Protocol
1 Provberedning
- Erhåll prover innehållande luciferas-uttryckande virus (häri VSVΔ51-Fluc som ett exempel) för titrering och överföring till 96-brunnars plattor. Alternativt, utför infektioner i 96-vävnadsodlingsplattor och använda överstående direkt.
- Lämna två kolumner obehandlade för införande av standardkurvor. För experiment gjorda direkt i 96-brunnars plattor, titer vid slutet av experimentet (40 h efter infektion) eller förvara vid -80 ° C och titern vid en senare tidpunkt.
2 Förberedelse av de frivilliga celler för virustitrering
- 24 h före titrering, bereda en suspension av Vero-celler vid en koncentration av 2,5 x 10 5 celler / ml i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 30 mM HEPES och 1% penicillin / streptomycin. OBS: Även om detta protokoll använder Vero-celler, vilket lämpligt tolerant cellinje för VSV-infektion kunde be användas.
- Seed 2,5 x 10 4-celler (100 | il) i 96-brunnars vita fasta flatbottnade plattor med användning av en mikroplatt dispenser.
- Förbered 12 ml cellsuspension per platta plus 5 ml för priming.
- Rengör mikro dispenser kassetten genom att spola slangen med 50 ml sterilt vatten.
- Fyll mikro dispenser linjer med cellsuspension och låt 5 ml cellsuspension flöda igenom.
- Välj ett program som kommer att dispensera 100 ^ il i varje brunn i en vit väggar 96-brunnar. Fördela och upprepa vid behov för extra tallrikar. Också frö några brunnar i en 96-väl klart fast bottenplattan om ogenomskinliga-bottom vita väggar plattor används för kontroll av cellhälsa och densitet.
- När du är klar spola cellerna tillbaka in i originalförpackning. Rengör kassetten genom att köra 50 ml av 70% etanol följt av 50 ml varmt sterilt vatten genom slangen.
- Se till att kassetten och slang är apenligt rengöras mellan användningarna.
- Inkubera cellerna under 24 h vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator.
3 Beredning av Viral standardkurva
- Bered en standardkurva av VSVΔ51-Fluc i serumfritt DMEM så att slutkoncentrationen av plackbildande enheter (pfu) per ml efter överföring på Vero-celler är som följer: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml, och 10 1 pfu / ml. Förbered 50 pl av varje koncentration per platta av Vero-celler plus 10% extra.
OBS: Titer av luciferas virus lager måste bedömas på ett klassiskt sätt 10 för att generera en standardkurva som gör det möjligt för absolut kvantifiering. Annars relativ kvantifiering kan uppnås utan exakta titer information genom att godtyckligt sätta viral titer baseradepå utspädningssteg. Till exempel den första spädningen av standardkurvan kan vara satt till 10 åtta virala enheter och följande 1/10 spädning till 10 7 och så vidare. I detta sammanhang bör man uttrycker värderingar som fold-förändring jämfört med en förutbestämd prov som absolut kvantifiering kommer inte vara korrekt.
4 Överföring av Sample Supernatanter på Tillåt Cells
- Kontrollera Vero-celler pläterade i den klara bottnad 96-brunnsplatta under ett ljusmikroskop för att bekräfta att monoskikt är minst 95% konfluenta.
- Överför 25 ^ provsupernatanten på Vero-celler sådda i vita väggar plattor. Överför inte supernatanter in i 2 kolumner avsedda för standardkurvor. OBS: Detta kan göras samtidigt för alla brunnar på en enda skylt med hjälp av en 96-kanals vätskehanterare.
- Med hjälp av en 8 eller 12 kanaler med flera kanaler pipett, tillsätt 25 l av varje utspädning av standardkurvan framställd i steg 3 till Vero-celler ide två utsedda kolumner.
- Centrifugera plattor för 5 min vid 430 xg vid RT.
- Inkubera under 5 h vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator.
