Introduction
Hydra har använts för att studera regeneration, mönsterbildning, och stamceller i cirka 250 år 2 Hydra har en enkel kropp plan består av tre cellinjer:. Ektodermal epitel, endodermalt epiteliala och interstitiell. Den rörformiga kroppen är bildad genom den ektodermala och endodermala epiteliala härstamningar, vilka vardera är en enkelcellskikt. Alla av epitelceller i kroppen kolumn är mitotiska. När epitelceller är förskjutna i extremiteterna 3, huvudet (mun och tentakler) vid den muntliga änden eller foten (basal skiva) vid aboral slutet, de arresterar i G2-fasen av cellcykeln och ändra cell ödet 4. Cellerna i den interstitiella härstamning uppe inom mellanrummen mellan epitelceller. Denna härstamning stöds av multipotenta stamceller som finns i det ektodermala epitelskikt av kroppen kolumn 5. De interstitiella stamceller ger upphov till tre somatiska cell typer (nerver, körtelceller och nematocytes) och könscellerna 6,7.
Som en medlem av stammen Cnidaria, systergrupp till alla bilaterians kan Hydra belysa grundläggande biologiska processer delas av flercelliga djur. Tills nyligen var dessa insatser hindras av bristen på tillförlitliga metoder för störning av geners funktion. Men med utvecklingen av transgena metodik 1, kan vi nu att dra full nytta av Hydra för att få en bättre förståelse av de grundläggande mekanismer som är gemensamma för flercelliga djur, som till exempel stamcellsfunktion, regeneration, och mönstring. Transgen Hydra linjer etableras genom injektion av plasmid-DNA i embryon, som resulterar i slumpmässig integration och chimär expression i en betydande frekvens av ungarna. En linje med enhetligt uttryck i en viss härstamning kan fastställas genom asexuell förökning. Förmågan att klonalt fortplanta transgENIC Hydra linjer är en fördel över de flesta djurmodeller, som kan förökas endast genom sexuell reproduktion. Dessutom kan transgena celler spåras lätt in vivo på grund av öppenheten i djuret och avsaknaden av endogena fluorescerande proteiner 8.
Under de sju år som gått sedan de första transgena Hydra linjer gjordes 1, sådana linjer har använts för en mängd olika tillämpningar. Uttryck av fluorescerande proteiner i olika celltyper har gjort det möjligt att spåra cellrörelse, observera förändringar i cellform, och spåra cell öden både vildtyp villkor och efter kemisk störning 1,5,9-12. Dessutom uttryck av olika fluorescerande proteiner i de olika utvecklingslinjer möjliggör FACS isolering av specifika cellpopulationer. Denna teknik har använts för sekvensering av stamcells specifika mRNA och linjespecifika små RNA 13,14. Medan promotorn fören av de två Hydra aktin gener har mest använda, några celltypsspecifik promotorer har identifierats och används för att driva uttryck av GFP i transgena Hydra 9,11,15,16. I framtiden kommer celltypsspecifik promotorer möjliggöra observation och insamling av specifika celltyp. Dessutom gjordes en transgen tillvägagångssätt framgångsrikt använts för att definiera de cis-verkande regulatoriska elementen i Wnt3 promotorn 17.
Utvecklingen av transgena metoder i Hydra ger en robust metod för att testa funktionen hos gener som ektopisk uttryck, överuttryck och knockdown. Transgena djur har gjorts att uttrycka fluorescerande-märkta proteiner för att undersöka både funktion och cellulär lokalisering 18-20. Dessutom expressionen av RNA hårnålar i 3'UTR av en GFP-transgen leder till knockdown av målgener 21,22. I dessa metoder krävs GFP att identifieraoch spåra transgena vävnaden under skapandet av den transgena linjen. Det är emellertid troligt att GFP-molekyl i en del fall skulle störa funktionen av det märkta proteinet. En nyligen genomförd studie visar att Hydra gener kan arrangeras i ett operon konfiguration, dvs är polycistrona transkript, vilka därefter separeras genom trans splitsad ledare tillsats och translateras separat 23. Genom att placera en gen som kodar för ett protein eller en RNA-hårnål i positionen uppströms av ett operon och ett fluorescerande proteingenen i nedströms läge kan en spåra transgen vävnad utan att behöva märka den gen som kodar för proteinet eller RNA-hårnål. Denna metod har använts för att uttrycka en RNA hårnål i en konfiguration operon med DsRed2 för att uppnå gen knockdown 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av plasmid-DNA, nålar, och Injection svDishes
- Förbered plasmid-DNA med användning av en höghastighets Maxi eller Midi-kit och koncentrera DNA till 2,5 mg / ml med användning av etanol-utfällning. DNA-pelleten löses upp i nukleasfritt avjoniserat vatten. Förvara DNA i 10 till 20 | il alikvoter vid -20 ° C. (Se Kompletterande tabell 1 för en lista över tillgängliga vektorer)
- Gör en injektion maträtt med hjälp av agaros att bygga ett tråg för att hålla embryon i en 100 x 15 mm petriskål.
