דור של הטרנסגניים Published: September 11, 2014 doi: 10.3791/51888

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Celina E. Juliano¹, Haifan Lin¹, Robert E. Steele²

¹Yale Stem Cell Center and Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine, ²Department of Biological Chemistry and the Developmental Biology Center, University of California, Irvine

Introduction

הידרה נעשתה שימוש כדי ללמוד התחדשות, היווצרות דפוס, ותאי גזע עבור כ 250 שנים ² יש הידרה תכנית גוף פשוטה המורכבת של שושלות שלושה תאים:. אפיתל ectodermal, אפיתל endodermal, וביניים. הגוף צינורי נוצר על ידי ectodermal ושושלות אפיתל endodermal, כל אחד מהם הוא שכבת תא בודדת. כל תאי האפיתל בעמודת הגוף הם mitotic. כאשר תאי האפיתל הם עקורים לגפיים ^3, הראש (פה וזרועות) בסוף הפה או ברגל (הדיסק הבסיסי) בסוף aboral, הם יעצרו בשלב G2 של מחזור התא ולשנות תא גורל ^4. התאים של שושלת ביניים מתגוררים בתוך החללים שבין תאי האפיתל. שושלת זו נתמכת על ידי תאי גזע multipotent הנמצאים בשכבת האפיתל ectodermal של העמודה גוף ^5. תאי גזע ביניים מעוררים שלושה cel סומטייםסוגי l (עצבים, תאי בלוטה, וnematocytes) ותאי הנבט ^6,7.

כחבר המיון הצמחי Cnidaria, קבוצת האחות לכל bilaterians, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים בין בעלי חיים רב תאיים. עד לאחרונה, מאמצים אלה הקשו על ידי החוסר של שיטות אמינות להפרעות של תפקוד גן. עם זאת, עם התפתחותה של המתודולוגיה מהונדס ^1, אנו יכולים לנצל את מלוא יתרונות של הידרה כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב תאיים, כגון תפקוד תאי גזע, התחדשות, ודפוסים עכשיו. קווים המהונדס הידרה נקבעים על ידי הזרקה של DNA פלסמיד לעוברי, מה שגורם אינטגרציה אקראית וביטוי chimeric בתדירות משמעותית של גוזלים. קו עם ביטוי אחיד בשושלת מסוימת יכול להיות שהוקם על ידי התפשטות מינית. היכולת להפיץ transg clonallyenic הידרה קווים היא יתרון על רוב המודלים של בעלי חיים, אשר יכול להיות מופץ רק על ידי רבייה מינית. בנוסף, ניתן לעקוב אחר תאים מהונדסים בקלות in vivo בשל השקיפות של בעלי החיים והעדר חלבוני ניאון אנדוגני ^8.

בשבע השנים שחלפה מאז קווי הידרה מהונדסים הראשונים נעשו ^1, קווים כאלה היו בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים. ביטוי של חלבוני ניאון בתאים מסוגים שונים, הפך אותו ניתן לעקוב אחר תנועת תא, לצפות בשינויים בצורת תא, ולעקוב אחר גורל תא הן בתנאים מסוג בר ולאחר ההפרעות כימיות ^1,5,9-12. בנוסף, ביטוי של חלבוני ניאון שונים בשושלות השונות מאפשר לבידוד FACS של אוכלוסיות תאים ספציפיות. טכניקה זו הייתה בשימוש כבר הרצף של mRNAs הספציפי בתאי הגזע וRNA הקטן השושלת הספציפית ^13,14. בעוד האמרגן שלאחד משני הגנים אקטין הידרה כבר בשימוש נרחב ביותר, יזמים מסוימים כמה תאים מסוג זוהו ולהשתמש בכונן ביטוי של GFP בהידרה המהונדס ^9,11,15,16. בעתיד, יזמים ספציפיים תא מהסוג יאפשר לתצפית והאיסוף של כל סוג תא מסוים. בנוסף, גישה מהונדס הייתה בהצלחה המשמשת להגדרת האלמנטים רגולטוריים cis-בפועל של אמרגן Wnt3 ^17.

