Introduction
Hydra ist verwendet worden, um die Regeneration, Musterbildung zu studieren, und Stammzellen für etwa 250 Jahre 2 Hydra hat eine einfache Körperplan, bestehend aus drei Zelllinien. Ektodermalen Epithelzellen, endodermalen Epithelzellen und interstitiellen. Der rohrförmige Körper wird von der ektodermalen und endodermalen Epithelzellen Abstammungslinien, von denen jede eine einzelne Zellschicht ausgebildet ist. Alle epithelialen Zellen im Körper Spalte mitotischen. Wenn Epithelzellen in den Extremitäten 3 verschoben wird, der Kopf (Mund und Tentakeln) in der mündlichen Ende oder dem Fuß (basal Scheibe) an der aboralen Ende, sie in der G2-Phase des Zellzyklus zu arretieren, und ändern Sie das Schicksal der Zelle 4. Die Zellen der Zwischenlinie liegen in den Zwischenräumen zwischen den Epithelzellen. Diese Linie wird von multipotenten Stammzellen, die in der ektodermalen Epithelschicht des Körpers Spalte 5 angeordnet werden unterstützt. Die interstitielle Stammzellen führen zu drei somatische cell Typen (Nerven, Drüsenzellen, und nematocytes) und die Keimzellen 6,7.
Als Mitglied des Stammes Cnidaria, die Schwestergruppe zu allen Bilateria, Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse unter vielzelligen Tiere geteilt vergießen. Bis vor kurzem waren diese Bemühungen durch das Fehlen zuverlässiger Verfahren zur Störung der Gen-Funktion behindert. Doch mit der Entwicklung transgener Methodik 1, sind wir jetzt in der Lage, alle Vorteile der Hydra zu ergreifen, um ein besseres Verständnis der grundlegenden Mechanismen gemeinsam vielzelligen Tiere, wie der Stammzellfunktion, Regeneration und Strukturierung zu gewinnen. Transgene Hydra Linien werden durch Injektion von Plasmid-DNA in Embryonen, die in zufälliger Integration und chimären Ausdruck in einem wesentlichen Häufigkeit der Jungtiere führt gegründet. Eine Linie mit gleichmäßiger Expression in einem bestimmten Abstammungslinie kann durch asexuelle Vermehrung festgestellt werden. Die Fähigkeit, klonal transg propagierenENIC Hydra Linien ist ein Vorteil gegenüber der Mehrzahl von Tiermodellen, die nur durch sexuelle Reproduktion vermehrt werden können. Darüber hinaus können transgene Zellen in vivo leicht aufgrund der Transparenz des Tieres und der Abwesenheit von endogener Fluoreszenzproteine 8 verfolgt werden.
In den sieben Jahren seit der ersten transgenen Hydra Linien wurden 1 wie Linien für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Expression von fluoreszierenden Proteinen in verschiedenen Zelltypen hat es möglich gemacht, um die Zellbewegung zu verfolgen, Änderungen in der Zellform zu beobachten und zu verfolgen Zellschicksale sowohl in Wildtyp-Bedingungen und nach der chemischen Störung 1,5,9-12. Darüber hinaus ermöglicht die FACS Isolierung von spezifischen Zellpopulationen, die Expression von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen in den verschiedenen Linien. Diese Technik wurde für die Sequenzierung von Stammzell-spezifischen mRNAs und linienspezifische kleinen RNAs 13,14 eingesetzt. Während der Promotoreiner der beiden Hydra Aktin Gene wurde am häufigsten verwendet wird, eine spezifische Promo wenige Zelltyp wurden identifiziert und verwendet, um die Expression von GFP bei transgenen Hydra 9,11,15,16 fahren. In Zukunft werden Zelltyp-spezifische Promotoren für die Beobachtung und Erfassung von spezifischen Zelltyp ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine transgene Ansatz erfolgreich verwendet, um die cis-wirkenden regulatorischen Elemente des Promotors Wnt3 17 definieren.