- Placera en 75 x 50 objektglas i en 100 x 15 mm petriskål i vinkel. Häll ca 50 ml av 2% agaros smält i Hydra-medium 24 i petriskål. Alternativt, häll agarosen i skålen först och flyta en "mikroinjektion fisk Mold" på toppen.
- När agarosen stelnat, ta bort glasskiva eller formen. Om en glasskiva användes, skär bort överflödigt agaros med en rakkniv blade för att bilda en vägg. Häll Hydra-medium i skålen och använda den omedelbart eller förvaras vid 4 ° C tills det behövs. Obs: Injektions rätter kan återanvändas om den förvaras vid 4 ° C mellan användningarna.
- Dra nålar från borosilikatglas kapillärer med en glödtråd på mikropipett avdragare med hjälp av följande villkor: värma 525, drar 75, hastighet 100, tiden 50. Lagra nålarna genom att trycka in dem i en smal remsa av lera i en petriskål så att de är som hålls parallellt med botten av skålen.
- För att bereda injektionslösningen, kombinera 3 pl av 2,5 mg / ml plasmid-DNA-lösning med 2 ^ il av 10% fenolrött. Vortex lösningen en kort stund och sedan snurra den i 10 minuter vid maximal hastighet i en mikro att ta bort eventuella partiklar som kan sätta igen nålen.
- Under ett dissektionsmikroskop, clip nålen några millimeter från spetsen med pincett för att skapa en liten öppning. OBS: Det finns en viss flexibilitet i lämplig storlek av den öppnaing eftersom trycket kan justeras i steg 3.3 för att tillgodose denna variation.
- Placera petriskålen så att den håller nålen i ett vertikalt läge med spetsen nedåt. Fyll på nålen med cirka 0,5 | il injektionslösning genom att pipettera upp vätskan i den bakre änden av nålen. Låt kapillärkraften för att dra in lösningen i spetsen på nålen.
2 Beredning av embryon för injektion
- Dagligen skanna Hydra AEP stam kultur för polyper som producerar ägg. Samla dessa polyper och ställ dem åt sidan i en separat odlingsskål. Följ dessa polyper varje några timmar under dagen för att övervaka utvecklingen av ägget bildning. När äggen bryta igenom ektoderm och sitta på en ring av indragna ektodermala celler de är redo för injektion 25. Placera dessa polyper i ett fat med flera Hydra som har testiklarna i minst 1 timme före injektion för att möjliggöra befruktning. Hydra </ Em> hanar släpper sperma utan någon speciell hantering.
- Om honorna finns i AEP kolonin med fullt formade ägg, som är cirka 400 mikrometer i diameter 25, eller 1 till 8-cellstadiet embryon, även samla in dessa för injektion. Omedelbart injicera embryon som har startat klyvning. Obs: Det är inte möjligt att skilja mellan fullt formade ägg och encelliga zygoter, alltså dessa bör inkuberas med hanar före injektion.
- Före injektion, ta bort det mesta av föräldra vävnad ovanför och under embryo med hjälp av en skalpell med en # 15 blad. Lämna endast embryot med en liten bit av kroppen kolonn fäst, som skall användas för att manipulera embryot med pincett om nödvändigt. Obs: vävnad som dissekeras bort från embryot kommer regenerera och bör sparas för att säkerställa att honor kvar i Hydra koloni.
- Med hjälp av en pasteurpipett, flytta embryon till insprutningsskål, ordna dem parallella med väggen iagaros tråg.
3. Mikroinjektion av plasmid-DNA
- Montera microinjector på en magnetisk stativ som sitter på en järnplatta. Montera insprutningshållaren, som är den del av microinjector som håller nålen på en joystick mikromanipulator. Montera joystick manipulator till järnplåt, med en magnetisk monter. Placera denna hela set-up på den högra sidan av ett dissektionsmikroskop och placera injektions hållaren så att det är synligt i observationsfältet.
- Placera injektions skålen med embryon under dissekera mikroskop, orienterad så att den vertikala väggen i agarosen tråget är till vänster. Stick in nålen i injektionshållaren och sänk spetsen på nålen i Hydra mediet i skålen.
- Långsamt vrida ratten av sprutan medurs tills mineralolja fyller upp på nålen och en stadig ström av injektionslösning observeras lämnar nålen i Hydrett medium. Om strömmen är för stark, sänka trycket genom att vrida ratten moturs. Praktiken detta steg för att rutinmässigt erhålla ett lämpligt tryck, som beror på storleken av nålen öppningen (dvs hur nålen klipptes i steg 1,5). OBS: Om strömmen är för stark, kommer embryot inte överleva injektionen.
