Summary
Un procedimiento para el estudio de la capacidad de un contexto ambiental de alcohol asociado a desencadenar la renovación de la conducta de búsqueda de alcohol en ratas se describe.
Abstract
Contextos ambientales en los que las drogas de abuso se consumen pueden desencadenar el deseo, una respuesta pavloviana acondicionado subjetiva que puede facilitar la conducta de búsqueda de drogas y la recaída puntual en los usuarios de drogas en abstinencia. Hemos desarrollado un procedimiento para estudiar los procesos conductuales y neuronales que median el impacto del contexto en el comportamiento de búsqueda de alcohol en ratas. Después de la aclimatación al gusto y los efectos farmacológicos de etanol al 15% en la jaula de alojamiento, ratas macho Long-Evans reciben entrenamiento en discriminación pavloviano (PDT) en cámaras de acondicionamiento. En cada sesión diaria (lunes a viernes) PDT, se producen 16 ensayos cada uno de los dos estímulos diferentes auditivo 10 seg acondicionado. Durante un estímulo, el CS +, 0,2 ml de etanol al 15% se entrega a un puerto de fluido para el consumo oral. El segundo estímulo, el CS, no se empareja con etanol. A través de sesiones, entradas en el puerto de fluido durante el aumento de CS +, mientras que las entradas durante el CS se estabilizan a un nivel más bajo, lo que indica que un predictive asociación entre el CS + y etanol se adquiere. Durante PDT cada cámara está equipada con una configuración específica de estímulos contextuales visuales, olfatorias y táctiles. Después de PDT, la extinción de formación se lleva a cabo en la misma cámara que ahora está equipado con una configuración diferente de los estímulos contextuales. El CS + y CS se presentan como antes, pero el etanol se retira ésta, lo que provoca una disminución gradual de entradas de puerto durante el CS +. En la prueba, las ratas se colocan de nuevo en el contexto PDT y presentan con las CS + y CS-como antes, pero sin etanol. Esta manipulación provoca un aumento robusto y selectivo en el número de entradas de puerto realizadas durante el alcohol predictivo CS +, sin ningún cambio en la respuesta durante el CS. Este efecto, conocido como la renovación inducida contexto-, ilustra la capacidad poderosa de contextos asociados con el consumo de alcohol para estimular el comportamiento de búsqueda de alcohol en respuesta a señales de Pavlov alcohol.
Introduction
Permanecer sobrio es un desafío considerable que enfrentan las personas que sufren de trastornos de abuso de alcohol. La abstinencia es un momento de vulnerabilidad al impacto conductual, psicológico y fisiológico de los estímulos ambientales que acompañan habitualmente el consumo de alcohol, que pueden, a través del condicionamiento pavloviano, se asocian con la embriaguez 1,2. La exposición a las señales de predicción de alcohol puede provocar respuestas condicionadas, como las ansias de alcohol, lo que puede promover conductas de búsqueda de alcohol que facilitan la recaída 3,4.
Las secuencias estereotipadas de comportamiento que llevan al consumo de alcohol pueden causar ciertos tipos de estímulos para ser experimentadas habitualmente inmediatamente antes de los efectos farmacológicos de la ingesta de alcohol. Por ejemplo, la vista, el olfato y el gusto del alcohol son las propiedades sensoriales de alcohol que preceden fiable intoxicación. Además de estas señales, que se conocen como 'discreta' o 'proximaseñales l ', contextos ambientales en las que las drogas se usan con regularidad también puede provocar ansias 5,6. La exposición a los lugares físicos en los que los fármacos han sido previamente utilizadas por lo tanto puede ser un desencadenante crítico para la recaída 7.
Se han desarrollado modelos animales para estudiar los mecanismos neurales que median el impacto de los contextos asociados de drogas en el comportamiento de búsqueda de drogas 8-13. El procedimiento descrito en este documento permite la investigación de cómo los contextos asociados con el consumo de alcohol pueden modular el comportamiento de búsqueda de alcohol que está provocada por una discreta, alcohol predictivo cue pavloviano.
