Introduction
Hydra a été utilisée pour étudier la régénération, la formation de structures, et les cellules souches pour environ 250 ans 2 Hydra a un plan de corps simple composé de trois lignées cellulaires:. Épithélial ectodermique, endodermique épithéliale et interstitielle. Le corps tubulaire est formé par la ectodermiques et endodermiques lignées épithéliales, dont chacun est une couche cellulaire unique. Toutes les cellules épithéliales de la colonne de corps sont mitotique. Lorsque les cellules épithéliales sont déplacés dans les extrémités 3, la tête (bouche et les tentacules) à l'extrémité buccale ou le pied (disque de base) à la fin aborale, ils arrêtent dans la phase G2 du cycle cellulaire et de changer le destin des cellules 4. Les cellules de la lignée interstitiel se trouvent dans les interstices entre les cellules epitheliales. Cette lignée est supporté par des cellules souches multipotentes qui sont situés dans la couche épithéliale de la colonne ectodermique du corps 5. Les cellules souches interstitielles donnent naissance à trois cel somatiquel (les nerfs, les types de cellules de la glande, et nématocytes) et les cellules germinales 6,7.
En tant que membre de l'embranchement des cnidaires, le groupe frère de tous bilaterians, Hydra peut faire la lumière sur les processus biologiques fondamentaux communs chez les animaux multicellulaires. Jusqu'à récemment, ces efforts ont été entravés par le manque de méthodes fiables pour la perturbation de la fonction des gènes. Cependant, avec le développement de la méthodologie transgénique 1, nous sommes maintenant en mesure de profiter pleinement de Hydra à acquérir une meilleure compréhension des mécanismes de base communs aux animaux multicellulaires, tels que la fonction des cellules souches, la régénération et la structuration. Hydra lignées transgéniques sont créées par l'injection d'ADN plasmidique dans des embryons, ce qui conduit à une intégration aléatoire et d'expression chimère selon une fréquence importante des nouveau-nés. Une ligne avec une expression uniforme dans une lignée particulière peut être établie par multiplication asexuée. La capacité à se propager par clonage Transgenic Hydra lignes est un avantage par rapport à la majorité des modèles animaux, que l'on peut propager que par reproduction sexuée. En outre, les cellules transgéniques peuvent être facilement suivis in vivo en raison de la transparence de l'animal et de l'absence de protéines fluorescentes endogènes 8.
Au cours des sept années écoulées depuis les premières lignes Hydra transgéniques ont été faites 1, ces lignes ont été utilisés pour une variété d'applications. L'expression de protéines fluorescentes dans différents types de cellules a permis de suivre le mouvement des cellules, observer les changements dans la forme des cellules, et de suivre le destin des cellules à la fois dans des conditions de type sauvage et après perturbation chimique 1,5,9-12. En outre, l'expression de protéines fluorescentes différentes dans les différentes lignées pour FACS permet l'isolement de populations de cellules spécifiques. Cette technique a été utilisée pour le séquençage des ARNm spécifiques de cellules souches de lignée spécifique et de petits ARN 13,14. Bien que le promoteur del'un des deux gènes d'actine Hydra a été le plus largement utilisé, un des promoteurs spécifiques peu de type de cellule ont été identifiés et utilisés pour diriger l'expression de la GFP dans transgénique Hydra 9,11,15,16. Dans le futur, les promoteurs spécifiques du type cellulaire permettront l'observation et la collecte de tout type de cellule spécifique. En outre, une approche transgénique a été utilisé avec succès pour définir les éléments régulateurs agissant en cis du promoteur WNT3 17.
Le développement de méthodes transgéniques à Hydra fournit une approche robuste pour tester la fonction des gènes par l'expression ectopique, la surexpression et démontable. Les animaux transgéniques ont été faites qui expriment des protéines étiquetées par fluorescence afin d'examiner à la fois la fonction et la localisation cellulaire 18-20. En outre, l'expression d'épingles à cheveux d'ARN dans la région 3'UTR d'un transgène de la GFP conduit à knockdown de gènes cibles 21,22. Dans ces approches GFP est nécessaire pour identifieret suivre le tissu transgénique lors de la création de la lignée transgénique. Cependant, il est probable que dans certains cas, la molécule de GFP interférerait avec la fonction de la protéine marquée. Une étude récente démontre que les gènes Hydra peuvent être disposés dans une configuration de l'opéron, c'est à dire, la transcription polycistronique sont réalisés, qui sont ensuite séparés par plus de trans-épissage et la traduction dirigeant séparément 23. En plaçant un gène codant pour une protéine ou un ARN en épingle à cheveux dans la position en amont de l'opéron et un gène de la protéine fluorescente dans la position en aval, on peut suivre le tissu transgénique sans avoir à étiqueter le gène codant pour la protéine ou de l'ARN en épingle à cheveux. Cette méthode a été utilisée pour exprimer un ARN en épingle à cheveux dans une configuration de l'opéron avec DsRed2 pour atteindre gène knockdown 14.
