Protocol
1. Numune Hazırlama
- 96-yuvalı plakalar içine titrasyon ve transferi için lusiferaz sentezleyen virüsün (bir örnek olarak VSVΔ51-Fluc) içeren numuneler elde edilir. Alternatif olarak, doğrudan, 96 oyuklu doku kültür plakaları ve kullanım yüzer enfeksiyonların gerçekleştirin.
- Standart eğriler dahil işlenmemiş iki sütun bırakın. Daha sonraki bir tarihte -80 ° C ve titrede deney (40 saat post-enfeksiyon) veya mağaza sonunda 96-yuvalı plakalar, titresi doğrudan yapılan deneyler için.
Virüs titrasyonu için, permisif ve Hücreler 2. Hazırlık
- 24 saat önce hassas olarak ölçülmesi için,% 10 fetal inek serumu ihtiva eden Dulbecco'nun Modifiye edilmiş Eagle ortamında 2.5 x 10 5 hücre / ml (DMEM) (FBS), 30 mM HEPES konsantrasyonunda Vero hücrelerinin bir süspansiyon hazırlamak, ve% 1 penisilin / kültürlendi. NOT: Bu protokol Vero hücreleri kullanır rağmen, VSV enfeksiyon için uygun herhangi bir müsamahakar hücre hattı olabilir bde kullanılabilmektedir.
- Bir mikro-dağıtıcı kullanılarak 96 oyuklu beyaz bir katı, düz tabanlı plakalar içerisinde 2.5 x 10 4 hücreleri (100 ul) Tohum.
- Plaka başına hücre süspansiyonu 12 ml artı astar boyunca 5 ml hazırlayın.
- Steril 50 ml su ile yıkama, borunun temizleyin mikro dağıtıcı kaseti.
- Hücre süspansiyonu ile mikroplaka dağıtıcı çizgileri doldurmak ve hücre 5 ml süspansiyon akışı sağlar.
- Beyaz bir duvarlı 96-çukurlu bir levhanın her çukuruna 100 ul dağıtmak bir program seçin. Koyun, ve ek plakalar için gerektiği gibi tekrarlayınız. Opak dipli beyaz duvarlı plakalar hücre sağlığı ve yoğunluk doğrulanması için kullanıldığında aynı zamanda, bir 96-açık görüş düz tabanlı plaka içinde bir kuyu kaç tohum.
- geri orijinal kabın içine bitmiş, floş hücreler. Borular yoluyla ılık steril 50 ml su, ardından% 70 etanol, 50 ml çalıştırarak kaseti temizleyin.
- Emin kaset ve tüp ap olunpropriately kullanımları arasındaki temizlenmelidir.
- Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe hücreleri.
Viral Standart Eğrisi 3. hazırlanması
- 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml serum içermeyen DMEM içinde VSVΔ51-Fluc bir standart eğri hazırlamak, aşağıdaki şekilde, Vero hücreleri üzerine transfer edildikten sonra, ml başına plak oluşturucu birim (pfu), nihai konsantrasyon olduğu 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / mi, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / mi, 10 2 pfu / ml ve 10 1 pfu / ml olmuştur. Vero hücrelerinin plaka artı ekstra% 10 başına her bir konsantrasyonu 50 ul hazırlayın.
Not: lusiferaz virüs stokunun titresi kesin miktar sağlayacak bir standart eğri hazırlamak için klasik bir şekilde 10 değerlendirilecek gerekir. Aksi takdirde, miktar ölçümü keyfi ayarlayarak, viral titresi kesin titre bilgi olmaksızın elde edilebilir göreseyreltme adımlar. Örneğin, standart eğrinin birinci seyreltme 10 8, viral birimleri ve 10 7 ve böylece için aşağıdaki 1/10 seyreltme için ayarlanmış olabilir. Bu bağlamda, kesin olmayacağı gibi kesin miktar önceden belirlenmiş bir örneğe göre daha kat değişiklik olarak ifade değerleri gerekmektedir.
