret embryon til en individuel brønd i en 24-brønds plade fyldt med Hydra medium.
- Inkuber de injicerede embryoner til 2 uger i mørke ved 18 ° C.
- Efter 2 uge inkubationstiden kontrolleres hvert injicerede embryon under dissektionsmikroskop. Bemærk de tilfælde, hvor neglebånd-trins foster er løsrevet fra den lille stykke af forældrenes væv og forældrenes væv er regenereret. Fjern denne regenereret polyp det samme, så det er ikke mistaken for en ny larve.
- Flyt parabol af injicerede embryoner under et akvarium lys ved stuetemperatur. Tjek pladerne hver dag og indsamle larver. Nye larver bliver hvid, fordi den typiske lyserøde farve Hydra polypper kommer fra Artemia, de spiser.
- Overhold de nyfødte under et fluorescens mikroskop til at opdage transgen ekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering transgene Hydra linjer
Feed transgene larver hver 2-3 dage med artemia. Larver nogle gange ikke spise for en dag eller to efter klækning. Nogle nye larver vil aldrig spiser, og derfor vil ikke overleve. Hvis nyudklækkede unge er transgene i enten ektodermal (figur 1A) eller endodermal epitelvæv, så dyret til at spire og indsamle de knopper, der har den mest transgene væv (figur 1B, C). Fortsæt med at gøre dette med de nye knopper indtil en transgen linie etableres med ensartet ekspression af transgenet i enten ektodermal (figur 1D) eller endoderm epitel afstamning. Samtidigt kan der etableres en anden linje, der ikke indeholder transgenet, men ellers er genetisk identisk (figur 1B). Denne linje tjener som en negativ kontrol for fremtidige eksperimenter. Hvis den transgene væv ikke bevæger sig into en knop, er det nogle gange muligt at skære dyret, og gør det muligt at regenerere sådan, at de transgene væv vil være i den nye spirende zone. Men hvis det transgene væv er for tæt på ekstremiteterne vil det sandsynligvis blive tabt som det forskydes under normal vækst af dyret. Ofte er der ikke noget, der kan gøres i dette tilfælde. I vores hænder, hvis transgen er neutral (dvs. ikke har nogen indvirkning på biologisk funktion) er vi i stand til at etablere en ensartet epitelial linje fra cirka 30% af Hydra at luge med epitelial transgene væv. De resterende 70% enten dø eller det transgene væv tabt. En endodermal linje er cirka 2-3 gange så almindeligt som en ektodermal linje. Hvis et transgen bliver brugt som forstyrrer biologisk funktion, kan det have indflydelse på mulighederne for at indføre en ensartet linje. I sådanne tilfælde vil inducerbare promotorer være væsentlige tilføjelser til toolkit.
Hvis nyudklækkede unge er transgenei interstitielle afstamning, så dyret til at spire og indsamle de nyfødte med et stigende antal af de transgene celler i det interstitielle afstamning. Vær opmærksom på, at nogle gange er det ikke umiddelbart klart, at et dyr er transgene i interstitielle afstamning, især hvis det er også transgen i en epitelial afstamning. Det er højst usandsynligt, at en linje helt transgen i det interstitielle afstamning vil blive etableret blot ved knopskydning. Hvis det er nødvendigt, at det interstitielle afstamning fuldt transgen, kan dette opnås ved kloning i aggregater fra interstitiel stamcellelignende forarmet dyr, således at hele afstamning er etableret fra en enkelt transgen stamcelle 7.
I tilfælde, hvor en vævs- eller celletype-specifik promotor anvendes til at drive ekspression af et fluorescerende protein, kan transgene dyr ikke være indlysende i første omgang. For eksempel, hvis en promotor, der kun er aktiv i fangarme anvendes, og den oprindelige plet transgenevæv i kroppen kolonnen ingen fluorescerende celler vil ses i nyudklækkede unge. Så alle nyfødte skal formeres for at give transgene væv, der skal forskydes ind fangarme og blive indlysende.