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Protocol
1 Préparation de l'ADN plasmidique, aiguilles, et plats d'injection
- Préparer l'ADN de plasmide en utilisant un kit High Speed Maxi ou Midi et concentrer l'ADN à 2,5 mg / ml en utilisant une précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN doit être dissous dans de l'eau désionisée exempte de nucléase. Stocker l'ADN en 10-20 aliquotes pi à -20 ° C. (Voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste de vecteurs disponibles)
- Faire un plat d'injection à l'aide d'agarose pour construire un creux pour la tenue des embryons dans une boîte de 100 x 15 mm Petri.
- Placez une lame de microscope 75 x 50 en verre dans une boîte de 100 x 15 mm de Petri à un angle. Verser environ 50 ml de 2% d'agarose fondu dans un milieu Hydra 24 dans la boîte de Pétri. Sinon, versez l'agarose dans le premier plat et flotter un "moule microinjection Fish" sur le dessus.
- Après la solidification de l'agarose, retirer la lame de verre ou le moule. Si une lame de verre a été utilisé, coupez l'excès d'agarose avec un bla de rasoirde pour former un mur. Verser moyen Hydra dans le plat et l'utiliser immédiatement ou stocker à 4 ° C jusqu'au moment de servir. Note: plats d'injection peuvent être réutilisés s'ils sont conservés à 4 ° C entre les utilisations.
- Tirez aiguilles de capillaires en verre borosilicate avec un filament sur l'extracteur de micropipette utilisant les conditions suivantes: chauffer 525, tirez 75, vitesse 100, temps 50. magasins les aiguilles en les appuyant dans une étroite bande de terre dans une boîte de Pétri tels qu'ils sont maintenue parallèlement au fond de la boîte.
- Pour préparer la solution injectable, mélanger 3 ul de 2,5 mg / ml de solution d'ADN plasmidique avec 2 ul de 10% de rouge de phénol. Vortex la solution brièvement, puis tourner pendant 10 min à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pour éliminer les particules qui pourraient obstruer l'aiguille.
- Sous un microscope de dissection, couper l'aiguille à quelques millimètres de la pointe avec une pince pour créer une petite ouverture. Remarque: Il ya une certaine flexibilité dans la taille appropriée de l'ouverturement parce que la pression peut être ajustée à l'étape 3.3 pour tenir compte de cette variation.
- Placer la boîte de Petri de sorte qu'il tient l'aiguille dans une position verticale avec la pointe vers le bas. Charger l'aiguille à environ 0,5 ul d'une solution d'injection par aspiration du liquide dans l'extrémité arrière de l'aiguille. Laisser une action capillaire pour tirer la solution dans la pointe de l'aiguille.
2 Préparation d'embryons pour injection
- Sur une base quotidienne analyser la souche culture Hydra AEP pour les polypes produisant des œufs. Recueillir ces polypes et les mettre de côté dans une boîte de culture distincte. Observez ces polypes toutes les quelques heures pendant la journée pour surveiller la progression de la formation des oeufs. Lorsque les œufs briser l'ectoderme et assis sur un anneau de cellules ectodermiques rentrés, ils sont prêts pour l'injection 25. Placez ces polypes dans un plat avec plusieurs Hydra qui ont des testicules pendant au moins 1 heure avant l'injection pour permettre la fécondation. Hydra </ Em> hommes sortira sperme sans aucune manipulation particulière.
- Si femelles se trouvent dans la colonie AEP avec des oeufs entièrement formées, qui sont d'environ 400 pm de diamètre 25, ou de 1 à embryons au stade 8 cellules, aussi collecter ces injectable. Injecter immédiatement les embryons qui ont commencé clivage. Remarque: Il n'est pas possible de faire la différence entre les œufs entièrement formés et zygotes unicellulaires, donc ceux-ci doivent être incubées avec des hommes avant injection.