Die Entwicklung transgener Methoden in Hydra bietet eine robuste Ansatz zum Testen der Funktion von Genen durch ektopische Expression, Überexpression und Knockdown. Transgenen Tieren vorgenommen wurden, die fluoreszenzmarkierte Proteine, um die Funktion und zelluläre Lokalisation 18-20 untersuchen auszudrücken. Zusätzlich wurde die Expression von RNA-Haarnadeln in der 3'UTR des GFP-Transgens führt zu Knockdown von Zielgenen 21,22. In diesen Ansätzen GFP ist erforderlich, um zu ermittelnund verfolgen die transgene Gewebe während der Erstellung der transgenen Linie. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass in einigen Fällen das GFP-Molekül würde mit der Funktion des markierten Proteins stören. Eine neuere Untersuchung zeigt, dass Hydra-Gene in einem Operon-Konfiguration angeordnet, das heißt, polycistronische Transkripte hergestellt, die dann durch Transspleißprodukte Führer zusätzlich getrennt und separat 23 übersetzt werden. Mit der Abgabe eines Gens, das ein Protein oder eine RNA-Haarnadel in die Position stromaufwärts von einem Operon und ein fluoreszierendes Protein-Gen in der stromabwärtigen Position kodiert, kann eine transgene Gewebe, ohne den das Protein-oder RNA-Haarnadel-kodierende Gen Schiene. Diese Methode wurde verwendet, um eine RNA-Haarnadel in einem Operon Konfiguration mit DsRed2 um zu erreichen Gen-Knockdown 14 auszudrücken.
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Protocol
1. Herstellung von Plasmid-DNA, Nadeln und Injektions Geschirr
- Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit einem High-Speed-Maxi oder Midi-Kit und konzentrieren die DNA auf 2,5 mg / ml mit Ethanol-Fällung. Das DNA-Pellet sollte in Nuklease-freiem deionisiertem Wasser gelöst werden. Speichern die DNA in 10-20 ul-Aliquots bei -20 ° C. (Siehe Zusatz Tabelle 1 für eine Liste der verfügbaren Vektoren)
- Machen Sie eine Spritz Gericht unter Verwendung von Agarose, eine Mulde zur Aufnahme Embryonen in einem 100 x 15 mm Petrischale konstruieren.
- Legen Sie ein 75 x 50 Glasobjektträger in einen 100 x 15 mm Petrischale in einem Winkel. Pour ca. 50 ml 2% Agarose in Hydra Medium 24 in die Petrischale aufgeschmolzen. Alternativ gießen Sie die Agarose in die Schüssel erste und Schwimmer eine "Mikroinjektion Fisch Mold" an der Spitze.
- Nach Erstarren der Agarose, entfernen Sie den Glasobjektträger oder der Form. Wenn ein Glasobjektträger verwendet wurde, schneiden Sie das überschüssige Agarose mit einem Rasiermesser blade, um eine Wand zu bilden. Gießen Hydra Medium in die Schüssel und verwenden Sie es sofort oder lagern Sie es bei 4 ° C, bis sie benötigt. Hinweis: Injektions Geschirr kann wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C zwischen den Verwendungen gespeichert.
- Ziehen Nadeln aus Borosilikatglas Kapillaren mit einem Faden auf der Mikropipette Puller mit den folgenden Bedingungen: Hitze 525, ziehen 75, Geschwindigkeit 100, Zeit 50. Speichern Sie die Nadeln durch Drücken sie in einem schmalen Streifen von Ton in einer Petrischale, so dass sie Hand parallel zum Boden der Schale.
- Zur Herstellung der Injektionslösung, kombiniert 3 ul 2,5 mg / ml Plasmid-DNA-Lösung mit 2 ul 10% Phenolrot. Vortex die Lösung kurz und dann drehen Sie es für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikro um alle Partikel, die die Nadel verstopfen könnten, zu entfernen.