Entrenamiento en discriminación pavloviano se lleva a cabo en un contexto ambiental específico, donde las ratas se entrenan para conductualmente distinguir entre dos estímulos auditivos acondicionado, un + CS que se empareja con el alcohol, y un CS que no lo es. Sesiones de extinción se llevaron a cabo a continuación, en un contexto diferente, donde la respuesta a la CS+ Disminuye como resultado de alcohol ha sido retenido. Posteriormente, la reexposición al alcohol asociado, contexto de formación pavloviano desencadena un aumento selectivo en el comportamiento de búsqueda de alcohol inducida por el CS +, sin ningún cambio en la respuesta a la CS. Este resultado, que hemos replicado consistentemente 9,14-16, extiende los resultados de los procedimientos instrumentales de acondicionamiento en la que se han encontrado contextos de drogas para estimular la renovación de las respuestas operantes asociados con la administración de fármacos 10,13.
Protocol
Todos los procedimientos son aprobados por el Comité Ético de Investigación Animal de la Universidad de Concordia y están de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales.
1. Animales
- Obtener ratas macho Long-Evans (220 - 240 g) a la llegada.
- Mantener ratas en una temperatura (21 ° C) y humedad (44%) controlado centro de atención a los animales, en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con las luces encendidas a las 7:00 am.
- Par-house ratas a su llegada. Después de 3 días, las casas las ratas individualmente en jaulas rectangulares de plástico con ropa de cama de beta-chip, un hueso de nylon, y el libre acceso a comida para ratas estándar y agua. Utilice tapas de jaula que tienen ojales dobles para permitir la posterior colocación de una segunda botella, además de la botella de agua. NOTA: Las ratas pueden ser alojados individualmente tan pronto como llegan a las instalaciones de cuidado de los animales.
- Empezar a manejar ratas diaria. NOTA: Como una guía, de una semana de tratamiento es por lo general suficiente para aclimatarse a ser picked y manejado por el experimentador.
2. intermitente Etanol acceso en el Inicio de la jaula
NOTA: Conducta acceso etanol intermitente en la jaula de alojamiento para asegurar que las ratas beben cantidades fisiológicamente relevantes de etanol antes de la fase de formación del comportamiento del experimento comienza 17-19. Iniciar este procedimiento durante la fase de luz, aunque podría ser iniciado en cualquier momento durante el ciclo de luz o la oscuridad.
- Prepare dos botellas de cada rata.
- Utilice un plástico 100 ml cilindro graduado como la botella de etanol y una botella de agua de plástico estándar de 473 ml. Utilice una relativamente pequeña botella de etanol de capacidad, llena casi a la máxima capacidad de volumen, para minimizar la pérdida de etanol debido a las fugas y la evaporación.
- Llene una botella con etanol al 15%, preparada diluyendo etanol al 95% en agua del grifo. NOTA: Otras concentraciones de etanol, tal como 10% o 20%, puede ser utilizado en lugar de etanol 15%.
- Fill la segunda botella con agua del grifo.
- Insertar un tapón de goma, con un tubo para sorber que contiene un cojinete de bolas para minimizar las fugas, en cada botella.
- La creación de dos jaulas de control, tratados de forma idéntica a las jaulas con la excepción de que las jaulas de control no contienen ratas o ropa de cama.
- Preparar botellas de etanol y agua para las jaulas de control como se especifica en los pasos 2.1.1 - 2.1.4.
- Utilice las medidas obtenidas a partir de las jaulas de control para controlar el derrame y / o evaporación que puede ocurrir en el transcurso de la sesión de acceso etanol (como se describe en los pasos 2.8.1 - 2.8.2).
- Pesar todas las botellas de etanol y agua. Registre todos los pesos.
- Pese a todas las ratas. Registre todos los pesos.