- Avant l'injection, éliminer la majeure partie du tissu parental au-dessus et au-dessous de l'embryon à l'aide d'un scalpel à lame # 15. Laisser l'embryon avec seulement une petite partie de la colonne de corps fixé, à être utilisée pour manipuler l'embryon avec des pinces, si nécessaire. Remarque: Le tissu qui est disséquée à partir de l'embryon se régénérer et doit être sauvé à veiller à ce que les femelles restent dans la colonie Hydra.
- En utilisant une pipette Pasteur, les embryons à déplacer la boîte d'injection, les agencer en parallèle à la paroi de l'auge agarose.
3 microinjection de l'ADN de plasmide
- Montez le micro-injecteur sur un support magnétique qui se trouve sur une plaque de fer. Monter le support d'injection, qui est la partie de la micro-injecteur qui maintient l'aiguille, sur un micromanipulateur du joystick. Montez le manipulateur de joystick vers la plaque de fer, avec un support magnétique. Placer l'ensemble de cette mise en place sur le côté droit d'un microscope à dissection et positionner le support d'injection de sorte qu'il est visible dans le champ d'observation.
- Placer la cuvette d'injection avec des embryons au microscope à dissection, orientée de telle sorte que la paroi verticale de la cuve est de l'agarose à gauche. Insérez l'aiguille dans le support d'injection et de réduire la pointe de l'aiguille dans le milieu Hydra dans le plat.
- Lentement tourner le bouton de la seringue dans le sens horaire jusqu'à ce que l'huile minérale remplit le haut de l'aiguille et un flux constant de solution d'injection est observée sortant l'aiguille dans le hydrun milieu. Si le courant est trop fort, baisser la pression en tournant dans le sens inverse. La pratique de cette étape afin d'obtenir systématiquement une pression appropriée, qui dépend de la taille de l'ouverture de l'aiguille (par exemple, la façon dont l'aiguille est encliqueté dans l'étape 1.5). Remarque: Si le flux est trop fort, l'embryon ne survivra pas l'injection.
- Lors de la visualisation au microscope de dissection, déplacer la coupelle d'injection de sorte que le premier embryon est au centre du champ. Déplacer l'aiguille de sorte qu'il est en contact avec l'embryon. Utiliser le micromanipulateur pour percer l'embryon avec l'aiguille. Remarque: La paroi verticale de l'auge d'agarose permet de garder l'embryon d'être poussé de côté par l'aiguille.
- Laisser la solution d'injection de s'écouler dans l'embryon 1 ou 2 secondes, puis retirez l'aiguille rapidement. Si l'embryon a plus d'une cellule, chaque cellule injecter individuellement. Utiliser des pinces pour réorienter l'embryon à aligner la cellule suivante avec la pointe de l'aiguille.
- Après la première Embryo est injecté, déplacer le plat afin que la prochaine embryon est dans la position d'injection et répétez la procédure; continuer jusqu'à ce que tous les embryons ont été injectés.
4 La culture et d'incubation des embryons
- Déplacer tous les embryons injectés dans un plat avec un peu Hydra qui ont des testicules (ce qui est de veiller à ce que tous les embryons sont fécondés). Incuber les embryons dans un incubateur à 18 ° C tout en continuant l'embryogenèse.
- Une fois l'étape de la cuticule est atteint, déplacer chaque embryon injecté à un puits individuel d'une plaque de 24 puits rempli de milieu Hydra.
- Incuber les embryons injectés pour 2 semaines à l'obscurité à 18 ° C.
- Après la période d'incubation de 2 semaines, vérifier chaque embryon injecté sous la loupe binoculaire. Notez tous les cas où l'embryon cuticule étape a détachés du petit morceau de tissu parental et le tissu parentale a régénérés. Retirer ce polype régénéré immédiatement de sorte qu'il n'est pas miStaken pour un nouveau nouveau-nés.
- Déplacez le plat d'embryons injectés sous une lumière d'aquarium à température ambiante. Vérifiez les plaques chaque jour et de recueillir des nouveau-nés. Larves nouveau-nées seront blancs parce que la couleur rose typique de polypes Hydra vient de l'Artemia qu'ils mangent.