5. Utvärdering av cellviabilitet
- OBS: Vid start från supernatanter erhållna från infektionsförsök gjorda i klara 96-hålsplattor, kan prov livskraft bedömas före kvantifiering med cellviabilitet indikatorfärg som resazurin.
- Lägg resazurin i ett belopp som motsvarar 10% av volymen i varje brunn på 96-brunnar av prover som innehåller virus och celler. Inkludera cell endast kontroller samt media-bara kontroll för att fastställa värden för 100% och 0% viabilitet respektive.
- Efter 2-4 timmar (inkubationstid varierar beroende på celltyp och på koncentrationen av kommersiellt tillgängliga eller rekonstruerad pulver av färgämnet), läsa och spela in den signal med hjälp av en fluorescensplattläsare (530-560 excitation, 590 emission). Rapportera cell viabiliTy för ett prov i enlighet med formeln Relativ Metabolisk aktivitet = ((Test sampelsignal - negativ styrsignal) / (Cell bara kontrollera signal - negativ kontroll-signal)) x 100%
6. Beredning av luciferinsubstrat
- 30 minuter före slutet av 5 timmars inkubering, förbereda luciferin för erhållande av en 2 mg / ml lösning i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förbered 2,5 ml per platta plus en extra 2 ml. Skydda lösningen från ljus. OBS: luciferin kan också framställas tidigare på dagen och lagrades vid 4 ° C fram till användning.
7. Läsning Bioluminescence
- Efter 5 h inkubationsperiod till 25 ^ il luciferin till varje brunn i Vero-celler i den vita fasta plattorna. Lägg luciferin manuellt eller med en automatiserad dispenser integrerad i luminometern. OBS: Användning av ett instrument med bara enstaka och slutpunkt läser kan kräva tillägg av en luciferas kompatibel lys buffer före tillsats av luciferinsubstrat att förbättra konsistens.
- Avläs plattorna med följande parametrar:
- Skaka i 5 sek.
- Vänta 30 sek.
- Läs luminiscens på en lämplig fast känslighet / exponeringsvärdet. Om alternativet är tillgängligt på instrumentet med flera punkter lyder (t ex 3 x 3 matris) för att förbättra noggrannheten.
- Spela in och spara kvantifieras självlysande intensitet.
- Om en automatisk dispenser användes för att lägga luciferin rensa luciferin och främsta raderna med varmt sterilt vatten.
8. Data Analysis
- För korrekta resultat, löser icke-linjär regression för att generera en Hill ekvation från standardkurvorna. Tillämpa denna ekvation till de titrerades proven att beräkna virala expressionsenheter. Vissa virus eller situationer kan producera en standardkurva med ett linjärt förhållande; i detta fall lösa en linjär ekvation.
Representative Results
En sammanfattning av arbetsflödet som beskriver hög genomströmning metod illustreras i figur 1. Figur 2 visar resultaten av en typisk standardkurva ofVSVΔ51-Fluc. Fyra-parametern icke-linjär regressionsanalys gav en Hill plot från vilken ålder ingångs pfu (uppskattning av virustiter) kan interpoleras. Dessa beräknade titrar kallas viral expressionsenheter (VEU). Figur 3A visar VEUs och titer som erhålls genom att utföra en standardplackanalys med samma prover 10. Prov kom från ett experiment där olika kemikalier har använts för att förstärka replikation och spridning av VSVΔ51-Fluc i 786-0 celler. VEUs interpoleras från standardkurvan måste multipliceras med en faktor som är baserat på utspädning av prov supernatanter överförs till Vero-celler (i detta fall, är utspädningsfaktorn 5). Den linjära korrelationen mellan titrarna och VEU är visad i fig 3B R2 på 0,8083 och ett Pearsons r poäng av 0.899 (p <0,0001). I figur 4 är typiska cellcytotoxicitet uppgifter från en metabolisk analys visas för 786-0 celler som behandlats med kemikalier före infektion med VSVΔ51-Fluc. Slutligen Figur 5 visar typiska standardkurvor som erhållits med olika virus (herpes simplex virus (HSV), vacciniavirus och adeno-associerat virus (AAV), alla uttrycker eldflugeluciferas) och beskriver inkubationstider och frysnings-upptiningscykler, vilket krävs.
