Introduction
Hydra был использован для изучения регенерации, образование паттерна, и стволовые клетки в течение примерно 250 лет 2 Hydra имеет простой план тела, состоящий из трех линиях клеток:. Эктодермального эпителиальные, эндодермального эпителиальных и интерстициальных. Трубчатый корпус образован эктодермального и энтодермальных эпителиальных линий, каждая из которых представляет собой один слой клеток. Все эпителиальных клеток в колонке тела являются митотический. Когда эпителиальные клетки смещаются в конечностях 3, глава (рот и щупальца) в полости рта конца или ноги (базальной) диска на спинной конце концов, они задержать в G2-фазе клеточного цикла и изменить судьбу клетки 4. Клетки линии интерстициального находятся в промежутках между эпителиальными клетками. Эта линия поддерживается мультипотентных стволовых клеток, которые расположены в эктодермальном эпителиального пласта колонны тела 5. Промежуточные стволовые клетки дают начало трем соматической сотовыхтипы л (нервы, железы клетки и nematocytes) и половые клетки 6,7.
Как член филюма Cnidaria, сестра группа для всех bilaterians, Гидра может пролить свет на фундаментальные биологические процессы разделены среди многоклеточных животных. До недавнего времени эти усилия не были препятствует отсутствие надежных методов возмущения функции гена. Тем не менее, с развитием трансгенных методологии 1, мы теперь в состоянии в полной мере воспользоваться Hydra, чтобы получить лучшее понимание основных механизмов, общих для многоклеточных животных, таких как функции стволовых клеток, регенерации, и кучность стрельбы. Трансгенные линии Hydra установлены путем инъекции плазмидной ДНК в эмбрионы, что приводит к случайной интеграции и экспрессии химерного в значительной частотой птенцов. Линии с равномерным экспрессии в конкретной линии может быть установлен бесполым распространения. Возможность клонально распространяться transgЕНИК Hydra линии является преимуществом по сравнению с большинством моделей животных, которые могут быть распространены только полового размножения. Кроме того, трансгенные клетки могут быть легко отслеживаются в естественных вследствие прозрачности животного и отсутствие эндогенного флуоресцирующих белков 8.
За семь лет с момента первых трансгенных линий Hydra были сделаны 1, такие линии были использованы для различных применений. Выражение флуоресцентных белков в различных типах клеток позволило отслеживать движение клетки, наблюдать за изменениями в форме клеток, а также отслеживать клеточные судьбы как в диких условиях типа и после химической возмущения 1,5,9-12. Кроме того, выражение различных флуоресцентных белков в различных линий позволяет FACS изоляции конкретных клеточных популяций. Эта техника была использована для секвенирования специфических мРНК стволовых клеток и клон-специфических малых РНК 13,14. В то время как промоутеродин из двух генов актина Hydra была наиболее широко используемым, а некоторые промоторы клеток типа были идентифицированы и использованы для управления экспрессией GFP в трансгенных Hydra 9,11,15,16. В будущем, промоторы клеток типа позволит для наблюдения и сбора любого конкретного типа клеток. Кроме того, трансгенные подход был успешно использован для определения цис-действующие регуляторные элементы промотора Wnt3 17.