Permisif hücreler üzerine Örnek süpernatanlarından 4. Transferi
- Tekli tabakaları, en azından% 95 birleştiğinde olduğunu teyit etmek üzere, bir ışık mikroskobu altında berrak tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde kaplama Vero hücreleri kontrol ediniz.
- Beyaz duvarlı plakalarda tohumlanmıştır Vero hücreleri üzerine örnek süpernatan 25 ul aktarın. Standart eğrileri için belirlenen 2 sütun halinde süpernatanlarm havale etmeyin. Not: Bu, bir kanal 96, sıvı işleyici kullanarak tek bir plaka üzerinde tüm oyuklara için eş zamanlı olarak yapılabilir.
- 8 veya 12 kanallı bir çok kanallı pipet kullanılarak, in Vero hücrelerinde edilmesi için Adım 3'te hazırlanan standart eğrinin her bir seyreltinin 25 ul2 belirlenen sütun.
- Oda sıcaklığında 430 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje plakalar.
- Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 5 saat boyunca inkübe edin.
Hücre canlılığı 5. Değerlendirme
- Not: açık, 96 oyuklu plakalar içinde yapılan enfeksiyon deneylerden elde edilen yüzer başlayarak zaman, örnek canlılık gibi resazurin gibi bir hücre canlılığı işaret eden bir boya ile miktar tayini önce değerlendirilebilir.
- Virüs ve hücreleri içeren örneklerin, 96 oyuklu plakanın her oyuğundaki hacminin% 10'una eşit bir miktarda resazurin ekleyin. Cell-only sırasıyla% 100 ve% 0 canlılığı değerlerini belirlemek için medya sadece kontrol yanı sıra kontrol içerir.
- 2-4 saat (hücre tipine ve boya ticari olarak temin edilebilir ya da yeniden oluşturulan toz konsantrasyonuna bağlı olarak değişir inkübasyon süresi) sonra, okuma ve bir floresan plaka okuyucu kullanarak (530-560 uyarma, 590 emisyon) kullanarak sinyali kaydedilir. Rapor hücre viabilix% 100 formülüne Nispi metabolik aktivite = - (- negatif kontrol sinyali) / (Hücre tek sinyali kontrol negatif kontrol sinyali) (Test Örnek sinyali) 'e uygun bir numune için ty
Luciferase Yüzey 6. hazırlanması
- 30 dakika 5 saat inkübasyonun sonunda önce, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 2 mg / ml bir solüsyon elde etmek için, lusiferin hazırlar. Plaka başına 2.5 ml artı bir ilave 2 ml hazırlayın. Işıktan çözüm koruyun. Not: lusiferin da günün erken hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
7. Okuma Biyoparlaklık
- 5 saatlik bir bekletme süresinden sonra, beyaz bir katı plakalar içinde Vero hücreleri her çukuruna luciferase 25 ul ekle. Elle veya luminometreye entegre otomatik bir dağıtıcı ile lusiferin ekleyin. Not: sadece tek ve bitiş noktasına sahip bir aletin kullanılması, bir lusiferaz uyumlu bir parçalama tampon tamponundan eklenmesini gerektirebilir okurfer tutarlılığını artırmak için lusiferin tabakayı eklemeden önce.
- Aşağıdaki parametrelerle plakaları okuyun:
- 5 saniye çalkalayın.
- 30 saniye bekleyin.
- Uygun bir sabit hassasiyet / poz değeriyle luminescence okuyun. Seçeneği enstrüman üzerinde varsa, çok noktalı doğruluğunu geliştirmek için (örneğin, 3 x 3 matrisi) okur kullanın.
- Kayıt ve sayısal biyolüminesens yoğunluğunu kaydedin.
- Otomatik dağıtıcı eklemek için kullanılır ise lusiferin lusiferin ve başbakan ılık steril su ile hatları temizlemek.