Figur 1 Arbetsflöde för hög genomströmning virus titrering och cytotoxicitetsanalys använder VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 Vero-celler per brunn (100 | il) och inkubera vid 37 ° C. (B) 24hr senare överföring 25 pl standardkurva på att Vero-celler (2 kolumner per platta). (C) Överför 25 ^ prov som skall titrerades på att kvarvarande Vero-celler. Centrifug plattor och inkubera vid 37 ° C. (D) I ett belopp som motsvarar 10% av volymen i brunnen, lägga resazurin reagens till plattan som innehåller de ursprungliga proverna. Inkubera plattorna vid 37 ° C. (E) Efter 3 timmar, läsa och spela in fluorescens och bedöma cytotoxicitet. (F) Efter 5 timmar, tillsätt 25 l av 2 mg / ml lösning av luciferin i varje brunn på Vero-celler. Läs luminiscens och beräkna Viral Expression Units.
Figur 2 Förväntad standardkurva för VSV Δ 51-Fluc. Luciferasuttryck var migasured 5 timmar efter överstående överföring på fem olika punkter inom en brunn med en luminometer och mareld uttrycktes i genomsnittliga relativa ljusenheter (RLU). Mean RLU plottades mot kända inmatnings pfu / ml för att lösa icke-linjär regression och generera en Hill-ekvationen. Medelvärdet av två likadana kurvor och barer standardavvikelse visas (r 2 = 0,9993).
Figur 3 Jämförelse av standardplackanalys titrar med sådana som erhållits genom hög genomströmning metod. (A) Viral titer i PFU / ml erhålls genom standardplackanalys på Vero-celler jämfördes med beräknade virustitrar (VEU / ml) från samma prover titreras med hjälp av hög genomströmning luciferasanalysen. (B) linjärt samband mellan VEU / ml och titer som erhållits via standard plaque assay. Linjär regressionskurva och graden (R2) visas.
Figur 4 Exempel på livskraft. Prov lönsamhet före supernatant överföring på Vero-celler bestämdes genom att utvärdera cellulär metabol aktivitet med ett kommersiellt tillgängligt resazurin lösning. Raw fluorescensvärden normaliserades till den hos obehandlade, oinfekterade brunnar.
Figur 5 Beräknad standardkurvor med HSV, Vaccinia och AAV virus. Luciferasuttryck mättes vid fem olika punkter inom en brunn med en luminometer och mareld uttrycktes i genomsnittliga förhåltiva ljusenheter (RLU). (A) HSV standardkurva sattes till Vero-celler ut 24 h tidigare vid en densitet av 2,5 x 10 4 celler per brunn (100 | il) och luciferas mätning gjordes 17 h efter supernantant överföring (R 2 = 0,9489, n = 1). En Hill-ekvationen genererades genom att lösa icke-linjär regression. (B) Vaccinia standardkurva sattes till Vero-celler ut 24 tim tidigare en densitet av 2,5 x 10 4 celler per brunn (100 ^ il) och inkuberades under 2,5 h vid 37 ° C, varefter luciferas Mätningar togs (R 2 = 0,9892). En linjär ekvation genererades genom att lösa för den linjära regressionen. (C) AAV standardkurva sattes på humana lungkarcinomceller (A549) plated 24 h tidigare vid en densitet av 2,5 x 10 4 celler per brunn (100 | il) och luciferas mätning gjordes 24 h efter infektion. En Hill-ekvationen genererades genom att lösa icke-linjär regression. Den genomsnittligafem likadana kurvor och barer standardavvikelse visas (R2 = 0,9926).