Развитие трансгенных методов в Hydra обеспечивает надежную подход для проверки функции генов с помощью эктопической экспрессии, избыточная экспрессия и нокдаун. Трансгенные животные были сделаны, что выразить флуоресцентно-меченных белков с целью изучения как функцию и клеточную локализацию 18-20. Кроме того, выражение РНК шпильки в 3'-UTR о GFP трансгена приводит к нокдауна генов-мишеней 21,22. В этих подходов GFP, требуется, чтобы идентифицироватьи отслеживать трансгенной ткани при создании трансгенной линии. Тем не менее, вполне вероятно, что в некоторых случаях молекулы GFP будет мешать функции меченого белка. Недавнее исследование показывает, что Hydra гены могут быть расположены в конфигурации оперона, т.е. полицистронного транскрипты сделаны, которые затем разделяются транс-сплайсинга лидера того и переведены в отдельности 23. Размещая ген, кодирующий белок или РНК шпильку в верхнем положении оперона, и ген флуоресцентного белка в нижнем положении, то можно отслеживать трансгенной ткани без того, чтобы пометить гена, кодирующего белок или РНК шпильку. Этот метод был использован, чтобы выразить РНК шпильку в конфигурации оперона с DsRed2 для достижения ген нокдаун 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Получение ДНК плазмиды, иглы и инъекции Блюда
- Подготовьте плазмидной ДНК с использованием набора High Speed Maxi или Midi и концентрируют ДНК до 2,5 мг / мл с помощью осаждением этанолом. Осадок ДНК должны быть растворены в нуклеазы без деионизированной воды. Хранить ДНК в 10-20 мкл аликвотах при -20 ° C. (Смотрите дополнительную таблицу 1 для списка доступных векторов)
- Согласовать впрыска блюдо с использованием агарозы построить желоб для проведения эмбрионов в 100 х 15 мм чашки Петри.
- Поместите 75 х 50 стеклышко в 100 х 15 мм чашки Петри под углом. Налейте примерно 50 мл 2% агарозном расплавленные в Hydra среды 24 в чашке Петри. Кроме того, залить агарозы в сосуде первый и плавать "Микроинъекция Fish Mold" на вершине.
- После агарозном укрепил, снимите стеклянную слайд или плесень. Если был использован предметное стекло, срезать лишний агарозы с бритвой бладе чтобы сформировать стенку. Налейте Hydra среды в блюдо и сразу же использовать его или хранить его при температуре 4 ° С до использования. Примечание: Инъекции блюда могут быть повторно использованы, если хранится при температуре 4 ° С между использованием.
- Потяните иглы из боросиликатного стекла капилляров с нити на пипетки съемник, используя следующие условия: тепло 525, тянуть 75, скорости 100, время 50.-магазин иглы, нажав их в узкой полосе глины в чашке Петри, такие, что они параллельная нижней части блюда.
- Для приготовления раствора для инъекций, объединить 3 мкл 2,5 мг / мл раствора плазмидной ДНК с 2 мкл 10% фенолового красного. Вихревой раствор кратко, а затем вращать ее в течение 10 мин при максимальной скорости в микроцентрифуге, чтобы удалить любые частицы, которые могут засорить иглу.
- Под микроскопом рассекает, клип иглу на несколько миллиметров от кончика щипцами, чтобы создать небольшое отверстие. Примечание: Существует некоторая гибкость в соответствующем размере открытчисле, потому что давление может быть отрегулировано на шаге 3.3, чтобы приспособить этот вариант.
- Поместите чашку Петри таким образом, чтобы он удерживает иглу в вертикальном положении с наконечником вниз. Загрузить иглу приблизительно 0,5 мкл инъекционного раствора с помощью пипетки жидкость в задней части иглы. Разрешить капиллярного действия, чтобы вытащить раствора в кончике иглы.
2 Получение эмбрионов для инъекций
- На ежедневной основе сканирования штамм культуры Hydra AEP для полипов, производящих яйца. Соберите эти полипы и отложите их в отдельном блюдо культуры. Соблюдайте эти полипы каждые несколько часов в течение дня, чтобы следить за ходом формирования яйца. Когда яйца прорвать эктодермы и сидеть на ринге отведенным эктодермальных клеток они готовы для инъекций 25. Поместите эти полипы в блюдо с несколькими Hydra, которые имеют яички, по крайней мере 1 час до инъекции, чтобы позволить для оплодотворения. Hydra </ EM> мужчины выпустит сперму без специальной манипуляции.