- Coloque la botella etanol y la botella de agua en cada jaula y controlar jaula en el mismo tiempo. Deja las dos botellas en las jaulas para las 24 horas.
- Al final del período de 24 h, eliminar las dos botellas de lajaulas al mismo tiempo.
- Pesar todas las botellas de etanol y agua. Registre todos los pesos.
- Para determinar la cantidad de etanol y agua se consume durante el período de 24 horas, restar el peso de cada botella cuando se retiró de la jaula de alojamiento a partir del peso de la botella cuando se coloca en la jaula de alojamiento 24 hr antes para cada rata.
- Haga lo mismo para las dos jaulas de control, y luego calcular el promedio de derrame para cada fluido.
- Reste la cantidad promedio de etanol y agua se derrame, respectivamente, a partir de las medidas de etanol y de consumo de agua correspondientes para cada rata.
- Utilice estas medidas de diferencia de derrame controlado para calcular el consumo de etanol en g / kg, el consumo de agua, y la preferencia etanol.
- Para calcular el consumo de etanol (g / kg), primero convertir el peso (g) de solución de etanol consumido en volumen (ml) basado en la densidad de la solución total (componentes de etanol + agua), de acuerdoa la fórmula de volumen (ml) = Peso (g) / Densidad (g / ml). NOTA: La densidad de la solución variará en función de la concentración de etanol.
- A continuación, multiplicar el volumen (ml) de solución de etanol consumida por la densidad (g / ml) de etanol a escala para la solución porcentaje específico usado, para producir el peso (g) de etanol consumido.
- Divida el peso (g) de etanol consumida por el peso de la rata (kg) para obtener el g / kg medida de consumo de etanol.
- Para calcular preferencia etanol, expresar la ingesta de etanol (ml) como porcentaje del total de líquidos (etanol + agua, ml) de admisión.
- Devuelva la botella de agua sólo de vuelta a casa jaula de la rata. Para el próximo 24 hr, dar acceso a las ratas de agua, pero no de etanol. En lugar de una botella de etanol, colocar una segunda botella de pesado previamente el agua en la jaula de alojamiento.
- Al final del período de 24 h, eliminar las dos botellas de agua de la jaula en el mismo tiempo.
- Pesar ambos conjuntos de botellas de agua. Registre todos weipeleas.
- Restar el peso de cada botella cuando se retiró de la jaula de alojamiento a partir del peso de la botella cuando se coloca en la jaula de alojamiento 24 hr antes, restando a cabo la medida promedio derrame obtenido de las jaulas de control como se describe en los pasos 2.8.1 - 2.8.2.
- Utilice estas medidas de diferencia derrames controlados para calcular el consumo de agua.
- Comienza el ciclo de nuevo al proporcionar tanto el etanol como botellas de agua a las ratas, como se describe en los pasos 2.1 a 2.14.
- Repita este ciclo para múltiples (alrededor de 12) sesiones para inducir niveles elevados y estables de consumo de etanol. Véase la Figura 1 para obtener resultados representativos de consumo de etanol (g / kg) en la jaula de alojamiento.
- Alternar la posición espacial de la botella de etanol y agua en la tapa de la jaula a través de sesiones para prevenir el desarrollo de una preferencia lateral.
- Hacer una solución de etanol fresco una vez por semana para asegurar la concentración de etanol precisa y estable a travéssesiones. Minimizar el impacto de la evaporación de etanol durante periodos prolongados de tiempo utilizando este enfoque.
3. Aparato
- Casa cada cámara de acondicionamiento interior de un local aireado, cubículo de atenuación del sonido.
- Construir cada cámara de acondicionamiento de un piso de la barra de metal de acero inoxidable, un techo de policarbonato transparente, de policarbonato transparente pared posterior y la puerta frontal, y paredes laterales de aluminio del panel de metal.
- Instalar un puerto de fluido en el centro cerca de la base de la pared lateral del metal derecho. Equipar la entrada del puerto de fluido con una fotocélula infrarroja para detectar entradas en el puerto.