8. Veri Analizi
- Doğru sonuçlar için, standart eğrileri bir Tepesi denklem oluşturmak için non-lineer regresyon çözmek. Viral ekspresyon birimden titre örnekleri için bu denklem uygulanır. Bazı virüsler veya durumlar, doğrusal bir ilişki ile standart eğri üretebilir; Bu durumda lineer bir denklem çözmek.
Representative Results
Yüksek verimli bir metodu tarif eden akışı bir özeti Şekil 1 'de gösterilmektedir. Şekil 2 tipik bir standart eğri ofVSVΔ51-Fluc sonuçlarını göstermektedir. Non-lineer regresyon analizi Dört-parametresi bilinmiyor giriş pfu (viral titreye tahmini) interpolasyon edilebileceği bir Tepesi arsa oluşturulur. Bu tahmini titerleri olarak adlandırılır viral sentezleme birimi (VEU). Şekil 3A ve Veus titreleri aynı örnekler 10, standart plak test sureti ile elde edilen göstermektedir. Numuneler çeşitli kimyasallar çoğaltma geliştirmek için kullanılabilir, 786-0 hücrelerinde VSVΔ51-Fluc arasında yayılmış olan bir deney kaynaklanmıştır. Standart eğri interpolasyon Veus örnek süpernatanların seyreltilmesine dayanan bir faktör ile çarpılmalıdır Vero hücreleri üzerine transfer edilmektedir (bu durumda, seyreltme faktörü 5'tir). Titreleri ve VEU arasında doğrusal bir ilişki Şekil 3B'de gösterilmiştir 2 ve 0,899 (p <0.0001) Pearson r skoru. Şekil 4'te, bir metabolik tahlilinden elde edilen tipik bir hücre sitotoksisitesi veriler önceden VSVΔ51-Fluc enfeksiyonuna kimyasal ile muamele 786-0 hücreler için gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 5, çeşitli virüs ile kullanılarak elde edilen standart bir eğri (herpes simpleks virüsü (HSV), vaccinia virüs ve adeno-ilişkili virüs (AAV), tüm ifade ateşböceği lüsiferaz) gösterir ve gerekirse, inkübasyon sürelerini ve donma-erime döngüleri tarif eder.
VSV-Δ 51 Fluc yardımıyla yüksek verimli, virüs titre ve sitotoksisite tahlilinin Şekil 1. İş Akışı. 37 ° C'de (A) Tohum oyuk (100 ul) başına 2.5 x 10 4 Vero hücreleri ve inkübe edilir. (B) 24saat sonra aktarım için Vero hücreleri üzerinde standart bir eğri 25 ul (plaka başına 2 sütun). (C) örneklerinin Aktarım 25 ul kalan Vero hücreleri üzerinde titre etmek için. Santrifüj plakaları ve de 37 ° C '. (D) içindeki hacmin% 10'una eşit olan bir miktar içinde en inkübe orijinal numune içeren plağa resazurin reaktifmi. , 5 saat sonra, (F). Sitotoksisite floresans okunur ve değerlendirilmesi, 3 saat sonra, 37 ° C'de. (E) inkübe edin Vero hücrelerinin her oyuğuna luciferase 2 mg / ml çözeltisi 25 ul ekle. Luminescence okuyun ve Viral İfade Birimleri hesaplayın.
Şekil 2. VSV Δ 51-Fluc standart eğri Beklenen. Lüsiferaz ifadesi bendimiyi bir luminometre kullanılarak ve bioluminesans ortalama bağıl ışık birimleri (RLU) olarak ifade edildi içinde beş farklı noktalarda 5 saat sonrası süpernatant transferi asured. RLU ortalama bilinen girişine karşı çizilmiştir pfu / ml non-lineer regresyon çözmek ve Hill-Denklemi üretir. Iki suret eğrileri ve standart hata çubukları ortalama (r = 0,9993 2) gösterilmiştir.
