Introduction
हाइड्रा उत्थान, पैटर्न गठन का अध्ययन, और लगभग 250 साल 2 के लिए स्टेम कोशिकाओं को इस्तेमाल किया गया है हाइड्रा तीन सेल प्रजातियों से मिलकर एक साधारण शरीर की योजना है. बहिर्जनस्तरीय उपकला, endodermal उपकला, और बीचवाला. ट्यूबलर शरीर एक एकल कोशिका परत है, जिनमें से प्रत्येक बहिर्जनस्तरीय और endodermal उपकला प्रजातियों, के द्वारा बनाई है. शरीर स्तंभ में उपकला कोशिकाओं के सभी mitotic हैं. उपकला कोशिकाओं extremities 3 में विस्थापित हो रहे हैं, एबोरल अंत में मौखिक अंत या पैर (बेसल डिस्क) पर सिर (मुंह और जाल), वे सेल चक्र की G2 चरण में गिरफ्तारी और सेल भाग्य 4 बदल जाते हैं. बीचवाला वंश की कोशिकाओं उपकला कोशिकाओं के बीच interstices के भीतर रहते हैं. इस वंश शरीर कॉलम 5 के बहिर्जनस्तरीय उपकला परत में स्थित हैं कि multipotent स्टेम कोशिकाओं द्वारा समर्थित है. बीचवाला स्टेम कोशिकाओं तीन दैहिक सेल को जन्म देएल प्रकार (नसों, ग्रंथि की कोशिकाओं, और nematocytes) और रोगाणु कोशिकाओं 6,7.
जाति नाइडेरिया के एक सदस्य के रूप में सभी bilaterians बहन समूह, हाइड्रा बहुकोशिकीय जानवरों के बीच साझा मौलिक जैविक प्रक्रियाओं पर प्रकाश डाला सकता है. अभी हाल तक, इन प्रयासों जीन समारोह की गड़बड़ी के लिए विश्वसनीय तरीकों की कमी से बाधा गया. हालांकि, ट्रांसजेनिक कार्यप्रणाली 1 के विकास के साथ, हम अब इस तरह के स्टेम सेल समारोह, उत्थान, और patterning के रूप में बहुकोशिकीय जानवरों, को आम बुनियादी तंत्र की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए हाइड्रा का पूरा लाभ लेने के लिए सक्षम हैं. ट्रांसजेनिक हाइड्रा लाइनों hatchlings का एक बड़ा आवृत्ति में यादृच्छिक एकीकरण और काइमेरिक अभिव्यक्ति में जो परिणाम भ्रूण में प्लाज्मिड डीएनए, इंजेक्शन द्वारा स्थापित कर रहे हैं. एक खास वंश में वर्दी अभिव्यक्ति के साथ एक लाइन अलैंगिक प्रचार के द्वारा स्थापित किया जा सकता है. clonally transg प्रचार करने की क्षमताenic हाइड्रा लाइनों केवल यौन प्रजनन द्वारा प्रचारित किया जा सकता है जो पशु मॉडल का बहुमत है, पर एक फायदा है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के कारण पशु की पारदर्शिता और अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन 8 के अभाव को आसानी से विवो में लगाया जा सकता है.