פיתוח שיטות מהונדסים בהידרה מספק גישה חזקה לבדיקת תפקודם של גנים על ידי ביטוי מחוץ לרחם, ביטוי יתר, ומציאה. בעלי חיים מהונדסים נעשו שמבטאים חלבוני fluorescently- מתוייגים על מנת לבחון שתי פונקציה ולוקליזציה סלולרית ^18-20. בנוסף, הביטוי של סיכות ראש RNA ב3'UTR של transgene GFP מוביל למציאה של גני המטרה ^21,22. בגישות אלה נדרש GFP לזהותולעקוב אחר הרקמות מהונדסים במהלך היצירה של הקו המהונדס. עם זאת, סביר להניח כי במקרים מסוימים מולקולת GFP הייתה מפריעה לתפקוד של החלבון מתויג. מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי ניתן לארגן גני הידרה בתצורת אופרון, כלומר, תעתיקי polycistronic נעשים, אשר לאחר מכן הם מופרדים על ידי בנוסף, מנהיג שחבור טרנס ותורגמו בנפרד ^23. על ידי הצבת גן קידוד חלבון או סיכת ראש RNA במצב במעלה הזרם של אופרון וגן חלבון פלואורסצנטי בעמדה במורד הזרם, אחד יכול לעקוב אחר רקמות מהונדסים מבלי לתייג את הגן המקודד את חלבון סיכת הראש או RNA. שיטה זו נעשתה שימוש כדי להביע את סיכת ראש RNA בתצורת אופרון עם DsRed2 על מנת להשיג גן מציאה ^14.

Protocol

.1 הכנת פלסמיד דנ"א, מחטים, וכלי הזרקה

1. הכן את פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת High Speed ​​מקסי או מידי ולהתרכז DNA ל2.5 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות משקעים אתנול. גלולה DNA צריכה להיות מומסת במים ללא יוני nuclease חינם. אחסן את הדנ"א ב10-20 aliquots μl ב -20 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת משלים 1 לרשימה של וקטורים זמינים)
2. תן מנה הזרקה באמצעות agarose לבנות שוקת להחזקת עוברים בצלחת פטרי 100 x 15 מ"מ.
   1. מקום שקופית מיקרוסקופ 75 x 50 זכוכית לתוך 100 x 15 מ"מ צלחת פטרי בזווית. יוצקים כ 50 מ"ל של 2% מומס agarose במדיום הידרה ²⁴ לתוך צלחת פטרי. , לחלופין לשפוך agarose לתוך הצלחת הראשונה ולצוף "עובש Microinjection דגים" על גבי.
   2. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את שקופית הזכוכית או העובש. אם שקופיות זכוכית שימשה, לחתוך agarose העודף עם bla גילוחדה ליצירת קיר. יוצקים בינוני הידרה לתוך הצלחת ולהשתמש בו באופן מיידי או לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הזרקה אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים: הערה.
3. משוך מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה על חולץ micropipette באמצעות התנאים הבאים: לחמם 525, למשוך 75, מהירות 100, זמן 50. חנות המחטים על ידי לחיצה על אותם לתוך רצועה צרה של חימר בצלחת פטרי באופן שהם במקביל מוחזק לתחתית הצלחת.
4. כדי להכין את פתרון ההזרקה, לשלב 3 μl של 2.5 מ"ג / פתרון פלסמיד דנ"א מ"ל עם 2 μl של 10% פנול אדומים. מערבולת הפתרון לזמן קצר ולאחר מכן לסובב אותו עבור 10 דקות במהירות המרבית בmicrocentrifuge כדי להסיר כל חלקיקים שעלולות לסתום את המחט.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח, קליפ המחט כמה מילימטרים מהקצה עם מלקחיים כדי ליצור פתח קטן. הערה: יש גמישות מסוימת בגודל המתאים של פתוחing כי הלחץ יכול להיות מותאם בשלב 3.3 ליתאים למגוון הזה.
6. מניחים את צלחת פטרי, כך שהוא מחזיק את המחט במצב אנכי עם את הקצה. טען את המחט עם כ 0.5 μl של פתרון הזרקה ידי pipetting את הנוזל לתוך הקצה האחורי של המחט. לאפשר פעולת נימים למשוך את הפתרון לקצה המחט.