Discussion
Den luciferas baserad metod som beskrivs här ger en rad fördelar jämfört med andra befintliga metoder inklusive dess lätthet, snabbhet, minimal utrustning behöver, och relativt låg kostnad. En viktig bidragande orsak till detta är att undvika en serieutspädningssteg. Trots serieutspädningsbaserade derivat av detta protokoll är säkert genomförbara och har nyligen använts för att bedöma luciferas-uttryck Ebola titrar i en hög genomströmning antivirala skärm 11. Även i sig mer tidskrävande och dyrare, kan sådana anpassningar ge större dynamiskt område för viral kvantifiering vid behov. Förutom att vara särskilt väl lämpad för att utvärdera virala titrar i samband med hög genomströmning skärmar, genererar vår en-stegs luciferas baserad viral kvantifiering metod noggranna uppskattningar av infektiösa virioner i fallet med replikerande virus. Vidare avläsning av luminescensen längs med cytotoxicitet-data från samma experiment ger en merkomplett bild av effekten av experimentella betingelser på målceller, som är särskilt användbar i samband med onkolytiska virus och läkemedels skärmar.
Exemplet illustreras här använder en replikerande negativt enkelsträngat RNA-virus; Men, kan detta protokoll anpassas till ett antal replikera och icke replikerande virus med några mindre protokolljusteringar. Detta inkluderar DNA-virus såsom Vaccinia, HSV, och AAV (se Figur 5). Prover infekterade med intracellulära virus, såsom vacciniavirus exempelvis kräva en virus-release steg före kvantifiering (t.ex. minst en frys-tö cykel). Vid tillämpning av denna teknik för andra virus, är det nödvändigt att optimera inkubationstiden från överföringen av den virala supernatanten eller lysatet för att läsningen av plattorna genom luminometern. Denna parameter kommer att bero huvudsakligen på replikationscykeln för viruset i permissiv cellinje och styrkan av promoter kör luciferasuttryck. Detta görs bäst genom att använda den fullständiga standardkurvan i optimeringssteget. För att göra detta måste man infekterar lämpliga tillåt cellinje med olika replikat av beredda standardkurva och läsa varje replikera vid olika tidpunkter efter överföring. Idealt är en inkubationstid punkt som valts som leder till ett linjärt förhållande mellan LOG (RLU) och LOG (titer) som spänner över det förväntade provspridningsområde. För VSVΔ51-Fluc, detta är typiskt från 10 4 pfu / ml -10 7 PFU / ml för en 5 timmars inkubationstid. Om lägre eller högre titer väntas från prover, kan man enkelt öka eller minska inkubationstiden respektive. Alternativt kan proverna spädas för att falla inom intervallet mycket som görs vanligtvis för ELISA.
Som nämnts ovan är denna metod väl lämpad för att utföra hög kapacitet drogskärmar som använder biblioteken drog som de flesta av de steg kan automatiseras. Celler kan pläterad efficiently användning av en automatiserad mikroplatt dispenser, kan läkemedelsbiblioteket tillsättas med användning av en 96-kanals vätskehanteraren kan viruset tillsättas med användning av en mikroplatt dispenser och plattorna avlästes med användning av en automatiserad luminometer. I teorin kan det också anpassas till 384 brunnar eller mindre format; Men begränsningen för detta är antalet celler som kan pläterade, ges färre celler leder till ett smalare sortiment i linearitet LOG (RLU) till LOG (titer) relation. Slutligen kan bedöma cellviabilitet använder resazurin eller andra metaboliska färgämnen lätt införlivas i arbetsflödet, vilket möjliggör diskriminering av cytostatika i antivirala skärmar eller identifiering av föreningar som leder till synergistisk dödandet i kombination med virus 12. Trots begränsningarna med denna metod är bland annat kravet på en luciferas transgen uttrycker virus, vilket inte alltid är möjligt, och att det finns en tillräckligt tolerant cellinje. Emellertid är det sannolikt möjligt att anpassametoden för användning med andra reportergener (t ex GFP) tillgänglig reportern kvantifiering metod har en lämplig linjäritet och signalbrusförhållandet. Sammantaget kan den beskrivna hög genomströmning metod modifieras för att passa många olika virus och anpassas till olika tillämpningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J.
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