Şekil yüksek verimli bir yöntem ile elde edilen standart plak test titrelerinin 3. karşılaştırılması. (A), VEU / ml arasında pfu / mL yüksek verimli bir lusiferaz deneyi kullanılarak titre aynı örneklerden hesaplanan viral titreler (VEU / ml) ile karşılaştırıldı Vero hücreleri üzerinde standart plak deneyi ile elde edilmiştir. (B) lineer bir ilişki içinde viral titreleri ve titre standart p yoluyla elde edilenlaque deneyi. Doğrusal regresyon eğrisi ve kararlılıkla (R 2) katsayısı gösterilmiştir.
Şekil 4. Örnek mevcudiyetini göstermektedir. Vero hücreleri üzerinde yüzer transferi, ticari olarak temin edilebilir çözelti kullanılarak Resazurin hücresel metabolik aktivitesinin değerlendirilmesi ile belirlenmiştir örnek canlılığı önce. Ham flüoresan değerleri, muamele edilmemiş, enfekte olmamış kuyusunun en az normalize edildi.
Şekil 5. HSV, vaksiniya, ve AAV virüs, standart eğriler beklenir. Lusiferaz tanımı, iyi bir luminometre kullanılarak bir mesafede olan beş farklı noktalarda ölçülmüştür ve biyoışıldama ortalama gerçek konusunda ifade edilditif ışık birimleri (RLU), (A). HSV standart bir eğri Vero hücrelerine ilave edilmiştir 17 saat sonrası Süpernatan transferi (R2 yapıldı oyuk (100 ul) ve lusiferaz ölçüm başına 2.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda 24 saat önce kaplı = 0,9489, n = 1). , Hill denklemi bir lineer olmayan regresyon çözerek elde edilmiştir. (B), bir standart eğri, Vaccinia Vero hücrelerine ilave edilmiştir oyuk (100 ul) başına 2.5 x 10 4 hücrelerinin 24 saat önce bir yoğunluğa yerleştirildi ve 37 ° C'de 2.5 saat boyunca kuluçkaya C, bundan sonra lusiferaz ölçümleri alınmıştır (R 2 = 0,9892). Lineer bir bağıntı lineer regresyon çözülmesi ile elde edilmiştir. (C), bir standart eğri, AAV insan akciğer kanser hücreleri (A549) üzerinde ilave edildi oyuk (100 ul) ve lusiferaz ölçüm başına 2.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda 24 saat önce kaplı 24 saat sonrası enfeksiyon yapıldı. A Hill denklemi doğrusal olmayan regresyon çözme ile oluşturulmuştur. OrtalamaBeş kopya eğrileri ve standart hata sütunları gösterilmiştir (R 2 = 0,9926).
Discussion
Burada açıklanan lusiferaz bazlı bir kolaylığı, hız, en az ekipman gerekir, ve nispeten düşük maliyetle de dahil olmak üzere, diğer mevcut yöntemlere göre bir çok avantaj sağlamaktadır. Bu kadar önemli bir katkı, bir seri seyreltme adım kaçınma olduğunu. Bununla birlikte bu protokolün seri seyreltme esaslı türevler, kesinlikle mümkün olan ve son zamanlarda, yüksek verimli bir anti-viral Ekran 11-lusiferaz sentezleyen Ebola titrelerini ölçmek için kullanıldı. Doğal olarak daha fazla zaman alıcı ve daha pahalı olsa da gerektiğinde, bu tür uyarlamalar viral ölçümü için daha fazla dinamik aralık sağlayabilir. , Yüksek verimli taramalara bağlamında, viral titreleri değerlendirmek için özellikle uygun olmasına ek olarak, bizim tek aşamalı bir lusiferaz dayanılarak viral ölçme yöntemi virüs çoğaltma durumunda, enfeksiyonlu viryon doğru tahminlerini oluşturur. Bundan başka, aynı deneyden sitotoksisite verileri ile birlikte bir parlaklık okumaları daha eldehedef hücreler üzerinde deney koşullarının etkisinin tam resmi, onkolitik virüs ve ilaç ekranlarının bağlamında özellikle kullanışlıdır.