2 הכנת עוברים להזרקה

1. על בסיס יומי לסרוק תרבות זן הידרה AEP לפוליפים בייצור ביצים. לאסוף פוליפים אלה ולהגדיר אותם בצד בצלחת תרבות נפרדת. שים לב פוליפים אלה כל כמה שעות במהלך היום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות ביצה. כאשר ביצים לפרוץ את האאקטודרם ולשבת על טבעת של תאי ectodermal חזרו בו הם מוכנים להזרקה ^25. הנח פוליפים אלה בצלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים במשך שעה לפחות 1 לפני ההזרקה כדי לאפשר הפריה. הידרה </ Em> זכרים ישחררו זרע ללא כל מניפולציה מיוחדת.
2. אם נשים נמצאות במושבה AEP עם ביצים בנויות באופן מלא, שהם כ 400 מיקרומטר בקוטר ^25, או 1 לעוברי שלב 8 תאים, גם לאסוף אלה להזרקה. מייד להזריק עוברים שנכתבו על דבקות. הערה: לא ניתן להבחין בהבדל בין ביצים בנויות באופן מלא וzygotes חד תאי, ובכך אלה צריכים להיות מודגרות עם זכרים לפני ההזרקה.
3. לפני ההזרקה, להסיר את רוב רקמת ההורים מעל ומתחת לעובר באמצעות אזמל עם להב # 15. השאר רק את העובר עם חתיכה קטנה של טור גוף המצורף, כדי לשמש כדי לתפעל את העובר עם מלקחיים במידת צורך. הערה: הרקמה שגזורה מאת העובר יהיה להתחדש וצריך להישמר כדי להבטיח שנשים יישארו במושבה הידרה.
4. בעזרת פיפטה פסטר, להעביר עוברים למנת ההזרקה, סידר אותם במקביל לקיר שלשוקת agarose.

.3 Microinjection של פלסמיד דנ"א

1. הר microinjector על דוכן מגנטי שיושב על צלחת ברזל. הר בעל ההזרקה, המהווה את החלק של microinjector שמחזיק את המחט, על micromanipulator ג'ויסטיק. הר מניפולטור ג'ויסטיק לצלחת הברזל, עם דוכן מגנטי. מניחים כל המכלול הזה בצד ימין של מיקרוסקופ לנתח ומקם את בעל ההזרקה כך שזה נראה לעין בתחום התצפית.
2. מניחים את צלחת ההזרקה עם עוברים מתחת למיקרוסקופ לנתח, אוריינטציה כך שהקיר האנכי של שוקת agarose הוא בצד השמאל. הכנס את המחט לתוך מחזיק ההזרקה ולהוריד את קצה המחט לתוך מדיום הידרה בצלחת.
3. לאט לאט לסובב את הידית של המזרק בכיוון השעון עד ששמן מינרלים ממלא את החלק העליון של המחט וזרם קבוע של פתרון הזרקה הוא ציין יציאת המחט לתוך hydrבינוני. אם הזרם חזק מדי, צריך להוריד את הלחץ על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון. לתרגל את הצעד הזה כדי להשיג לחץ מתאים, אשר תלוי בגודל של פתיחת המחט (כלומר, איך המחט הייתה מוצמדת בשלב 1.5) באופן שיגרתי. הערה: אם הזרם חזק מדי, העובר לא ישרוד את הזריקה.
4. בעת הצפייה באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להעביר את צלחת ההזרקה כך שהעובר הראשון הוא במרכז השדה. להזיז את המחט כך שהוא נוגע בעובר ש. השתמש micromanipulator כדי לחדור את העובר עם המחט. הערה: הקיר האנכי של שוקת agarose ישמור את העובר מהדחיפה הצידה על ידי המחט.
5. אפשר פתרון ההזרקה לזרום אל תוך שניות 1 או 2 עובר ולאחר מכן הסר את המחט במהירות. אם העובר יש תא אחד או יותר, להזריק כל תא בנפרד. שימוש במלקחיים לארגון מחדש של העובר כדי ליישר את התא הבא עם קצה המחט.
6. לאחר אמברי הראשוןo מוזרקת, להזיז את הצלחת כדי שהעובר הבא הוא בעמדת הזריקה ולחזור על התהליך; תמשיך עד שכל העוברים כבר הזריק.

.4 Culturing ובקיעה של עוברים

1. להעביר את כל העוברים הוחדרו לתוך צלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים (זה הוא להבטיח כי כל העוברים הם מופרה). דגירה עובר בחממת C ° 18 בעוד הם ממשיכים עובר.
2. ברגע שהוא הגיע לשלב שהציפורן, לעבור כל עובר מוזרק ולבודד של צלחת 24 גם מלאה בינוני הידרה.
3. דגירה עובר המוזרקת ל2 שבועות בחושך ב18 ° C.
4. לאחר תקופת הדגירה 2 בשבוע, לבדוק כל עובר מוזרק מתחת למיקרוסקופ לנתח. שים לב כל המקרים שבהם עובר ציפורן בשלב ניתק מהפיסה הקטנה של רקמת הורים ורקמת ההורים כבר התאחתה. הסר פוליפ מחדש זה מייד, כך שהוא לא מילstaken לגוזל חדש.
5. הזז את הצלחת של עוברים מוזרקים תחת אור אקווריום ב RT. בדוק את הצלחות בכל יום ולאסוף גוזלים. גוזלים חדשים יהיו לבנים כי הצבע הוורוד האופייני לפוליף הידרה מגיע מהארטמיה שהם אוכלים.
6. שים לב לגוזלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי transgene.