- Если самки находятся в колонии AEP с полностью сформированных яиц, которые примерно 400 мкм в диаметре 25, или от 1 до эмбрионов 8-клеточных стадии, также собирают их для инъекций. Сразу вводить эмбрионы, которые начали раскалывания. Примечание: Это не возможно отличить полностью сформированных яиц и одноклеточных зиготы, таким образом, они должны быть выведены с мужчинами перед инъекцией.
- Перед инъекцией, удаляя большую часть родителей ткани выше и ниже эмбриона с помощью скальпеля с # 15 лезвия. Оставьте только эмбрион с небольшим куском колонке байонета, чтобы быть использованы для манипулирования эмбрион щипцами при необходимости. Примечание: ткань, которая отсечен от эмбриона будет восстанавливаться и должен быть сохранен для того, чтобы женщины остаются в колонии Hydra.
- С помощью пипетки Пастера, двигаться эмбрионов впрыска блюдо, устраивая их параллельно стенеагарозном корыта.
3 Микроинъекции ДНК плазмиды
- Установите microinjector на магнитной подставке, который сидит на железной плите. Установите держатель инъекция, которая является частью microinjector который держит иглу, на джойстик микроманипулятором. Установите джойстик манипулятора к железной пластине, с магнитной подставке. Разместите эту всю настройку на правой стороне вскрытии микроскопом и расположите держатель впрыска так, чтобы видно в области наблюдения.
- Поместите впрыска блюдо с эмбрионами под микроскопом рассекает, ориентированы таким образом, что вертикальная стенка желоба агарозном находится слева. Вставьте иглу в держатель впрыска и опустите кончик иглы в среду Hydra в блюдо.
- Медленно поверните ручку шприца по часовой стрелке, пока минеральное масло не заполняет верхнюю часть иглы и устойчивый поток раствора для инъекций наблюдается выход иглу в Гидравлсреда. Если поток слишком силен, понизить давление, повернув против часовой стрелки. Практика этот шаг, чтобы регулярно получать необходимого давления, которое зависит от размера отверстия иглы (т.е., как игла был взят на стадии 1.5). Примечание: Если поток слишком силен, эмбрион не выживет инъекции.
- При просмотре через вскрытии микроскопом, переместить впрыска блюдо так, чтобы первый эмбрион находится в центре поля. Перемещение иглы так, чтобы она касалась, что эмбрион. Используйте микроманипулятор проколоть эмбриона с иглы. Примечание: Вертикальная стенка желоба агарозном будет держать эмбрион от быть отодвинуты от иглы.
- Разрешить решение впрыска течь в эмбриона 1 или 2 сек, а затем снимите иглу быстро. Если эмбрион имеет более одной ячейки, вводят каждую ячейку отдельно. С помощью пинцета, чтобы переориентировать эмбриона, чтобы выровнять следующую ячейку с кончиком иглы.
- После первого Эмбрио впрыскивается, перемещать антенну так, чтобы на следующий эмбрион находится в положении впрыска и повторите процедуру; продолжаться, пока все эмбрионы не были введены.
4 Культивирование и вылупления эмбрионов
- Переместить все инжектированных эмбрионов в блюдо с несколькими Hydra, которые имеют яички (это для того, чтобы все эмбрионы оплодотворяются). Выдержите эмбрионов в 18 ° С инкубатор в то время как они продолжают эмбриогенеза.
- После того, как этап кутикулы достигается, переместить каждый эмбрион вводят в индивидуальной лунку 24-луночного планшета, заполненной Hydra среды.
- Выдержите инжектированные эмбрионов в течение 2 недель в темноте при 18 ° С.
- После 2-недельного периода инкубации, проверять каждый введенный эмбриона под микроскопом рассекает. Обратите внимание на любые случаи, в которых кутикула стадии эмбрион отделен от небольшой кусок родителей ткани и родительская ткань регенерировать. Удалить эту регенерированного полип сразу так, что это не милиstaken для нового детеныша.