Burada gösterilen örnek kopyalayan Negatif tek iplikli RNA virüsü kullanır; Bununla birlikte, bu protokol birkaç küçük ayarlamalar ile protokol virüs çoğalmasını ve replike edici olmayan bir dizi şekilde ayarlanabilir. Bu, Vaccinia, HSV ve AAV (bakınız Şekil 5) gibi maddeler, DNA virüslerini içerir. Örneğin vaccinia virüsü gibi hücre içi virüs ile enfekte numuneler önce, miktar (örneğin, en az bir dondurma-çözme çevrimi) için bir virüs bırakma adımı gerektirir. Diğer virüsler için bu tekniği uygulandığında, lüminometre ile plakaların okuma viral süpernatan veya lizat transfer kuluçka süresinin optimize edilmesi gereklidir. Bu parametre izin veren hücre hattında virüsün replikasyon döngüsü ve p gücü esas bağlı olacaktırromoter lusiferaz ekspresyonunu tahrik. Bu en iyi duruma getirme aşamasında tam bir standart eğri kullanılarak yapılır. Bunu yapmak için, bir hazırlanan standart eğri çeşitli çoğaltır ile uygun müsamahakâr hücre hattı bulaştırmak ve post-devret işaret her bir farklı bir zamanda çoğaltmak okumak gerekir. İdeal olarak, bir kuluçka zaman noktası beklenen örnek titre aralığı kapsayan LOG (RLU), ve log (titre) arasında doğrusal bir ilişki yol açar seçilir. VSVΔ51-Fluc için, bu tipik olarak 4 ila 10 pfu / mL -10 7 pfu / ml, 5 saat inkübasyon süresi için. Düşük veya yüksek titreleri numunelerden beklenen varsa, biri sadece sırasıyla artırmak veya kuluçka süresini azaltabilir. Alternatif olarak, örnekler, ELISA için tipik olarak yapıldığı gibi daha aralığına düşecek şekilde seyreltilebilir.
Yukarıda belirtildiği gibi, bu yöntem de en adımların otomatik edilebilir ilaç kütüphaneleri kullanılarak yüksek verimli ilaç ekranlar gerçekleştirmek için uygundur. Hücreler e kaplı olabilirfficiently otomatik bir mikro dağıtıcısı kullanılarak ilaç kütüphane 96 kanallı bir sıvı tutucu yolu ile eklenebilir, virüs bir mikro-dağıtıcı kullanılarak ilave edilebilir ve plakalar, bir otomatik luminometre kullanılarak okundu. Teorik olarak, bu da 384-kuyucuklu bir veya daha küçük formatlarda adapte edilebilir; Bununla birlikte, bu amaçla sınırlama kaplama olabilir hücre sayısı, verilen daha az hücre (titre) ilişki için kullanılacak günlük (RLU) arasında doğrusal olarak dar bir aralığı sebep olur. Son olarak, Resazurin ve diğer metabolik boyalar kullanılarak hücre canlılığı değerlendirmesi kolay virüs 12 ile kombinasyon halinde sinerjistik bir antiviral öldürülmesine yol ekranlar ya da bileşiklerin tanımlanması sitotoksik bileşiklerin ayrım sağlayan, iş akışı içinde dahil edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntemin sınırlamaları her zaman mümkün değildir, bir lusiferaz transgen ifade virüs, gereksinimi ve yeterince izin veren hücre hattının durumunu içerir. Bununla birlikte, adapte etmek mümkündür muhtemeldirDiğer raportör gen ile birlikte kullanılmak için olan yöntem (örneğin GFP) raportör ölçme yöntemi gürültü oranı için uygun bir doğrusallık ve sinyal sahip olması koşuluyla. Genel olarak, anlatılan yöntem, yüksek verimli bir çok farklı virüs uyacak şekilde değiştirilebilir ve farklı uygulamalar için uygun olabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J.
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
