Protocol
1 Подготовка образцов
- Получение образцов, содержащих люциферазы, экспрессирующих вирус (в данном VSVΔ51-Fluc в качестве примера) для титрования и передачи в 96-луночных планшетах. С другой стороны, выполнение инфекции в 96-луночных планшетах для культуры ткани и использования супернатантов непосредственно.
- Оставьте два столбца необработанные для включения стандартных кривых. Для экспериментов сделано непосредственно на 96-луночных планшетах, титр в конце эксперимента (40 ч после инфицирования) или хранить при температуре -80 ° С и титр на более позднем этапе.
2 Получение разрешительных клеток для титрования вируса
- 24 ч перед титрованием, приготовить суспензию Vero клеток при концентрации 2,5 × 10 5 клеток / мл в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 30 мМ HEPES и 1% пенициллина / стрептомицин. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, этот протокол использует клетки Веро, любой подходящий разрешительный клеточной линией для VSV инфекции могла бе используется.
- Семенной 2,5 × 10 4 клеток (100 мкл) в 96-луночных белого твердого вещества плоскодонных планшетах с использованием микропланшет-дозатор.
- Подготовьте 12 мл клеточной суспензии на чашку плюс 5 мл для грунтования.
- Чистый Диспенсер для микропланшет кассеты с помощью промывки трубки 50 мл стерильной воды.
- Заполните Диспенсер для микропланшет линии с клеточной суспензии и пусть 5 мл клеточной суспензии течь через.
- Выбор программы, которые будут Распределить 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета белого стенками. Разливают, и в случае необходимости повторить для дополнительных пластин. Кроме семян несколько скважин в 96-луночный прозрачной плоской нижней плите, если непрозрачные белые-нижней стенками плиты используются для проверки здоровья клеток и плотности.
- По завершении операции промойте клетки обратно в оригинальной упаковке. Очистить кассету, выполнив 50 мл 70% этанола с последующим добавлением 50 мл теплой стерильной воды через трубопровод.
- Убедитесь кассеты и труб апpropriately чистить между использованием.
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 инкубатора.
3 Получение вирусных калибровочной кривой
- Приготовьте стандартную кривую VSVΔ51-Fluc в бессывороточной DMEM таким образом, что конечная концентрация бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл, после передачи на Vero клетках следующим образом: 10 8 БОЕ / мл, 10 7 PFU / мл, 10 6 БОЕ / мл, 10 5 БОЕ / мл, 10 4 БОЕ / мл, 10 3 БОЕ / мл, 10 2 БОЕ / мл, и 10 1 БОЕ / мл. Подготовка 50 мкл каждой концентрации на тарелку клетках Веро плюс дополнительные 10%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса складе люциферазы нужно будет оцениваться в классическом пути 10 в целях получения стандартной кривой, которая позволит для абсолютного количественного. В противном случае относительное количественное может быть достигнуто без точной информации титра произвольно установки титра вируса на основена стадиях растворения. Например, первый разбавление стандартной кривой может быть установлено равным 10 8 вирусных частей и следующей 1/10 разбавления до 10 7 и так далее. В этом контексте следует выразить значения, сгиба-изменения по сравнению с заранее определенной выборке абсолютного количественного будет не очень точной.
4 Передача образцов супернатантах на разрешительных клеток
- Проверка Vero клетки высевали в четко нижней 96-луночного планшета под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что монослои, по крайней мере, 95% сливной.
- Трансфер 25 мкл образца супернатанта на клетках Веро, посеянных в белых стенками пластин. Не передать супернатантами в 2 колонки, предназначенные для стандартных кривых. Примечание: Это может быть сделано одновременно для всех скважин на одной пластине с помощью обработчика жидкости 96-канала.
- Использование 8 или 12-канального пипеттора многоканальный, добавить 25 мкл из каждого разведения стандартной кривой, полученной на стадии 3 в клетках Vero вв 2 назначенные столбцы.
- Центрифуга пластины в течение 5 мин при 430 х г при комнатной температуре.