- Переместите тарелку вводимых эмбрионов под аквариуме света при комнатной температуре. Проверьте пластины каждый день, и собрать птенцов. Новые птенцов будет белым, потому что типичный розовый цвет Hydra полипов происходит от артемии они едят.
- Соблюдайте птенцов под флуоресцентным микроскопом, чтобы обнаружить экспрессию трансгена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание трансгенных линий Hydra
Поток трансгенных птенцов каждые 2-3 дня с артемии науплии. Детеныши иногда не едят в течение дня или два после вылупления. Некоторые новые птенцы никогда не буду есть, и, таким образом, не выживет. Если птенец является трансгенным в любом эктодермального (рисунок 1А) или энтодермальная эпителиальной ткани, позволяют животному бутон и собирать почки, которые оказывают наиболее трансгенной ткани (Рисунок 1B, C). Продолжайте делать это с новыми бутонами, пока трансгенные линии не установлено с равномерным экспрессии трансгена либо в эктодермального (Рисунок 1D) или эндодермального эпителиального происхождения. Одновременно вторая линия может быть установлено, что не содержит трансген, но в остальном генетически идентичны (Фигура 1В). Эта линия служит в качестве отрицательного контроля для будущих экспериментов. Если трансгенный ткань не двигается, яас в зародыше, иногда можно сократить животное и дать ему возможность восстановить таким образом, что трансгенная ткани будет в новом бутонизации зоне. Однако, если трансгенной ткани находится слишком близко к конечностей, что, вероятно, будет потеряны, как она смещается во время нормального роста животного. Часто нет ничего, что может быть сделано в данном случае. В наших руках, если трансген нейтрален (т.е., не имеет никакого влияния на биологическую функцию) мы можем установить единый эпителиальных линию от примерно 30% от Hydra, что люк с эпителиальной трансгенной ткани. Остальные 70% либо умирает, либо трансгенных тканей теряется. Энтодермальная линия примерно 2-3 раза так часто, как в эктодермального линии. Если трансген используется, что нарушает биологические функции, это может оказать влияние на возможности создания единой линии. В таких случаях, индуцируемые промоторы будет эфирные дополнения в инструментария.
Если птенец является трансгеннымв интерстициальной линии, позволяют животному бутон и собирать птенцов с увеличением числа трансгенных клеток в интерстициальной линии. Знайте, что иногда это не сразу понятно, что животное является трансгенным в интерстициальной линии, особенно, если это также трансгенные в эпителиального происхождения. Очень маловероятно, что линия полностью трансгенного в интерстициальной линии будут созданы просто почкованием. Если требуется, чтобы линия интерстициальный быть полностью трансгенное, это может быть достигнуто путем клонирования в агрегатах из клеток животных, обедненного интерстициальный стволовых таким образом, что вся линия устанавливается с одной стволовой клетки трансгенного 7.
В случаях, когда ткане или типа клеток промотор используется для управления экспрессией флуоресцентного белка, трансгенные животные могут быть не очевидны изначально. Например, если промотор, который активен только в щупальцах используется и начального патча трансгенныхткани не в столбце тела, не флуоресцентные клетки будет видно в детеныша. Таким образом, все птенцы должны быть распространены, чтобы трансгенных тканей смещаться в щупальцах и стало очевидным.