- Unter einem Binokular, Clip der Nadel ein paar Millimeter von der Spitze mit einer Pinzette, eine kleine Öffnung zu schaffen. Anmerkung: Es ist eine gewisse Flexibilität in der geeigneten Größe der offenening, weil der Druck in Schritt 3.3 eingestellt, um diese Variation zu berücksichtigen.
- Legen Sie die Petrischale, so dass es hält die Nadel in einer vertikalen Position mit der Spitze nach unten. Laden der Nadel mit etwa 0,5 ul Injektionslösung durch Pipettieren der Flüssigkeit in das hintere Ende der Nadel. Ermöglichen Kapillarwirkung, um die Lösung in die Spitze der Nadel zu ziehen.
2. Herstellung von Embryonen zur Injektion
- Täglich scannen die Hydra AEP Stammkultur für Polypen, deren Eier. Sammeln Sie diese Polypen und legen Sie sie beiseite in einem separaten Kulturschale. Alle paar Stunden zu beobachten diese Polypen im Laufe des Tages, um den Fortschritt des Eierbildung zu überwachen. Wenn Eier durchbrechen die Ektoderm und sitzen auf einem Ring aus eingefahrenen ektodermalen Zellen sind sie bereit für die Injektion 25. Legen Sie diese Polypen in einer Schale mit mehreren Hydra, die Hoden für mindestens 1 Stunde vor der Injektion, um die Befruchtung zu ermöglichen. Hydra </ Em> Männchen Spermien ohne besondere Manipulation freizugeben.
- Wenn Frauen sind in der AEP-Kolonie mit voll gebildet Eier, die etwa 400 um im Durchmesser 25, oder 1 bis 8-Zell-Stadium Embryonen gefunden werden, sammeln diese auch zur Injektion. Sofort injizieren Embryonen, die Spaltung begonnen haben. Anmerkung: Es ist nicht möglich, die Differenz zwischen den vollständig geformten Eiern und Zygoten Einzeller sagen, so sollten diese bei Männern vor der Injektion inkubiert.
- Vor der Injektion verringert sich die Eltern Gewebe oberhalb und unterhalb des Embryos unter Verwendung eines Skalpells mit einer # 15 Klinge. Lassen Sie nur den Embryo mit einem kleinen Stück von Körpersäule befestigt ist, zu verwenden, um den Embryo mit einer Pinzette ggf. zu manipulieren. Hinweis: Das Gewebe, aus dem Embryo zerlegt wird regeneriert und sollte gespeichert, um sicherzustellen, dass Frauen in der Hydra-Kolonie verbleiben.
- Mit einer Pasteurpipette, bewegen Embryonen zur Einspritz Gericht, ordnet sie parallel zur Wand desAgarose Trog.
3. Mikroinjektion von Plasmid-DNA
- Montieren Sie die Mikroinjektor auf einem Magnetständer, die auf einer Eisenplatte sitzt. Montieren der Einspritzhalterung, die den Teil der Mikroinjektor, dass die Nadel hält, an einer Joystick-Mikromanipulator ist. Montieren Sie den Joystick Manipulator an der Eisenplatte, mit einem Magnetständer. Dieses gesamte Set-up auf der rechten Seite von einem Binokular und Positionierung des Injektionshalters, so dass er im Beobachtungsfeld sichtbar ist.
- Platzieren des Einspritzform mit Embryonen unter dem Präpariermikroskop ausgerichtet, daß die vertikale Wand der Agarose Trog nach links. Legen Sie die Nadel in die Injektionshalter und senken Sie die Spitze der Nadel in die Hydra Medium in der Schale.
- Drehen Sie den Knopf der Spritze im Uhrzeigersinn, bis Mineralöl die Spitze der Nadel und einem stetigen Strom von Injektionslösung füllt beobachtet Verlassen der Nadel in die Hydrein Medium. Wenn der Strom zu stark ist, senken Sie den Druck durch Drehen des Knopfes gegen den Uhrzeigersinn. Praxis dieser Schritt auf einen geeigneten Druck, der auf die Größe der Nadelöffnung (dh wie die Nadel in Schritt 1.5 abgeschnitten) hängt routinemßig erhalten. Hinweis: Wenn der Strom zu stark ist, wird der Embryo die Injektion nicht überleben.