पहली ट्रांसजेनिक हाइड्रा लाइनों के सात साल बाद ऐसी लाइनों आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया गया है, 1 किए गए थे. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति यह संभव, सेल आंदोलन को ट्रैक सेल आकार में परिवर्तन निरीक्षण, और जंगली प्रकार की परिस्थितियों में और रासायनिक गड़बड़ी 1,5,9-12 के बाद दोनों सेल भाग्य को ट्रैक करने के लिए बनाया गया है. इसके अलावा, विभिन्न प्रजातियों में अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति विशेष सेल आबादी के FACS अलगाव के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक को स्टेम सेल विशिष्ट mRNAs और वंश विशेष छोटे RNAs 13,14 के अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रमोटर की जबकिदो हाइड्रा actin जीन की एक सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है कुछ सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों की पहचान की और ट्रांसजेनिक हाइड्रा 9,11,15,16 में GFP की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. भविष्य में, सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों कोई विशेष सेल प्रकार के अवलोकन और संग्रह के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, एक ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण सफलतापूर्वक Wnt3 प्रमोटर 17 की सीआईएस से अभिनय नियामक तत्वों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
हाइड्रा में ट्रांसजेनिक विधियों के विकास अस्थानिक अभिव्यक्ति, overexpression, और पछाड़ना द्वारा जीन के समारोह के परीक्षण के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है. ट्रांसजेनिक जानवर समारोह और सेलुलर स्थानीयकरण 18-20 दोनों की जांच के क्रम में fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त कि किए गए हैं. इसके अलावा, एक GFP transgene की 3'UTR में शाही सेना hairpins की अभिव्यक्ति लक्ष्य जीन 21,22 के पछाड़ना की ओर जाता है. इन तरीकों में GFP की पहचान करने के लिए आवश्यक हैऔर ट्रांसजेनिक लाइन के निर्माण के दौरान ट्रांसजेनिक ऊतक को ट्रैक. हालांकि, यह कुछ मामलों में GFP अणु टैग प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप करेगा कि संभावना है. एक ताजा अध्ययन में हाइड्रा जीन एक operon विन्यास में व्यवस्थित किया जा सकता है कि यह दर्शाता है, यानी, polycistronic देखिए तो पार spliced नेता इसके द्वारा अलग और अलग से 23 अनुवाद कर रहे हैं, जो बना रहे हैं. एक प्रोटीन या एक operon और नीचे की ओर स्थिति में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के अपस्ट्रीम स्थिति में एक शाही सेना बाल के लिये कांटा एन्कोडिंग एक जीन रखकर, एक प्रोटीन या शाही सेना बाल के लिये कांटा एन्कोडिंग जीन टैग करने के लिए बिना ट्रांसजेनिक ऊतक ट्रैक कर सकते हैं. इस विधि जीन 14 पछाड़ना प्राप्त करने के क्रम में DsRed2 साथ एक operon विन्यास में एक शाही सेना बाल के लिये कांटा व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
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Protocol
प्लास्मिड डीएनए, सुई, और इंजेक्शन व्यंजन की 1. तैयारी
- एक उच्च गति मैक्सी या मिडी किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए तैयार है और मिलीलीटर इथेनॉल तेज़ी का उपयोग / 2.5 मिलीग्राम डीएनए ध्यान केंद्रित. डीएनए गोली Nuclease मुक्त विआयनीकृत पानी में भंग कर दिया जाना चाहिए. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 μl aliquots में डीएनए स्टोर. (उपलब्ध वैक्टर की एक सूची के लिए अनुपूरक 1 टेबल देखें)
- एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण के आयोजन के लिए एक गर्त का निर्माण करने के लिए agarose का उपयोग कर एक इंजेक्शन पकवान बनाने.
- एक कोण पर एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में एक 75 x 50 गिलास खुर्दबीन स्लाइड रखें. Agarose पेट्री डिश में हाइड्रा मध्यम 24 में पिघल 2% के लगभग 50 मिलीलीटर डालो. वैकल्पिक रूप से, पहले डिश में agarose डाल और शीर्ष पर एक "Microinjection मछली मोल्ड" फ्लोट.
- Agarose जम जाने के बाद, गिलास स्लाइड या मोल्ड को हटा दें. एक गिलास स्लाइड इस्तेमाल किया गया था, तो एक उस्तरा bla के साथ अतिरिक्त agarose दूर कटौतीसम्मान में एक दीवार के रूप में. डिश में हाइड्रा मध्यम डालो और तुरंत इसका इस्तेमाल या जरूरत तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान. नोट: उपयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगर इंजेक्शन व्यंजन पुन: उपयोग किया जा सकता है.