- Выдержите в течение 5 часов при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
5 Оценка Жизнеспособность клеток
- Примечание: При запуске из супернатантов, полученных от инфекции экспериментов, проведенных в прозрачных 96-луночных планшетах, жизнеспособность образец может быть оценена до количественной с индикаторным красителем жизнеспособности клеток, таких как резазурин.
- Добавить резазурина в количестве, равном 10% от объема в каждую лунку 96-луночного планшета образцов, содержащих вирус и клетки. Включите клеток только контролирует, а также средств массовой информации только контроля, чтобы определить значения для 100% и 0% жизнеспособность соответственно.
- После 2-4 ч (время инкубации будет варьироваться в зависимости от типа клеток и от концентрации коммерчески доступны, либо восстановленного порошка красителя), считывать и записывать сигнал с использованием флуоресцентного планшет-ридера (530-560 возбуждения, 590) излучения. Viabili Сообщить клетокти для образца по формуле Относительная метаболической активности = ((Опытный образец сигнала - отрицательный контроль сигнала) / (сотовый только сигнал управления - отрицательный сигнал управления)) х 100%
6 Подготовка субстрата люциферин
- За 30 мин до конца 5 ч инкубации подготовить люциферин, чтобы получить раствор 2 мг / мл в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Подготовьте 2,5 мл на чашку плюс дополнительные 2 мл. Защитите решение от света. Примечание: люциферин могут быть также получены ранее в день и хранили при 4 ° С до использования.
7 Чтение Биолюминесценция
- После 5 ч инкубации, добавление 25 мкл люциферин в каждую лунку в клетках Веро белых твердых пластин. Добавить люциферин вручную или с помощью автоматизированной дозатора, встроенного в фотометр. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование инструмента только одной и конечной точки читает может потребовать включения люциферазы совместимый лизиса BUFFER перед добавлением субстрата люциферин, чтобы улучшить консистенцию.
- Читайте тарелки со следующими параметрами:
- Встряхнуть в течение 5 сек.
- Подождите 30 сек.
- Читайте свечение на соответствующем стоимости основных чувствительность / экспозиции. Если опция доступна на инструменте, используйте многоточечный читает (например, 3 х 3 матрицы) для повышения точности.
- Запись и сохранить количественно интенсивности биолюминесценции.
- Если автоматизированная дозатор был использован для добавления люциферина очистить люциферин и залейте линий с теплой стерильной водой.
Анализ 8. данных
- Для получения точных результатов, решить нелинейной регрессии для генерации уравнение Hill от стандартных кривых. Применить это уравнение к оттитрованы образцов для расчета вирусные экспрессионные единицы. Некоторые вирусы или ситуации может привести к стандартной кривой с линейной зависимостью; В этом случае решение для линейного уравнения.
Representative Results
Краткая информация о рабочем процессе, описывающей метод высокой пропускной показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает результаты типичного стандартной кривой ofVSVΔ51-Fluc. Четыре-параметр нелинейный регрессионный анализ генерируется сюжет Hill, из которого неизвестно вход бое (оценка титра вируса) может быть интерполированную. Такие ожидаемые титры называют вирусные экспрессионные единицы (ВЭУ). Фиг.3А показывает VEUs и титры получены путем выполнения стандартного бляшек с одних и тех же образцов 10. Образцы возник из эксперимента, где различные химические вещества, используемого для повышения репликации и распространения VSVΔ51-Fluc в 786-0 клеток. VEUs интерполяцией по калибровочной кривой необходимо умножить на коэффициент, который основан на разведении образца супернатантами передаются на клетках Веро (в данном случае, фактор разбавления 5). Линейная корреляция между титрами и ВЭУ показана на рисунке 3B 2 из 0,8083 и р балле Пирсона 0,899 (р <0,0001). На рисунке 4, типичные данные цитотоксичности клеток, полученных из метаболического теста показан на 786-0 клетках, обработанных химикатами до заражения VSVΔ51-Fluc. Наконец, 5 показаны типичные стандартные кривые, полученные с различных вирусов (простого герпеса (HSV), вирус коровьей оспы, и аденоассоциированные Вирус (AAV), все выражения люциферазы светляков) и описывает время инкубации и циклов замораживания-оттаивания, по мере необходимости.