- Schauen Sie durch den Binokular, bewegen Sie den Einspritzschale, so dass der erste Embryo ist in der Mitte des Feldes. Bewegen Sie die Nadel, so dass es zu berühren, dass die Embryos. Verwenden Sie den Mikromanipulator, den Embryo mit der Nadel zu durchstechen. Anmerkung: Die senkrechte Wand der Rinne Agarose wird der Embryo ist von der Nadel beiseite gedrückt halten.
- Ermöglichen die Injektionslösung in den Embryo 1 oder 2 s fließen und dann schnell die Nadel entfernen. Wenn der Embryo mehr als eine Zelle, wobei jede Zelle individuell zu injizieren. Zange verwenden, um den Embryo neu auszurichten, um die nächste Zelle mit der Spitze der Nadel auszurichten.
- Nach dem ersten embryo eingespritzt wird, bewegen Sie den Spiegel so, dass die nächste Embryo ist in der Einspritzposition und wiederholen Sie den Vorgang; fortgesetzt, bis alle Embryonen injiziert wurden.
4. Die Züchtung von Embryonen und Brut
- Bewegen aller injizierten Embryonen in eine Schale mit einigen Hydra, die Hoden haben (dies ist zu gewährleisten, dass alle Embryonen befruchtet). Die Embryonen inkubieren in einer 18 ° C-Inkubator der Embryogenese, während sie weiter.
- Sobald die Nagelhaut Stadium erreicht ist, bewegen jeden Embryo injiziert, um eine individuelle Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hydra Medium gefüllt ist.
- Die injizierten Embryonen für 2 Wochen im Dunkeln inkubieren bei 18 ° C.
- Nach der 2 Wochen Inkubationszeit, überprüfen Sie jeden Embryo injiziert unter dem Binokular. Beachten Sie alle Fälle, in denen die Nagelhaut-Stufen-Embryo aus dem kleinen Stück der elterlichen Gewebe abgelöst und das Eltern Gewebe regeneriert hat. Entfernen Sie diese regeneriert Polypen sofort, so dass es nicht miStaken für ein neues Jungtier.
- Bewegen Sie den Teller des injizierten Embryonen unter einem Aquarium Licht bei RT. Überprüfen Sie die Platten jeden Tag und sammeln Jungtiere. Neue Jungtiere werden weiß, weil die typische rosa Farbe der Hydra-Polypen kommt von der Artemia sie essen.
- Beachten Sie die Jungtiere unter einem Fluoreszenzmikroskop zu Transgen-Expression zu erkennen.
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Representative Results
Gründung transgenen Linien Hydra
Jungtiere ernähren transgenen alle 2-3 Tage mit Artemia-Nauplien. Jungtiere manchmal nicht für ein oder zwei Tage zu essen nach dem Schlüpfen. Einige neue Jungtiere nie zu essen, und damit wird nicht überleben. Wenn das Jungtier ist entweder in der transgenen ektodermalen (Abbildung 1A) oder endodermalen Epithel, damit das Tier zu knospen und sammeln die Knospen, die den meisten transgenen Gewebe (Abbildung 1B, C). Dies auch weiterhin mit den neuen Knospen zu tun, bis eine transgene Linie mit einheitlicher Expression des Transgens in entweder der ektodermalen (1D) oder endodermalen Epithelzellen Linie etabliert. Gleichzeitig kann eine zweite Linie etabliert, die das Transgen nicht enthält, aber sonst genetisch identischen (1B) ist. Diese Linie dient als Negativkontrolle für zukünftige Experimente. Wenn die transgene Gewebe i nicht bewegennto einer Knospe, ist es manchmal möglich, das Tier zu schneiden und lassen Sie es sich zu regenerieren, so dass die transgene Gewebe wird in der neuen angehenden Zone. Wenn jedoch das transgene Gewebe zu nahe an den Enden wird es wahrscheinlich verloren, wie es während des normalen Wachstums des Tieres verdrängte werden. Oft gibt es nichts, was in diesem Fall durchgeführt werden kann. In unseren Händen, wenn das Transgen neutral (dh hat keine Auswirkungen auf die biologische Funktion) sind wir in der Lage, eine einheitliche Linie von epithelialen etwa 30% der Hydra fest, dass Luke mit epithelialen transgene Gewebe. Die restlichen 70% sterben oder das transgene Gewebe verloren geht. Ein endodermalen Linie ist ungefähr 2-3 mal so häufig wie eine ektodermale Linie. Wenn ein Transgen verwendet wird, die biologische Funktion stört, kann dies einen Einfluss auf die Möglichkeit der Einrichtung einer einheitlichen Linie. In solchen Fällen werden Promotoren wesentliche Ergänzungen des Toolkits.