Рис.1 Создание трансгенной линии с равномерным эктодермального эпителиальной экспрессией DsRed2. () Детеныш с химерного выражения трансгенов DsRed2 под контролем промотор актина в патче эктодермальных эпителиальных клеток. (B) первого поколения бутон от детеныша в панели А теперь возникают два новых бутонов. Почка помечены звездочкой не имеет трансгенной ткани и был использован в качестве основополагающего животного для линии управления, который генетически идентичны трансгенной линии, на присутствие трансгена, кроме. (С) второго поколения почкидобываемого на Hydra в панели B. (D) пример полипа из трансгенной линии, которая была создана с DsRed2 выражения всей эктодермы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гидра постоянно воспроизводит бесполым, но требует внешних стимулов, чтобы начать производить гаметы. Эти стимулы не хорошо определены для большинства видов Hydra и могут отличаться от штамма к штамму. Существенным препятствием к производству трансгенных Hydra является получение эмбрионов на регулярной основе, потому что это может быть трудно в лабораторных условиях, чтобы вызвать Hydra стать сексуальной. AEP штамм 25, однако, производит гаметы легко в лаборатории, и это является единственным штаммом, который был использован до сих пор для получения трансгенных линий. Наиболее распространенный метод для индукции продуцирования гамет является диеты манипуляции. Как описано выше, животные должны получать в день в течение трех недель, голодали в течение 5 дней, а затем подается в два раза в неделю, в течение которых гаметы будет произведено 1. Он также был наш опыт, что культивирование AEP Hydra на вертикальных пластин в аквариуме 26, возможно, имитируя морэ природной среды, приводит к яйценоскости, даже когда животных кормят через регулярные промежутки времени. Кроме того, линии, полученные от AEP самостоятельной крестов иногда производят гаметы более регулярно, чем родительский штамм. Таким образом, создание F1 линию АЭП еще один возможный способ для получения более надежный источник эмбрионов.
Процент эмбрионов, которые выживают инъекции и развитию в стадии кутикулы зависит от состояния здоровья эмбрионов, количество раствора вводили, а количество повреждений сделано путем инъекции. С постоянным потоком впрыска настройке, описанной в данном протоколе, трудно контролировать количество раствора, который вводится в эмбрионе. В наших руках, примерно половина эмбрионов вводили, как описано здесь успешно полную эмбриогенеза и образуют кутикулу. Из них 50-75% люк и из тех, что люк, примерно 50% будет иметь по крайней мере некоторые трансгенной ткани. Таким образом, 10-20% от первоначально введенных эмбрионов выходF1 Hydra с трансгенной ткани. Количество раствора вводили можно точно контролировать с более дорогого оборудования, таких как IM-300 microinjector. Исходные трансгенные линии были сделаны с оборудованием Эппендорф, что позволяет большую точность в манипулировании и введение эмбриона. В то время как этот уровень точности может дать более высокий коэффициент выживаемости, инъецированных эмбрионов, этот расход не является необходимым для рутинного создании трансгенных линий.
Интеграции трансгена является случайным, и потенциально могут возникнуть в нескольких местах в геноме или в массиве тандем в одном месте. На основании Саузерн-блот-анализа, число интеграции была оценена в пять в одном эпителиальной трансгенной линии, созданной ранее 1. В интерстициальный клонов трансгенной линии, в которых трансген подвергается передачу зародышевой линии, это была продемонстрирована секвенирования генома, что только одна копия трансгена был Integrated (CE Дана и RE Стил, неопубликованное наблюдение). Тем не менее, в стороне от этих двух примерах, нет информации относительно трансгенные интеграции сайтов и число копий. Так как это возможно, что трансген может прервать функции гена путем инсерционного мутагенеза, более одного трансгенного линия должна быть при анализе фенотипов от, например, РНК-интерференции или избыточной экспрессии конструкций. Кроме того, важно отметить, что выражение трансгена является конститутивной, когда приводится в действие, обычно используемого гена промотор актина, и, таким образом, трансгены, которые приводят к серьезным или летальных фенотипов при экспрессии конститутивно не будет сохранена. В будущем, это будет важно развивать индуцибельную систему экспрессии трансгена обойти эту проблему.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Г. Гарольд & Leila Y. Mathers премии к HL и гранта NIH (R24 GM080527) к RESCEJ был АЯРБ постдокторант (NIH F32GM9037222) и в настоящее время поддерживается наставником исследовательского премии Ученый развития из Национального институт по проблемам старения (K01AG04435). Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за полезные замечания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