- Respecter les nouveau-nés sous un microscope à fluorescence pour détecter l'expression du transgène.
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Representative Results
L'établissement de lignes Hydra transgéniques
Nourrir les nouveau-nés transgéniques tous les 2-3 jours avec des nauplii d'Artemia. Les nouveau-nés parfois ne mangent pas pendant un jour ou deux après l'éclosion. Certaines larves nouveau-nées seront jamais manger, et ne seront donc pas survivre. Si le nouveau-nés est transgénique soit dans l'ectoderme (figure 1A) ou tissu épithélial endodermique, permettre à l'animal de bourgeon et de recueillir les bourgeons qui ont le tissu le plus transgénique (figure 1B, C). Continuer à faire cela avec les nouveaux bourgeons jusqu'à une lignée transgénique est établie avec l'expression uniforme du transgène soit dans le ectodermique (figure 1D) ou de la lignée épithéliale endodermique. Simultanément, une deuxième ligne peut être établi qui ne contient pas le transgène mais est par ailleurs génétiquement identique (figure 1B). Cette ligne sert de contrôle négatif pour les expériences futures. Si le tissu transgénique ne bouge pas into un bourgeon, il est parfois possible de couper l'animal et lui permettre de se régénérer de telle sorte que le tissu transgénique sera dans la nouvelle zone en herbe. Toutefois, si le tissu transgénique est trop près des extrémités, il sera probablement perdu lors de son déplacement au cours de la croissance normale de l'animal. Souvent, il n'y a rien qui peut être fait dans ce cas. Dans nos mains, si le transgène est neutre (c'est à dire, n'a pas d'incidence sur la fonction biologique), nous sommes en mesure d'établir une ligne épithéliale uniforme d'environ 30% de Hydra qui éclosent avec le tissu épithélial transgénique. Les 70% restants, soit mourir ou le tissu transgénique est perdu. Une ligne de endodermique est d'environ 2-3 fois plus communes que d'une ligne de ectodermique. Si un transgène est utilisé qui perturbe la fonction biologique, cela peut avoir un impact sur la possibilité d'établir une ligne de conduite uniforme. Dans de tels cas, des promoteurs inductibles seront ajouts essentiels à la boîte à outils.
Si le nouveau-nés est transgéniquedans la lignée interstitielle, permet à l'animal de bourgeon et de recueillir les nouveau-nés avec un nombre croissant de cellules transgéniques dans la lignée interstitielle. Soyez conscient que, parfois, il n'est pas évident qu'un animal transgénique dans la lignée interstitielle, surtout si elle est aussi dans une lignée transgénique de l'épithélium. Il est hautement improbable que une ligne complètement transgénique dans la lignée interstitielle sera établi simplement en herbe. S'il est nécessaire que la lignée transgénique interstitiel soit entièrement, ceci peut être accompli par clonage dans des agrégats provenant d'animaux appauvri de cellules souches interstitiel tel que l'ensemble de la lignée est établie à partir d'une seule cellule transgénique de la tige 7.
Dans le cas où un promoteur spécifique de type tissulaire ou de la cellule est utilisée pour diriger l'expression d'une protéine fluorescente, des animaux transgéniques peuvent ne pas être évident au départ. Par exemple, si un promoteur qui est actif seulement dans les tentacules est utilisé et de la pièce initiale transgéniquetissu est dans la colonne de corps, pas de cellules fluorescentes sera vu dans le nouveau-nés. Donc, tous les nouveau-nés doivent être propagés à permettre au tissu transgénique à être déplacé dans les tentacules et devenu évident.