- , 75 पुल, 525 गर्मी वेग 100, समय वे कर रहे हैं कि इस तरह के एक पेट्री डिश में मिट्टी की एक संकरी पट्टी में उन्हें दबाने से 50 स्टोर सुइयों: निम्न शर्तों का उपयोग micropipette खींचने पर एक रेशा साथ borosilicate ग्लास केशिकाओं से सुइयों खींचो पकवान के नीचे करने के लिए आयोजित समानांतर.
- , इंजेक्शन समाधान तैयार 10% फिनोल लाल के 2 μl के साथ 2.5 मिलीग्राम / एमएल प्लाज्मिड डीएनए समाधान के 3 μl गठबंधन है. भंवर समाधान संक्षिप्त और फिर सुई रोकना हो सकता है कि किसी भी कणों को दूर करने के लिए एक microcentrifuge में अधिकतम गति से 10 मिनट के लिए स्पिन.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक छोटे से खोलने बनाने के लिए संदंश के साथ सुई टिप से कुछ मिलीमीटर क्लिप. नोट: ओपन के उचित आकार में कुछ लचीलापन हैदबाव इस बदलाव को समायोजित करने के लिए कदम 3.3 में समायोजित किया जा सकता क्योंकि आईएनजी.
- यह टिप नीचे के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में सुई पकड़ रहा है कि इतनी पेट्री डिश रखें. सुई के पीछे के अंत में तरल pipetting द्वारा इंजेक्शन समाधान के लगभग 0.5 μl के साथ सुई लोड. केशिका क्रिया सुई की नोक में हल खींचने के लिए अनुमति दें.
इंजेक्शन के लिए भ्रूण की 2. तैयारी
- एक दैनिक आधार पर अंडे के उत्पादन जंतु के लिए हाइड्रा AEP तनाव संस्कृति स्कैन. इन जंतु लीजिए और एक अलग संस्कृति डिश में उन्हें रद्द करना. अंडे के गठन की प्रगति की निगरानी करने के लिए दिन के दौरान इन जंतु हर कुछ घंटों का निरीक्षण करें. अंडे बाहरी झिल्ली के माध्यम से तोड़ने के लिए और मुकर बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं की एक अंगूठी पर बैठने जब वे इंजेक्शन 25 के लिए तैयार हैं. निषेचन के लिए अनुमति देने के लिए इंजेक्शन से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए वृषण है कि कई हाइड्रा के साथ एक थाली में इन जंतु रखें. हाइड्रा </ उन्हें> पुरुषों किसी विशेष हेरफेर बिना शुक्राणु जारी करेंगे.
- महिलाओं के लगभग 400 माइक्रोन व्यास 25 में, या 1 से 8 सेल चरण भ्रूण को कर रहे हैं जो पूरी तरह से गठन अंडे, साथ AEP कॉलोनी में पाए जाते हैं, तो भी इंजेक्शन के लिए इन इकट्ठा. तुरंत cleaving शुरू कर दिया है कि भ्रूण इंजेक्षन. नोट: यह पूरी तरह से गठन अंडे और एक कोशिकीय युग्मनजों के बीच अंतर बताने के लिए संभव नहीं है, इसलिये ये इंजेक्शन से पहले पुरुषों के साथ incubated किया जाना चाहिए.
- इंजेक्शन से पहले, एक # 15 ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग भ्रूण के ऊपर और नीचे पैतृक ऊतक के सबसे हटा दें. संलग्न शरीर स्तंभ का एक छोटा सा टुकड़ा है, साथ ही भ्रूण छोड़ दो यदि आवश्यक संदंश के साथ भ्रूण हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. नोट: पुनर्जन्म होगा दूर भ्रूण से विच्छेदित है और महिलाओं हाइड्रा कॉलोनी में रहने को सुनिश्चित करने के लिए बचाया जाना चाहिए कि ऊतक.
- एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, उनमें से दीवार के समानांतर व्यवस्था, इंजेक्शन डिश भ्रूण स्थानांतरितagarose गर्त.