- Medan du tittar igenom dissekera mikroskop, flytta injektions skålen så att den första embryot är i mitten av fältet. Flytta nålen så att den är i kontakt att embryot. Använd mikromanipulator att genomborra embryot med nålen. Obs: Den vertikala väggen i agarosen tråget kommer att hålla embryot från att tryckas åt sidan av nålen.
- Låt injektionslösningen att strömma in embryot 1 eller 2 sek och ta sedan bort nålen snabbt. Om embryot har mer än en cell, injicera varje cell individuellt. Använd pincett för att omorientera embryot att anpassa nästa cell med spetsen på nålen.
- Efter den första embryo injiceras, flytta skålen så att nästa embryot är i injektionsposition och upprepa proceduren; fortsätta tills alla embryon har injicerats.
4 Odling och Hatching av embryon
- Flytta alla de injicerade embryona i en skål med några Hydra som har testiklar (detta är att säkerställa att alla embryon är befruktade). Inkubera embryona i en 18 ° C inkubator medan de fortsätter embryogenes.
- När nagelbanden stadium har nåtts, flytta varje injicerat embryo till en individuell brunn i en 24-brunnars platta fylld med Hydra-medium.
- Inkubera injicerade embryon för 2 veckor i mörker vid 18 ° C.
- Efter 2 veckors inkubationstid, kontrollera varje injicerade embryo under dissekera mikroskop. Obs något fall där nagelbanden steg embryo har lossnat från den lilla bit av föräldra vävnad och föräldra vävnad har regenere. Ta bort denna regenere polyp omgående så att det inte är milStaken för en ny hatchling.
- Flytta skålen av injicerade embryon i ett akvarium ljus vid RT. Kontrollera plattorna varje dag och samla ungarna. Nya ungar blir vitt, eftersom den typiska rosa färgen på Hydra polyper kommer från Artemia de äter.
- Observera ungarna under ett fluorescensmikroskop för att upptäcka transgenexpression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering transgena Hydra linjer
Feed transgena ungar var 2-3 dagar med Artemia nauplii. Hatchlings ibland inte äter för en dag eller två efter kläckning. Några nya ungar kommer aldrig att äta, och därför kommer inte att överleva. Om hatchling är transgena i antingen ektodermala (Figur 1A) eller endodermalt epitelvävnad, att djuret knoppas och samla knopparna som har den mest transgena vävnaden (Figur 1B, C). Fortsätt att göra detta med de nya knopparna tills en transgen linje etableras med enhetligt uttryck av transgenen i antingen ektodermala (figur 1D) eller endodermalt epitelial härstamning. Samtidigt kan fastställas en andra linje som inte innehåller transgenen, men i övrigt är genetiskt identiska (Figur 1B). Denna linje tjänar som en negativ kontroll för framtida experiment. Om den transgena vävnaden inte rör sig into en knopp, är det ibland möjligt att skära djuret och låt den att regenerera så att den transgena vävnaden kommer att vara i den nya spirande zonen. Men om den transgena vävnaden är för nära till extremiteterna kommer det sannolikt att förloras eftersom den är förskjuten under den normala tillväxten hos djuret. Ofta finns det ingenting som kan göras i detta fall. I våra händer, om transgenen är neutral (dvs har ingen inverkan på biologisk funktion) har vi möjlighet att skapa en enhetlig epitelial linje från ungefär 30% av Hydra som kläcks med epitelial transgen vävnad. De återstående 70% antingen dör eller den transgena vävnaden förloras. En endodermalt ledning är ungefär 2-3 gånger så vanligt som en ectodermal linje. Om en transgen används som stör biologisk funktion, kan detta ha en inverkan på möjligheten att inrätta en enhetlig linje. I sådana fall kommer inducerbara promotorer är viktiga tillägg till verktygslådan.
Om hatchling är transgeni interstitiell härstamning, att djuret knoppas och samla ungarna med ett ökande antal av transgena celler i interstitiell härstamning. Var medveten om att det ibland inte är direkt uppenbart att ett djur är transgen i interstitiell härstamning, speciellt om det är också transgena i en epitelial härstamning. Det är mycket osannolikt att en rad helt transgen i interstitiell härstamning kommer att fastställas enbart genom knoppning. Om det krävs att den interstitiella härstamning vara helt transgena, kan detta åstadkommas genom kloning i aggregat från interstitiell stamcellsutarmade djur så att hela linjen är etablerad från en enda transgen stamcell 7.