Figure 1: Établir une lignée transgénique avec uniforme expression épithéliale ectodermique de DsRed2. (A) Un nouveau-nés à l'expression d'un transgène chimérique DsRed2 sous le contrôle d'un promoteur d'actine dans un patch de cellules épithéliales ectodermiques. (B) Un bourgeon de la nouveau-nés dans la partie A est produit aujourd'hui deux nouveaux bourgeons de première génération. Le bouton marqué d'un astérisque dispose pas de tissu et transgénique a été utilisé en tant que l'animal fondateur pour une ligne de commande qui est génétiquement identique à la lignée transgénique, à l'exception de la présence du transgène. (C) Un bourgeon de deuxième générationproduite à partir de l'Hydre dans la partie B. (D) Un exemple d'un polype de la lignée transgénique qui a été établi avec l'expression DsRed2 tout au long de l'ectoderme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Hydra reproduit régulièrement de façon asexuée, mais nécessite des stimuli environnementaux pour commencer gamètes producteurs. Ces stimuli ne sont pas bien définis pour la plupart des espèces Hydra et peuvent différer d'une souche à. Un obstacle important à la production de transgéniques Hydra est l'obtention d'embryons sur une base régulière, car il peut être difficile dans un environnement de laboratoire pour induire Hydra pour devenir sexuelle. La souche 25 AEP, cependant, produit des gamètes facilement dans le laboratoire, ce qui est la seule souche qui a été utilisé jusqu'à présent pour la fabrication de lignées transgéniques. La méthode la plus courante pour induire la production de gamètes est par manipulation de la diète. Comme décrit précédemment, les animaux doivent être nourris quotidiennement pendant trois semaines, affamés pendant 5 jours, puis nourris deux fois par semaine, au cours de laquelle les gamètes de temps seront produites 1. Il a aussi été notre expérience que la culture AEP Hydra sur des plaques verticales dans un aquarium 26, peut-être simuler un more environnement naturel, conduit à la production d'œufs, même lorsque les animaux sont alimentés à intervalles réguliers. En outre, les lignes obtenues à partir de la AEP auto-croisements produisent parfois des gamètes plus régulièrement que la souche parente. Ainsi la création d'une ligne de F1 de l'AEP est une autre méthode possible pour obtenir une source plus fiable d'embryons.
Le pourcentage d'embryons qui survivent injection et se développent à l'étape de la cuticule dépend de la santé des embryons, la quantité de solution injectée, et le montant des dommages causés par l'injection. Avec l'injection de flux constant configuration décrite dans ce protocole, il est difficile de contrôler la quantité de solution qui est injectée dans l'embryon. Dans nos mains, environ la moitié des embryons injectés comme décrit ici l'embryogenèse réussir et former une cuticule. Parmi ceux-ci, 50-75% trappe et de ceux qui éclosent, environ 50% ont au moins un peu de tissu transgénique. Par conséquent, 10 à 20% des embryons injectés initialement donnéun Hydra F1 avec le tissu transgénique. La quantité de solution injectée peut être contrôlée avec précision par des équipements plus coûteux tels que le IM-300 microinjecteur. Les lignées transgéniques ont été effectuées avec des originaux à partir de l'équipement Eppendorf, ce qui permet une grande précision dans la manipulation et l'injection de l'embryon. Bien que ce niveau de précision peut donner un taux de survie plus élevé des embryons injectés, cette dépense n'est pas nécessaire pour l'établissement de routine des lignées transgéniques.
L'intégration du transgène est aléatoire et pourrait potentiellement se produire à plusieurs endroits dans le génome ou dans un tableau en tandem dans un seul endroit. Sur la base de l'analyse par transfert de Southern, le nombre d'intégrations a été estimé à cinq dans une lignée transgénique créé précédemment épithéliale 1. Dans une lignée transgénique de lignée interstitiel, dans lequel le transgène est soumis à la transmission de la lignée germinale, il a été démontré par le séquençage du génome qu'une seule copie du transgène était integrated (CE Dana et RE Steele, observation non publiée). Cependant, à part ces deux exemples, il n'y a pas d'information disponible concernant les sites d'intégration du transgène et le nombre de copies. Comme il est possible que un transgène pourrait interrompre la fonction des gènes par mutagenèse insertionnelle, plus d'une lignée transgénique doit être faite lors de l'analyse de phénotypes, par exemple, la surexpression d'ARNi ou constructions. Il est également important de noter que l'expression du transgène est constitutive lorsqu'il est entraîné par le promoteur du gène de l'actine couramment utilisé, et donc des transgènes qui conduisent à des phénotypes graves ou mortels lorsqu'ils sont exprimés de manière constitutive sera pas maintenue. Pour l'avenir, il sera important de développer un système inductible de l'expression du transgène pour contourner ce problème.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une Harold & Leila Y. Mathers prix G. de HL et une subvention du NIH (R24 GM080527) à RESCEJ était un boursier postdoctoral NRSA (NIH F32GM9037222) et est actuellement soutenu par une bourse de mentorat recherches pour le développement scientifique de la National Institut sur le vieillissement (K01AG04435). Nous tenons à remercier les lecteurs pour leurs commentaires utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
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