प्लास्मिड डीएनए के 3 Microinjection
- एक लोहे की प्लेट पर बैठता है कि एक चुंबकीय स्टैंड पर microinjector माउंट. जॉयस्टिक micromanipulator पर, सुई रखती है कि microinjector का हिस्सा है जो इंजेक्शन धारक, माउंट. एक चुंबकीय स्टैंड के साथ, लोहे की प्लेट के लिए जॉयस्टिक जोड़तोड़ माउंट. एक विदारक माइक्रोस्कोप के दाईं ओर इस पूरे सेट अप प्लेस और यह अवलोकन क्षेत्र में दिख रहा है तो इंजेक्शन धारक की स्थिति.
- Agarose गर्त की खड़ी दीवार छोड़ दिया है कि इस तरह के उन्मुख विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण के साथ इंजेक्शन पकवान, रखें. इंजेक्शन धारक में सुई डालें और डिश में हाइड्रा माध्यम में सुई की नोक कम है.
- खनिज तेल सुई और इंजेक्शन समाधान की एक सतत स्ट्रीम के शीर्ष भरता है जब तक धीरे धीरे Hydr में सुई बाहर निकलने मनाया जाता है घड़ी की दिशा में सिरिंज की घुंडी बारीएक मध्यम. धारा भी मजबूत है, वामावर्त घुंडी बदल कर दबाव कम है. नियमित (सुई कदम 1.5 में काटा गया था कैसे यानी,) सुई खोलने के आकार पर निर्भर करता है जो एक उपयुक्त दबाव, प्राप्त करने के लिए इस कदम का अभ्यास करें. नोट: धारा भी मजबूत है, तो भ्रूण इंजेक्शन नहीं बच जाएगा.
- विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते समय पहले भ्रूण क्षेत्र के केंद्र में है, इसलिए है कि इंजेक्शन पकवान चाल है. यह है कि भ्रूण को छू रहा है कि ताकि सुई ले जाएँ. सुई के साथ भ्रूण पियर्स micromanipulator का प्रयोग करें. नोट: agarose गर्त की खड़ी दीवार सुई द्वारा तरफ धकेला जा रहा से भ्रूण रखेंगे.
- इंजेक्शन समाधान भ्रूण 1 या 2 सेकंड में प्रवाह और फिर जल्दी से सुई निकालने के लिए अनुमति दें. भ्रूण एक से अधिक सेल है, तो व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक कोशिका इंजेक्षन. सुई की नोक के साथ अगले सेल के लिए पंक्ति में भ्रूण को नई दिशा संदंश का प्रयोग करें.
- पहले Embry के बादओ अगले भ्रूण इंजेक्शन स्थिति में है कि इतने पकवान ले जाने और प्रक्रिया को दोहराने, इंजेक्शन है; सभी भ्रूण इंजेक्शन दिया गया है जब तक जारी है.
4 संवर्धन और भ्रूण के अंडे सेने
- वृषण है कि कुछ हाइड्रा के साथ एक डिश में इंजेक्शन भ्रूण के सभी कदम (यह सभी भ्रूण निषेचित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए है). वे embryogenesis जारी एक 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण सेते हैं.
- छल्ली चरण में पहुंच जाने के बाद, हाइड्रा मध्यम से भरा एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक व्यक्ति को अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक इंजेक्शन भ्रूण चाल है.
- 18 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 2 सप्ताह के लिए इंजेक्शन भ्रूण सेते हैं.
- 2 सप्ताह ऊष्मायन अवधि के बाद, विदारक माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक इंजेक्शन भ्रूण की जांच. छल्ली चरण भ्रूण पैतृक ऊतक के छोटे टुकड़े से अलग किया गया है और माता पिता के ऊतक पुनर्जीवित किया है, जिसमें किसी भी मामले पर ध्यान दें. यह मील नहीं है कि तो तुरंत इस पुनर्जीवित नाकड़ा निकालेंएक नए hatchling के लिए staken.