Representative Results

הקמת קווי הידרה מהונדסים

להאכיל את הגוזלים מהונדסים כל 2-3 ימים עם Nauplii הארטמיה. גוזלים לפעמים לא אוכלים ליום או ימים לאחר הבקיעה. כמה גוזלים חדשים לעולם לא לאכול, ולכן לא ישרדו. אם הגוזל הוא מהונדס באו ectodermal (איור 1 א) או רקמת האפיתל endodermal, לאפשר את בעל החיים לניצן ולאסוף את הניצנים שיש לי הרקמה המהונדס ביותר (איור 1 ב, ג). תמשיך לעשות את זה עם הניצנים החדשים עד קו מהונדס הוא הקים עם ביטוי אחיד של transgene באו ectodermal (1D איור) או שושלת אפיתל endodermal. במקביל, שורה שנייה ניתן לקבוע כי אינו מכילה את הגן, אבל הוא בדרך אחרת זהה מבחינה גנטית (איור 1). קו זה משמש כביקורת שלילית לניסויים עתידיים. אם הרקמה המהונדס לא זזה אניn כדי ניצן, זה לפעמים ניתן לחתוך את בעלי החיים ולאפשר לו להתחדש באופן שהרקמה המהונדס תהיה באזור הניצנים החדש. עם זאת, אם הרקמה המהונדס היא קרובה מדי לגפיים סביר להניח שיאבדו כפי שהוא נעקר במהלך הצמיחה הנורמלית של בעלי החיים. לעתים קרובות אין שום דבר שניתן לעשות במקרה זה. בידיים שלנו, אם את הגן הוא ניטראלית (כלומר, אין השפעה על תפקוד ביולוגי) אנו מסוגלים להקים קו אפיתל אחיד מכ 30% מהידרה שפתח עם רקמה מהונדס אפיתל. 70% הנותרים או למות או הרקמה המהונדס הולכת לאיבוד. שורת endodermal היא כ 2-3 פעמים נפוצות כמו שורת ectodermal. אם נעשה שימוש בtransgene שמשבשת את הפונקציה ביולוגית, עשוי להיות לכך השפעה על ההיתכנות של הקמת קו אחיד. במקרים כאלה, יזמים מושרה יהיו תוספות חיוניות לארגז הכלים.

אם הגוזל הוא מהונדסבשושלת ביניים, לאפשר את בעל החיים לניצן ולאסוף את הגוזלים עם מספר גדל והולך של תאים מהונדסים בשושלת ביניים. להיות מודע לכך שלפעמים זה לא ברור מייד שבעלי חיים הוא מהונדסים בשושלת ביניים, במיוחד אם הוא גם מהונדס בשושלת אפיתל. זה מאוד לא סביר כי קו לחלוטין מהונדס בשושלת ביניים יוקם פשוט על ידי ניצנים. אם יש צורך שבשושלת ביניים להיות מהונדס באופן מלא, זה יכול להתבצע על ידי שיבוט באגרגטים מבעלי חיים מדולדלי תאי גזע ביניים כך שכל השושלת הוקמה מתאי גזע מהונדסים יחידים ^7.

במקרים בהם יזם ברקמה או סוג התא ספציפי משמש לנהוג ביטוי של חלבון פלואורסצנטי, בעלי חיים מהונדסים לא יכולים להיות ברורים בהתחלה. לדוגמא, אם אמרגן שפעיל רק בזרועות משמש והתיקון הראשוני של מהונדסרקמה בעמודת הגוף, לא תאי ניאון יהיה לראות בגוזל. אז כל הגוזלים צריכים להיות מופצים כדי לאפשר לרקמות מהונדסים שנעקרו לזרועות ולהיות ברורים.