Wenn das Jungtier ist transgenenim interstitiellen Linie, damit das Tier zu knospen und sammeln die Jungtiere mit einer wachsenden Zahl von transgenen Zellen im interstitiellen Linie. Seien Sie sich bewusst, dass es manchmal nicht sofort klar ist, dass ein Tier transgen im interstitiellen Linie, vor allem, wenn es auch in transgenen einem epithelialen Linie. Es ist höchst unwahrscheinlich, dass eine Linie in der interstitiellen Linie vollständig transgenen wird einfach durch Knospung festgelegt werden. Wenn es erforderlich ist, dass die Zwischenlinie vollständig transgen sein, kann dies durch Klonierung in Aggregaten von interstitiellen Stammzellen verarmten Tieren, so dass die gesamte Linie aus einer einzigen transgenen Stammzelle 7 fest erfolgen.
In Fällen, in denen ein Gewebe-oder Zelltyp-spezifischen Promotor wird zur Expression eines fluoreszierenden Proteins zu fahren, transgene Tiere können nicht offensichtlich zunächst sein. Wenn zum Beispiel ein Promotor, der nur in den Tentakeln aktiv verwendet wird und der Anfangsstreifen von transgenenGewebe im Körper Spalte keine fluoreszierenden Zellen in dem Jungtier zu sehen. So dass alle Jungtiere müssen weitergegeben werden, damit transgene Gewebe in den Tentakeln verschoben und deutlich.
Abbildung 1. Aufbau einer transgenen Linie mit einheitlichen ektodermalen Epithelzellen Ausdruck DsRed2. (A) Ein Jungtier mit chimären Ausdruck einer DsRed2 Transgen unter der Kontrolle eines Aktin-Promotor in einem Patch von ektodermalen Epithelzellen. (B) eine der ersten Generation aus der Knospe Jungtier in A produziert nun zwei neue Knospen. Die Knospe mit einem Stern markierten keine transgenen Gewebe und wurde als Gründungs Tier für eine Steuerleitung, die genetisch identisch zu dem transgenen Linie ist, mit Ausnahme der Anwesenheit des Transgens verwendet. (C) eine zweite Generation budvon der Hydra in Feld B (D) ein Beispiel für ein Polyp aus der transgenen Linie, die mit DsRed2 Ausdruck in der gesamten Ektoderm gegründet wurde produziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hydra routinemäßig reproduziert ungeschlechtlich, erfordert aber Umweltreize zu produzieren Gameten zu beginnen. Diese Stimuli werden für die meisten Arten Hydra gut definiert und kann von Stamm zu Stamm unterscheiden. Ein wesentliches Hindernis für die Herstellung von transgenen Hydra Erhalten Embryonen regelmäßig, weil es schwierig im Labor zu induzieren Hydra sexuelle geworden sein kann. Der AEP-Stamm 25 erzeugt jedoch Gameten leicht im Labor und dies ist der einzige Stamm, der bisher für die Herstellung von transgenen Linien verwendet wurde. Das häufigste Verfahren zur Induktion der Produktion von Gameten durch Diät Manipulation. Wie zuvor beschrieben, werden die Tiere täglich für drei Wochen gefüttert werden für 5 Tage hungern und dann zweimal pro Woche zugeführt, wobei während dieser Zeit wird Gameten 1 hergestellt werden. Es war auch unsere Erfahrung, dass AEP Hydra Kultivierung auf vertikalen Platten in einem Aquarium 26, vielleicht Simulation eines morE natürlichen Umwelt, führt zu Eierproduktion, auch wenn die Tiere in regelmäßigen Abständen zugeführt. Zusätzlich Leitungen von AEP Selbst Kreuzungen erhalten erzeugen manchmal Gameten regelmäßiger als der Elternstamm. Damit wird ein F1 Linie der AEP ist eine weitere mögliche Verfahren zur Gewinnung einer mehr zuverlässige Quelle von Embryonen.