- आरटी पर एक मछलीघर प्रकाश के तहत इंजेक्शन भ्रूण के पकवान ले जाएँ. प्रत्येक दिन प्लेटों की जाँच करें और hatchlings इकट्ठा. हाइड्रा जंतु के विशिष्ट गुलाबी रंग वे खाने Artemia से आता है क्योंकि नई hatchlings सफेद हो जाएगा.
- Transgene अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे hatchlings निरीक्षण.
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Representative Results
ट्रांसजेनिक हाइड्रा लाइनों की स्थापना
Artemia nauplii साथ हर 2-3 दिनों ट्रांसजेनिक hatchlings फ़ीड. Hatchlings कभी कभी अंडे सेने के बाद एक या दो दिन के लिए खाना नहीं है. कुछ नया hatchlings नहीं बच जाएगा इस प्रकार खाते हैं, और कभी नहीं होगा. Hatchling बहिर्जनस्तरीय (चित्रा 1 ए) या तो में ट्रांसजेनिक या endodermal उपकला ऊतक है, जानवरों की कली और सबसे ट्रांसजेनिक ऊतक (चित्रा 1 बी, सी) है कि कलियों को इकट्ठा करने के लिए अनुमति देते हैं. एक ट्रांसजेनिक लाइन बहिर्जनस्तरीय (चित्रा -1) या endodermal उपकला वंश या तो में transgene की वर्दी अभिव्यक्ति के साथ स्थापित किया गया है, जब तक नई कलियों के साथ ऐसा करना जारी रखें. इसके साथ ही, एक दूसरी पंक्ति transgene होते हैं लेकिन अन्यथा आनुवंशिक रूप से (चित्रा 1 बी) के समान है यह नहीं है कि स्थापित किया जा सकता है. इस लाइन भविष्य प्रयोगों के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. ट्रांसजेनिक ऊतक मैं कदम नहीं करता हैएक कली Nto, यह जानवर में कटौती और यह ट्रांसजेनिक ऊतक नए उभरते क्षेत्र में होगा कि इस तरह के पुनर्जीवित करने के लिए अनुमति देने के लिए कभी कभी संभव है. हालांकि, ट्रांसजेनिक ऊतक यह जानवर के सामान्य विकास के दौरान विस्थापित है के रूप में यह संभावना खो जाएगा extremities को भी बंद है. अक्सर इस मामले में क्या किया जा सकता है कि वहाँ कुछ भी नहीं है. Transgene तटस्थ है अगर हमारे हाथ में है, हम हाइड्रा का लगभग 30% से एक समान उपकला लाइन स्थापित करने में सक्षम हैं (यानी, जैविक समारोह पर कोई प्रभाव पड़ता है) कि उपकला ट्रांसजेनिक ऊतक के साथ पक्षियों के बच्चे. शेष 70% मरने या ट्रांसजेनिक ऊतक खो दिया है. एक endodermal लाइन लगभग एक बहिर्जनस्तरीय लाइन के रूप में 2-3 बार आम है. एक transgene जैविक समारोह बाधित कि इस्तेमाल किया जा रहा है, तो यह एक वर्दी लाइन की स्थापना की व्यवहार्यता पर असर पड़ सकता है. ऐसे मामलों में, inducible प्रमोटरों टूलकिट के लिए आवश्यक परिवर्धन किया जाएगा.
Hatchling ट्रांसजेनिक हैबीचवाला वंश में, पशु कली और बीचवाला वंश में ट्रांसजेनिक कोशिकाओं की संख्या बढ़ साथ hatchlings इकट्ठा करने के लिए अनुमति देते हैं. यह एक उपकला वंश में ट्रांसजेनिक भी है, खासकर अगर कभी कभी यह एक जानवर बीचवाला वंश में ट्रांसजेनिक है कि तुरंत स्पष्ट नहीं है कि अवगत हो. यह मध्य वंश में पूरी तरह से ट्रांसजेनिक एक लाइन नवोदित द्वारा बस की स्थापना की जाएगी कि लगभग नामुमकिन है. यह मध्य वंश पूरी तरह ट्रांसजेनिक हो कि आवश्यकता है, इस पूरे वंश एक भी ट्रांसजेनिक स्टेम सेल 7 से स्थापित है कि इस तरह के मध्य स्टेम सेल समाप्त जानवरों से समुच्चय में क्लोनिंग के द्वारा पूरा किया जा सकता है.