איור .1 קביעת קו מהונדס עם ביטוי אפיתל ectodermal האחיד של DsRed2. () גוזל עם ביטוי chimeric של transgene DsRed2 תחת שליטה של אמרגן אקטין בתיקון של תאי האפיתל ectodermal. ניצן דור ראשון מהגוזל בפנל כעת בייצור שני ניצנים חדשים (B). יש הניצן שכותרתו עם כוכבית לא רקמות מהונדסים ושמש כבעלי החיים המייסדים לקו שליטה שהוא זהה מבחינה גנטית לקו המהונדס, פרט לנוכחות של transgene. (C) ניצן דור שניהמופק מהידרה בB. פנל (ד ') דוגמא של פוליפ מהקו המהונדס שהוקם עם ביטוי DsRed2 ברחבי האאקטודרם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הידרה מתרבה באופן שגרתי לא מינית, אבל דורשת גירויים סביבתיים כדי להתחיל תאי מין הפקה. גירויים אלה אינם מוגדרים היטב עבור רוב מיני הידרה ועשויים להיות שונה מזן לזן. המשוכה משמעותית לייצור של הידרה המהונדס היא קבלת עוברים על בסיס קבוע, כי זה יכול להיות קשה בסביבת מעבדה כדי לגרום להידרה להפוך מיני. זן AEP ^25, לעומת זאת, מייצר תאי מין בקלות במעבדה וזה המתח היחיד שהיה בשימוש עד כה לביצוע קווים מהונדסים. השיטה הנפוצה ביותר לגרימת ייצור תא מין היא על ידי מניפולציה דיאטה. כפי שתואר לעיל, צריכים להיות מוזנים בעלי החיים מדי יום במשך שלושה שבועות, מורעב במשך 5 ימים, והאכילו אז פעמיים בשבוע, שבמהלכו תאי מין זמן יופק ^1. גם זה היה הניסיון שלנו שculturing AEP הידרה על צלחות אנכיות באקווריום ^26, אולי לדמות מורסביבה טבעית דואר, מוביל לייצור ביצים, גם כאשר בעלי חיים ניזונים במרווחי זמן קבועים. בנוסף, קווים המתקבלים מצלבים עצמיים AEP לפעמים לייצר תאי מין יותר באופן קבוע ממתח ההורה. כך הקמת קו F1 של AEP היא עוד שיטה אפשרית להשגת מקור אמין יותר של עוברים.

אחוז העוברים ששורדים הזרקה ולפתח לבמה לציפורן תלויה בבריאותם של העוברים, הסכום של פתרון מוזרק, ואת כמות הנזק שנגרמה על ידי ההזרקה. עם הגדרת זרימת הזרקה הקבועה שתוארה בפרוטוקול זה, שקשה לשלוט בכמות הפתרון שמוזרקת לתוך העובר. בידיים שלנו, כמחצית מהעוברים מוזרקת כפי שמתואר כאן עובר שלם בהצלחה ויוצר לציפורן. מתוכם, 50-75 צוהר% ושל אלה צוהר ש, 50 כ% יהיו לפחות כמה רקמות מהונדסים. לכן, 10-20% מהעוברים בתחילה הזריקו להניבהידרה F1 עם רקמה מהונדס. הסכום של פתרון המוזרק ניתן לשלוט במדויק עם ציוד יקר יותר כגון microinjector IM-300. הקווים מהונדסים המקוריים נעשו עם ציוד מאפנדורף, המאפשר מידה רבה של דיוק במניפולציה והזרקת העובר. בעוד רמה זו של דיוק עשויה לתת שיעור הישרדות גבוה יותר של עוברים מוזרקים, הוצאה זו אינה הכרחית להקמת שגרה של קווים מהונדסים.

השילוב של transgene הוא אקראי ועלול להתרחש במקומות רבים בגנום או במערך מקביל במקום אחד. בהתבסס על ניתוח כתם דרום, מספר האינטגרציות נאמד בחמש בשורה אחת אפיתל מהונדס שנוצרה בעבר ^1. בקו מהונדס שושלת ביניים שבו את הגן עובר שידור בתאי מין, זה הודגם על ידי רצף הגנום שרק עותק יחיד של transgene היה integrated (CE דנה ורי סטיל, תצפית לא פורסם). עם זאת, מלבד שתי דוגמאות אלה, יש אתרים אין מידע זמין לגבי transgene אינטגרציה ולהעתיק מספר. כיוון שניתן שtransgene עלול להפריע תפקוד גן על ידי mutagenesis insertional, יותר משורה אחת מהונדס צריך להיעשות בעת ניתוח פנוטיפים מ, למשל, מבני RNAi או ביטוי יתר. כמו כן, חשוב לציין כי ביטוי transgene מכונן הוא כאשר מונעים על ידי האמרגן הגן אקטין הנפוץ, ובכך transgenes שתוביל לפנוטיפים חמורים או קטלניים כאשר הביע constitutively לא יישמר. לעתיד, זה יהיה חשוב לפתח מערכת מושרה של ביטוי transgene לעקוף בעיה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151