I fall där en vävnads- eller celltyp-specifik promotor som används för att driva uttryck av ett fluorescerande protein, kan transgena djur inte vara uppenbart från början. Om till exempel en promotor som är aktiv endast i tentaklerna används och den initiala lapp av transgenvävnad i kroppen kolumnen inga fluorescerande celler kommer att ses i den hatchling. Så alla ungar måste förökas att tillåta transgena vävnaden som skall förflyttas in tentaklerna och blivit uppenbara.
Figur 1 Upprättande av en transgen linje med enhetlig ectodermal epitelial uttryck för DsRed2. (A) En hatchling med chimär uttryck för en DsRed2 transgen under kontroll av en aktinpromotorn i ett plåster ektodermala epitelceller. (B) En första generationens bud från hatchling i panel A producerar nu två nya knoppar. Den knopp märkt med en asterisk har ingen transgen vävnad och användes som grundar djuret för en styrledning som är genetiskt identiska med den transgena linje, förutom närvaron av transgenen. (C) En andra generationens knoppproduceras av Hydra i panel B. (D) Ett exempel på en polyp från transgen linje som etablerades med DsRed2 uttryck genom hela ektoderm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra återger rutin asexuellt, men kräver miljö stimuli för att börja producera könsceller. Dessa stimuli inte väldefinierad för de flesta Hydra arter och kan variera från stam till stam. En betydande hinder för produktion av transgena Hydra är att få embryon regelbundet eftersom det kan vara svårt att i laboratoriemiljö för att förmå Hydra för att bli sexuellt. Den AEP-stam 25, emellertid, producerar gameter lätt i laboratoriet, och detta är den enda stam som har använts hittills för att göra transgena linjerna. Den vanligaste metoden för att inducera gametproduktion är genom kosten manipulation. Som tidigare beskrivits, bör djuren utfodras dagligen under tre veckor, svalt i 5 dagar, och matas därefter två gånger i veckan, under vilken tid könsceller produceras 1. Det har också varit vår erfarenhet att odla AEP Hydra på vertikala plattor i ett akvarium 26, kanske simulerar en more naturmiljö, leder till äggproduktion även när djuren matas med jämna mellanrum. Dessutom linjer som erhållits från AEP själv kors producerar ibland könsceller mer regelbundet än moderstammen. Därmed upprättande av en F1 linje AEP är en annan möjlig metod för att erhålla en mer tillförlitlig källa av embryon.
Andelen embryon som överlever injektion och utvecklas till nagelbanden skede beror på hälsan hos embryon, mängden av lösningen injiceras, och mängden skador som injektion. Med den konstanta flödesinjektions ställt upp beskrivs i detta protokoll, är det svårt att styra mängden av lösning som skall sprutas in i embryot. I våra händer, ungefär hälften av de embryon injiceras som beskrivs här med framgång komplett embryogenes och bilda ett nagelband. Av dessa 50-75% lucka och av de som kläcks, kommer ca 50% har åtminstone någon transgen vävnad. Därför 10-20% av de ursprungligen injicerade embryon geren F1 Hydra med transgen vävnad. Mängden lösningen injiceras kan kontrolleras exakt med dyrare utrustning såsom IM-300 microinjector. De ursprungliga transgena linjer gjordes med utrustningar Eppendorf, som möjliggör en hög grad av noggrannhet i att manipulera och injicera embryot. Medan denna nivå av noggrannhet kan ge en högre överlevnad av injicerade embryon, är denna kostnad inte är nödvändigt för rutin upprättande av transgena linjer.
Integrationen av transgenen är slumpmässig och skulle kunna förekomma på flera platser i genomet eller i ett tandem array på en enda plats. Baserat på Southern blot-analys var antalet integrationer uppskattas till fem i ett epitelial transgen linje som skapats tidigare 1. I en interstitiell härstamning transgen linje, i vilken transgenen undergår germline transmission, har det visats av genomsekvense att endast en enda kopia av transgenen var integrated (CE Dana och RE Steele, opublicerad observation). Men bortsett från dessa två exempel, det finns ingen information tillgänglig rörande transgena platser integration och antalet exemplar. Eftersom det är möjligt att en transgen kunde avbryta genfunktion av insertionsmutationer, bör fler än en transgen linje göras vid analys av fenotyper från exempelvis RNAi eller överuttryck konstruktioner. Det är också viktigt att notera att transgenexpression är konstitutiv när den drivs av den vanligen använda aktingenen promotor och därmed transgener som leder till allvarliga eller dödliga fenotyper vid uttalad kommer konstitutivt inte bibehållas. För framtiden är det viktigt att utveckla ett inducerbart system för transgenuttryck att kringgå detta problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett G. Harold & Leila Y. Mathers Award till HL och en NIH bidrag (R24 GM080527) till RESCEJ var en NRSA Forskarassistent (NIH F32GM9037222) och är för närvarande stöds av en mentor Forskare Development Award från National Institute on Aging (K01AG04435). Vi vill tacka granskarna för värdefulla kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