एक ऊतक या सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है जहां मामलों में, ट्रांसजेनिक जानवरों शुरू में स्पष्ट नहीं हो सकता है. केवल जाल में सक्रिय है कि एक प्रमोटर प्रयोग किया जाता है, तो उदाहरण और ट्रांसजेनिक की प्रारंभिक पैच के लिएऊतक शरीर स्तंभ में, कोई फ्लोरोसेंट कोशिकाओं hatchling में देखा जाएगा है. इतना सब hatchlings ट्रांसजेनिक ऊतक जाल में विस्थापित करने की अनुमति है और स्पष्ट बनने के लिए प्रचारित करने की आवश्यकता है.
DsRed2 की वर्दी बहिर्जनस्तरीय उपकला अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन की स्थापना के चित्र 1. (ए) बहिर्जनस्तरीय उपकला कोशिकाओं का एक पैच में एक actin के प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन एक DsRed2 transgene की काइमेरिक अभिव्यक्ति के साथ एक hatchling. (ख) अब दो नई कलियों का उत्पादन होता है पैनल में hatchling से एक पहली पीढ़ी बड. एक तारांकित साथ लेबल कली कोई ट्रांसजेनिक ऊतक है और transgene की उपस्थिति के अलावा, ट्रांसजेनिक लाइन के लिए आनुवंशिक रूप से समान है कि एक नियंत्रण रेखा के संस्थापक जानवर के रूप में इस्तेमाल किया गया था. (ग) एक दूसरी पीढ़ी कलीपैनल बी में हाइड्रा (डी) बाहरी झिल्ली भर DsRed2 अभिव्यक्ति के साथ स्थापित किया गया था कि ट्रांसजेनिक लाइन से एक नाकड़ा का एक उदाहरण से उत्पादन किया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
हाइड्रा नियमित अलैंगिक प्रजनन, लेकिन उत्पादन युग्मक शुरू करने के लिए पर्यावरण उत्तेजनाओं की आवश्यकता है. इन उत्तेजनाओं सबसे हाइड्रा प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं और तनाव के तनाव से भिन्न हो सकती है. यह यौन बनने के लिए हाइड्रा प्रेरित करने के लिए एक प्रयोगशाला स्थापित करने में मुश्किल हो सकती है क्योंकि ट्रांसजेनिक हाइड्रा के उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा एक नियमित आधार पर भ्रूण प्राप्त है. AEP तनाव 25, तथापि, प्रयोगशाला में आसानी से युग्मक पैदा करता है और यह अब तक ट्रांसजेनिक लाइनों बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि केवल तनाव है. युग्मक उत्पादन उत्प्रेरण के लिए सबसे आम तरीका आहार में गड़बड़ी कर रहा है. पहले से वर्णित है, जानवरों 5 दिनों के लिए भूखे, तीन सप्ताह के लिए दैनिक खिलाया जाना चाहिए, और फिर समय युग्मक 1 का उत्पादन किया जाएगा, जिसके दौरान दो बार एक सप्ताह खिलाया. यह भी शायद एक mor अनुकरण, एक मछलीघर 26 में खड़ी प्लेटों पर AEP हाइड्रा संवर्धन कि हमारे अनुभव रहा हैई प्राकृतिक पर्यावरण, जानवरों नियमित अंतराल पर खिलाया जाता है, तब भी जब अंडा उत्पादन होता है. इसके अलावा, AEP आत्म पार से प्राप्त लाइनें कभी कभी माता पिता के तनाव से अधिक नियमित रूप से युग्मक का उत्पादन. इस प्रकार AEP के एक F1 लाइन की स्थापना के भ्रूण का एक और अधिक विश्वसनीय स्रोत प्राप्त करने के लिए एक और संभव तरीका है.