Рис.1 Технологическая схема высокой пропускной вируса титрованием и цитотоксичности с использованием VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 × 10 4 Vero клеток на лунку (100 мкл) и инкубировали при 37 ° С. (В) 24час спустя передача 25 мкл стандартной кривой на клетках Веро (2 колонки на чашку). (C) Передача 25 мкл образцов для оттитрованы на оставшихся клетках Веро. Центрифуга пластины и инкубировать при температуре 37 ° С. (D) в количестве, равном 10% от объема в скважине, добавить резазурин реагента к пластине, содержащей оригинальные образцы. Планшеты инкубируют при 37 ° С. (E) После 3 ч, чтения и записи флуоресценции и оценки цитотоксичности. (F) После 5 часов, добавляют 25 мкл 2 мг / мл раствора люциферин в каждую лунку клетках Веро. Читайте свечение и рассчитать Вирусные Единицы экспрессии.
Рисунок 2 Ожидаемый стандартную кривую VSV Δ 51-Fluc. Люциферазы выражение было меняasured 5 часов передачу сообщение супернатантную в пяти различных точках в скважине с помощью фотометра и была выражена биолюминесценции в средних относительных световых единиц (RLU). Средний RLU был заговор против известного вход бое / мл решить нелинейной регрессии и генерировать уравнения Хилла. Средняя из двух кривых повторных и стандартных баров ошибках показаны (R 2 = 0,9993).
Рисунок 3 Сравнение стандартных бляшек титров с результатами, полученными методом высокой пропускной способностью. (А) Вирусные титры в БОЕ / мл получен стандартным методом бляшек на клетках Веро сравнивали с рассчитанными вирусных титров (ВЭУ / мл) из одних и тех же образцов титровали с использованием высокой пропускной люциферазы. (B) линейная зависимость между VEU / мл и титр получены через стандартный рЛак для анализа. Линейный кривая регрессии и коэффициент детерминации (R 2) показаны.
Рисунок 4 Пример жизнеспособности. Пример жизнеспособность до передачи супернатант на Vero клетках была определена путем оценки клеточную метаболическую активность с использованием коммерчески доступного резазурин решение. Сырье значения флуоресценции были нормализованы к тому, что из необработанных, неинфицированных скважин.
Рисунок 5 Ожидаемое стандартные кривые с ВПГ, коровью и AAV вирусов. Люциферазы выражение измеряли при пяти различных точках в скважине с помощью фотометра и была выражена биолюминесценции в средних отнотивные световые единицы (RLU). (А) стандартная кривая ВПГ был добавлен на клетках Веро покрытием 24 ч раньше, при плотности 2,5 × 10 4 клеток на лунку (100 мкл) и измерения люциферазы был сделан 17 ч после supernantant передачи (R2 = 0,9489, п = 1). Уравнение Хилла был создан на основе решения нелинейной регрессии. Стандартная кривая (B) Vaccinia был добавлен на клетках Веро покрытием 24 часа раньше плотность 2,5 х 10 4 клеток на лунку (100 мкл) и выдерживают в течение 2,5 ч при 37 ° С, после чего измерения были сделаны люциферазы (R 2 = 0,9892). Линейное уравнение было сгенерировано с помощью решения для линейной регрессии. (С) AAV стандартную кривую был добавлен на клетках карциномы человека легких (A549) покрытием 24 ч раньше, при плотности 2,5 × 10 4 клеток на лунку (100 мкл) и измерения люциферазы было сделано 24 ч после инфицирования. Уравнение Хилла был создан на основе решения нелинейной регрессии. Средняяиз пяти кривые повторных и стандартные планки погрешностей приведены (R 2 = 0,9926).