- Conectar un tubo de polietileno de la parte posterior de la puerta de fluidos a una jeringa de 20 ml que contiene etanol utilizando una aguja de punta roma. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa situado fuera de la cabina de atenuación del sonido. Para las sesiones de entrenamiento discriminación pavloviano, cargar etanol en la jeringa antes de colocarlo en la bomba. Cebe la tubería by avanzar manualmente la bomba, y luego limpie el exceso de etanol a partir de la puerta de fluidos.
- En la pared lateral izquierda, instale un houselight blanco el centro, cerca del techo de la cámara.
- Instale un clicker (2 ciclo Hz) y un generador de ruido blanco con el altavoz en la esquina superior izquierda de la pared lateral izquierda.
- Equipe cada cámara de acondicionamiento con una configuración específica de visuales, olfativas, táctiles y estímulos para crear un contexto distintivo.
- Utilice dos contextos diferentes, designado Contexto 1 y Contexto 2 Configure la mitad de las cámaras de acondicionamiento como Contexto 1 y la otra mitad como Contexto 2.
- Para crear Contexto 1, coloque paneles negros de cartón sobre el techo y las paredes delantera y trasera de la cámara, olor a limón de pulverización (10% v / v, preparada diluyendo el aceite de limón en el agua del grifo) en una placa de Petri y colocarlo en el centro de una bandeja de desechos de metal bajo el suelo de la cámara e inserte un panel de suelo de policarbonato transparente sobre el r de metalpiso od. Cubra la bandeja de residuos con una toalla de papel absorbente o liner banco.
- Para crear Contexto 2, deje el techo y paredes delantera y trasera de la cámara al descubierto, de modo que son claras, spray de olor de almendras (10% v / v, preparada diluyendo benzaldehído en agua del grifo) en una placa de Petri y lo coloca centralmente en una bandeja de desechos de metal bajo el suelo de la cámara e inserte un panel de suelo de metal perforado el suelo varilla metálica. Cubra la bandeja de residuos con una toalla de papel absorbente o liner banco.
4. habituación
Habituar a las ratas a la sala de entrenamiento conductual y cada uno de los dos contextos dentro de cámaras de acondicionamiento. Para esta fase del experimento, no cargue el etanol en los 20 ml jeringas.
- Habituar ratas para el proceso de ser transportado desde el centro de atención a los animales a la sala de entrenamiento del comportamiento en el laboratorio en dos sesiones de habituación cortos.
- En la primera sesión, cargue las ratas in sus jaulas en un carrito con ruedas en las instalaciones de cuidado de los animales, y los transportan a la sala de entrenamiento de comportamiento en el laboratorio. Ilumine las luces de la habitación, encender los ventiladores en cada una atenuación del sonido cubículo, salir del aposento, y cerrada la puerta, y dejar que las ratas a adaptarse a este nuevo entorno durante 20 minutos, mientras permanecen en sus jaulas en el carro. Al final de este período de 20 min, volver a las ratas a la instalación de cuidado animal.
- En la segunda sesión, llevar a las ratas a la sala de entrenamiento de comportamiento en el laboratorio. Al igual que antes, dejar las luces y ventiladores cubículo en la sala. Permanezca en la habitación, con la puerta cerrada para minimizar las distracciones, y la manija y pesan cada rata en la sala de entrenamiento conductual. Anote los pesos, y luego regresar a las ratas a las instalaciones de cuidado de los animales.
- Habituar ratas a las cámaras de acondicionamiento en dos sesiones de habituación cortos.
- Transportar las ratas a la sala de entrenamiento del comportamiento, registrar el peso de cada rata,y cargar cada rata en su cámara de acondicionamiento designado.
- En la primera sesión de habituación configurar la mitad de las cámaras como Contexto 1 y el resto como Contexto 2.
- En la segunda sesión de habituación configurar cada cámara con el contexto en el que no se utilizó en la sesión anterior.