छल्ली चरण के लिए इंजेक्शन जीवित और विकसित है कि भ्रूण का प्रतिशत भ्रूण के स्वास्थ्य पर निर्भर करता है, समाधान की राशि इंजेक्शन, और इंजेक्शन से हुए नुकसान की राशि. इस प्रोटोकॉल में वर्णित निरंतर प्रवाह इंजेक्शन सेट अप के साथ, यह भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है कि समाधान की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. यहाँ सफलतापूर्वक पूरा embryogenesis वर्णित और एक छल्ली फार्म के रूप में हमारे हाथ में, भ्रूण का लगभग आधा इंजेक्शन. इनमें से 50-75% हैच और उन है कि पक्षियों के बच्चे का लगभग 50% कम से कम कुछ ट्रांसजेनिक ऊतक होगा. इसलिए, शुरू में इंजेक्शन भ्रूण के 10-20% उपजट्रांसजेनिक ऊतक के साथ एक F1 हाइड्रा. इंजेक्शन समाधान की राशि ठीक ऐसे आईएम-300 microinjector के रूप में अधिक महंगे उपकरण के साथ नियंत्रित किया जा सकता है. मूल ट्रांसजेनिक लाइनों से छेड़छाड़ और भ्रूण इंजेक्शन लगाने में परिशुद्धता का एक बड़ा सौदा की अनुमति देता है जो Eppendorf, से उपकरण के साथ किए गए थे. सटीकता के इस स्तर इंजेक्शन भ्रूण के एक उच्च जीवित रहने की दर दे सकता है, इस खर्च ट्रांसजेनिक लाइनों की नियमित स्थापना के लिए आवश्यक नहीं है.
transgene के एकीकरण यादृच्छिक है और संभावित जीनोम में या एक ही स्थान में एक मिलकर सरणी में कई स्थानों में हो सकता है. दक्षिणी धब्बा विश्लेषण के आधार पर, एकीकरण की संख्या पहले से 1 बनाया एक उपकला ट्रांसजेनिक लाइन में पांच पर अनुमान लगाया गया था. Transgene germline संचरण आए जिसमें एक बीचवाला वंश ट्रांसजेनिक लाइन में, यह केवल transgene की एक एक प्रति पूर्णांक था कि जीनोम अनुक्रमण द्वारा प्रदर्शन किया गया हैegrated (सीई दाना और आरई स्टील, अप्रकाशित अवलोकन). हालांकि, एक तरफ इन दो उदाहरणों से, कोई जानकारी उपलब्ध संबंध transgene एकीकरण साइटों और संख्या की नकल नहीं है. यह एक transgene insertional mutagenesis के द्वारा जीन समारोह में व्यवधान डाला सकता है कि संभव है के बाद से, उदाहरण के लिए, आरएनएआई या overexpression निर्माणों से phenotypes का विश्लेषण करते हैं, एक से अधिक ट्रांसजेनिक लाइन किया जाना चाहिए. यह इस प्रकार अनिवार्यता से बनाए रखा नहीं किया जाएगा जताने पर गंभीर या घातक phenotypes के लिए नेतृत्व कि transgenes अधिक इस्तेमाल actin जीन प्रमोटर द्वारा संचालित जब कि transgene अभिव्यक्ति विधान है नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण है, और. भविष्य के लिए, यह इस समस्या को नाकाम करने के लिए transgene अभिव्यक्ति की एक inducible प्रणाली विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा.
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Acknowledgments
इस काम RESCEJ को एच एल के लिए एक जी हेरोल्ड और लीला वाई Mathers पुरस्कार और एक एनआईएच अनुदान (R24 GM080527) द्वारा एक एनआरएसए postdoctoral साथी (एनआईएच F32GM9037222) था समर्थित किया गया था और वर्तमान में राष्ट्रीय से एक Mentored अनुसंधान वैज्ञानिक विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित है उम्र बढ़ने पर संस्थान (K01AG04435). हम सहायक टिप्पणियों के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
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