Discussion
Подход люциферазы основе описано здесь предоставляет ряд преимуществ по сравнению с другими существующими методами в том числе ее простота, быстрота, минимальной потребности оборудования и относительно низкой стоимости. Ключевой вклад в это избегание последовательный стадии разбавления. Тем не менее, последовательные разбавления основе производные этого протокола, безусловно, возможно и недавно были использованы для оценки люциферазы экспрессирующих Эбола титры на экране противовирусной высокой пропускной 11. В то время как по своей природе более трудоемким и более дорогим, такие адаптации может обеспечить более широкий динамический диапазон для количественного определения вирусной когда это необходимо. В дополнение к тому, особенно хорошо подходит для оценки вирусные титры в контексте экранов высокой пропускной, наш один шаг люциферазы на основе вирусной способе количественного генерирует точные оценки инфекционных вирионов в случае репликации вирусов. Кроме того, показания люминесценции наряду с цитотоксичности данных из того же эксперимента дают болееполное представление о влиянии экспериментальных условиях на клетках-мишенях, что особенно полезно в контексте онколитических вирусов и экранов наркотиков.
В приведенном примере проиллюстрировано использует тиражирование негативное РНК вируса одножильному; Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован к ряду репликации и не репликации вирусов с несколькими небольшими изменениями протокола. Это включает в себя ДНК вирусов, таких как Vaccinia, HSV, и AAV (рисунок 5). Образцы инфицированных внутриклеточных вирусов, таких как вирус коровьей оспы, например, требует стадии вирус высвобождением перед количественной (например, по меньшей мере, один замораживания-оттаивания). При применении этого метода с другими вирусами, необходимо, чтобы оптимизировать время инкубации от передачи вирусного лизата или надосадочной жидкости к чтению пластин с помощью фотометра. Этот параметр будет зависеть главным образом от цикла репликации вируса в разрешительной клеточной линии и прочности рromoter вождения люциферазы выражение. Лучше всего это делать с помощью полного стандартную кривую на этапе оптимизации. Чтобы сделать это, нужно заразить соответствующий разрешительный клеточной линии с различными повторах подготовленного стандартной кривой и читать друг повторить в другое время указывает После передачи. В идеале, время инкубации точка выбирается, что приводит к линейной зависимости между LOG (RLU) и LOG (титр), охватывающих ожидаемый диапазон образец титра. Для VSVΔ51-Fluc, это, как правило, от 10 4 БОЕ / мл -10 7 КОЕ / мл в течение 5 ч времени инкубации. Если низкие или более высокие титры, как ожидается, из образцов, можно просто увеличить или уменьшить время инкубации соответственно. С другой стороны, образцы могут быть разбавлены, чтобы находиться в пределах, насколько это сделано, как правило, для ELISA.
Как упоминалось выше, этот способ хорошо подходит для выполнения высокой пропускной экраны наркотиков с использованием библиотеки наркотиков, как большинство шагов может быть автоматизирована. Клетки могут быть покрыты еfficiently использованием автоматического Диспенсер для микропланшет, библиотека препарат может быть добавлена с помощью обработчика жидкости 96-канальный, вирус может быть добавлена с помощью микропланшет дозатор и пластины читать с помощью автоматизированной люминометра. В теории, это также может быть адаптирован к 384-луночный или меньших форматах; Однако, ограничение в этом направлении является количество клеток, которые могут быть покрыты, приведенные меньше клетки приводит к более узком диапазоне в линейности LOG (РОС) в LOG (титр) отношения. Наконец, оценки жизнеспособности клеток с использованием резазурин или другие метаболические красители могут быть легко включены в рабочий процесс, позволяя дискриминации цитотоксических соединений в противовирусных экранов или идентификации соединений, которые приводят к синергетическому убийства в сочетании с вирусами 12. Тем не менее, ограничения этого метода включают требование люциферазы трансген, выражающей вируса, что не всегда возможно, и наличие достаточно разрешительной клеточной линии. Тем не менее, вполне вероятно, можно адаптироватьСпособ для использования с другими репортерных генов (например, GFP), при условии, что метод репортер количественное имеет подходящую линейность и отношение сигнал-шум. В общем, описанный способ с высокой пропускной способностью может быть изменен, чтобы удовлетворить различные вирусы и с учетом разнообразных применений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J.
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