Der Prozentsatz an Embryos, die Injektion zu überleben und zu entwickeln, um die Kutikula Stufe hängt von der Gesundheit der Embryonen, die Menge der Lösung eingespritzt, und die Menge an Schaden, der durch die Injektion beendet. Mit dem in diesem Protokoll beschriebenen konstanten Fließinjektionsaufbau, ist es schwierig, die Menge der Lösung, die in den Embryo injiziert wird, zu steuern. In unseren Händen, etwa die Hälfte der Embryonen injiziert wie hier erfolgreich abgeschlossen Embryogenese beschrieben und bilden eine Nagelhaut. Von diesen 50-75% Luke und von denen, die Luke, wird etwa 50% mindestens eine transgene Gewebe. Daher 10-20% der ursprünglich injizierten Embryonen ergebenein F1-Hydra mit transgenen Gewebe. Die Menge der injizierten Lösung exakt mit teurer Ausrüstung gesteuert werden wie die IM-300 Mikroinjektor. Die ursprünglichen transgenen Linien wurden mit Geräten von Eppendorf, die ein hohes Maß an Präzision bei der Manipulation und Einspritzen des Embryos ermöglicht hat. Während diese Genauigkeit kann eine höhere Überlebensrate der injizierten Embryonen zu geben, ist dieser Aufwand nicht für die routinemäßige Einrichtung von transgenen Linien notwendig.
Die Integration des Transgens ist willkürlich und könnte an mehreren Stellen in das Genom oder in einer Tandemanordnung in einer einzigen Lage auf. Basierend auf Southern-Blot-Analyse wurde die Anzahl der Integrationen an fünf in einem epithelialen transgene Linie bisher 1 erstellt geschätzt. In einer interstitiellen Linie transgene Linie, in der das Transgen erfährt Keimbahntransmission wurde es von Genom-Sequenzierung, die nur eine einzige Kopie des Transgens war int nachgewiesenegrated (CE Dana und RE Steele, unveröffentlichte Beobachtung). Doch abgesehen von diesen beiden Beispielen gibt es keine Informationen über Transintegrationsstellen und Nummer des Exemplars. Da es möglich ist, dass ein Transgen könnte Genfunktion durch Insertionsmutagenese zu unterbrechen, sollte mehr als eine transgene Linie bei der Analyse von Phänotypen, beispielsweise die RNAi-Konstrukten oder Überexpression erfolgen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Transgen-Expression konstitutiv ist, wenn durch die üblicherweise verwendeten Aktin-Promotor angetrieben, und somit Transgenen, die zu schweren oder letale Phänotypen führen, wenn es exprimiert konstitutiv nicht aufrechterhalten werden. Für die Zukunft wird es wichtig sein, um einen induzierbaren System der Transgen-Expression, um dieses Problem zu umgehen entwickeln.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein G. Harold & Leila Y. Mathers Award an HL und einer NIH (R24 GM080527) zu RESCEJ unterstützt wurde, war ein NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) und wird derzeit von einem Mentored Research Scientist Development Award von der National unterstützt Institute on Aging (K01AG04435). Wir möchten die Gutachter für hilfreiche Kommentare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
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