Figur 1. Etablering af en transgen linje med ensartet ektodermal epitelial udtryk for DsRed2. (A) en nyfødt med kimær ekspression af et DsRed2 transgen under kontrol af en actin-promotor i et plaster ectodermal epitelceller. (B) En første generation knop fra Hatchling i panel A er nu producerer to nye knopper. Den knop mærket med en stjerne har ingen transgent væv og blev anvendt som stiftende dyret til en styreledning, der er genetisk identisk med den transgene linje, bortset fra tilstedeværelsen af transgenet. (C) En anden generation knopproduceret af Hydra i panel B. (D) Et eksempel på en polyp fra den transgene linje, der blev etableret med DsRed2 udtryk over hele ektodermen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra rutinemæssigt gengiver ukønnet, men kræver miljømæssige stimuli at begynde at producere kønsceller. Disse stimuli ikke veldefineret for de fleste Hydra arter og kan afvige fra stamme til stamme. En væsentlig hindring for produktionen af transgene Hydra er at opnå embryoner på en regelmæssig basis, fordi det kan være svært i et laboratorium indstilling til at fremkalde Hydra at blive seksuelt. AEP-stamme 25, producerer imidlertid mælke let i laboratoriet, og dette er den eneste stamme, der har været anvendt hidtil til fremstilling af transgene linjer. Den mest almindelige metode til at inducere kønscelleproduktion er med diæt manipulation. Som tidligere beskrevet, skal dyrene fodres dagligt i tre uger, sultet i 5 dage og derefter fodret to gange om ugen, i hvilket tidsrum kønsceller vil blive produceret 1. Det har også været vores erfaring, at dyrkning af AEP Hydra den lodrette plader i et akvarium 26, måske simulerer en more naturlige miljø, fører til ægproduktion, selv når dyrene fodres med jævne mellemrum. Desuden linjer opnået fra AEP selvstændige kors undertiden producere kønsceller mere regelmæssigt end den forælder stamme. Udgør grundlaget for en F1-linje af AEP er en anden mulig metode til at opnå en mere pålidelig kilde af embryoner.
Den procentdel af embryoner, som overlever injektion og udvikle til neglebånd etape afhænger sundhed af embryonerne, mængden af injiceret opløsning, og mængden af skaderne som følge af injektionen. Med den konstante strøm injektion opsætning beskrevet i denne protokol, er det vanskeligt at styre mængden af opløsning, der injiceres i embryoet. I vores hænder, omkring halvdelen af de embryoner injiceret som beskrevet her fuldføre embryogenese og danne en neglebånd. Af disse 50-75% luge og af dem, som lugen, vil cirka 50% har i det mindste nogle transgene væv. Derfor, 10-20% af det oprindeligt injicerede embryoner opnåelseen F1 Hydra med transgene væv. Mængden af injiceret opløsning kan styres præcist med dyrere udstyr såsom IM-300 mikroinjektor. De oprindelige transgene linier blev udført med udstyr fra Eppendorf, hvilket giver en stor præcision i at manipulere og injektion af embryoet. Mens dette niveau af nøjagtighed kan give en højere overlevelsesrate injicerede embryoner denne udgift ikke er nødvendigt for rutinemæssig etablering af transgene linjer.
Integrationen af transgen er tilfældig og kan potentielt forekomme i flere steder i genomet eller i en tandem array i et enkelt sted. Baseret på Southern blot-analyse, blev antallet af integrationer anslået til fem i en epitelial transgene linje oprettede tidligere 1. I en interstitiel afstamning transgen linie, hvor transgenet undergår kimcellelinjetransmission, er det blevet påvist ved genom sekventering, at kun en enkelt kopi af transgenet var integrated (CE Dana og RE Steele, upubliceret observation). Men bortset fra disse to eksempler, der er ingen tilgængelige oplysninger om transgene integration sites og kopiere nummer. Da det er muligt, at et transgen kunne afbryde genfunktion ved insertionsmutagenese bør der gøres mere end én transgene linje, når man analyserer fænotyper fra for eksempel RNAi eller overekspression konstruktioner. Det er også vigtigt at bemærke, at transgen ekspression er konstitutiv, når den drives af den almindeligt anvendte actin-genet, og dermed transgener, der fører til alvorlige eller dødelige fænotyper, når de udtrykkes konstitutivt opretholdes ikke. For fremtiden vil det være vigtigt at udvikle et inducerbart system transgenekspression at omgå dette problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en G. Harold & Leila Y. Mathers Award til HL og en NIH tilskud (R24 GM080527) til RESCEJ var en NRSA postdoc (NIH F32GM9037222), og er i øjeblikket støttes af en mentored Forsker Udvikling Award fra National Institute on Aging (K01AG04435). Vi vil gerne takke de korrekturlæsere for nyttige kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