- Realizar sesiones de habituación de una manera contrapeso, de manera que la mitad de las ratas se expone por primera vez al Contexto 1, seguido de Contexto 2, y la otra mitad se expone primero al Contexto 2, seguido de Contexto 1 Idealmente, realizar dos sesiones de habituación en el mismo día, aunque podrían extenderse a través de dos días si es necesario.
- Para las sesiones de habituación, utilizar un programa informático para iluminar el houselight 1 min después de que el programa ha sido emitido. Anote el número total de entradas de puerto de fluidos hechas durante una sesión de 20 minutos. Al final de la sesión, programar el houselight apagar. No presenta ningún etanol o señales durante las sesiones de habituación.
- Limpie el equipo (por ejemplo, paneles de piso, bandejas de basura, cajas de Petri). Ver el paso 5.7 para más detalles.
5. pavloviano Discriminación Formación (PDT)
Tren ratas a conductualmente discriminan entre una señal auditiva que se empareja con etanol y una segunda señal auditiva que no lo es. Para esta fase del experimento, llenar las jeringas con 20 ml de etanol 15%.
- Equipar a cada cámara de acondicionamiento con una configuración específica de visual, olfativo, y estímulos táctiles para crear un contexto distintivo, como se describe en los pasos 3.3.2 y 3.3.3
- Asigne la mitad de las ratas de Contexto 1 y la otra mitad al Contexto 2 de manera contrapeso, basado en el consumo de etanol y la preferencia promedio a través de los últimos 2 sesiones del procedimiento de acceso etanol jaula. Consulte el context utilizarse durante PDT como Contexto A. NOTA: Cada rata sólo debe experimentar un contexto en esta fase del entrenamiento.
- Asegúrese de que el estímulo olfativo es el último estímulo contextual que se añade a cada cámara de acondicionamiento. Cierre las puertas de la cámara y el cubículo de atenuación del sonido para contener el estímulo olfativo y minimizar el comingling de diferentes olores.
- Traiga las ratas en la sala de entrenamiento conductual, registrar el peso de cada rata, y cargar cada rata en su cámara de acondicionamiento designado.
- Iniciar el programa de ordenador que controla la siguiente secuencia de eventos durante cada sesión de TFD.
- A los 5 minutos después de que el programa ha sido emitido, iluminar el houselight.
- Presentar el estímulo de ruido blanco y el clicker estímulo 16 veces cada uno. Designar uno de estos estímulos auditivos ser el CS + y el otro para ser el CS, de una manera contrapeso a través de ambos contextos.
- Hacer cada ensayo l + CS y CSast 10 seg.
- Entregar 0,2 ml de etanol en el puerto de líquidos durante los últimos 6 segundos de la CS +. No entregar ningún etanol durante el CS.
- Haga que cada sesión de TFD últimos 58 minutos de media. Presentar el CS + y la CS-cada en un horario variable de tiempo 67 segundos.
- Entradas de registro de fluidos puerto durante el intervalo de 10 seg (el CS 10 seg durante la presentación CS), el intervalo de 10 seg pre-CS (el 10 segundos inmediatamente antes de la aparición CS), y el intervalo post-CS 10 seg (el 10 segundos inmediatamente siguiente CS offset) tanto para CS + y CS-presentaciones, así como entradas de puerto de fluido totales para toda la sesión. También registre la duración de cada entrada del puerto realizado durante estos intervalos.
- Al final de la sesión, gire el houselight off.
- Eliminar las ratas de las cámaras, devolverlos a sus jaulas, y transportarlos de vuelta a las instalaciones de cuidado de los animales.
- Compruebe los puertos de fluido para asegurar que las ratas consumieron los 3,2 ml de etanol entregados en cada PDT sesión.
- Enjuague el etanol fuera del tubo de polietileno con una jeringa de 60 ml que contiene una pequeña cantidad de agua. A continuación, pasar a 60 ml de aire a través del tubo utilizando un segundo, jeringa vacía, para asegurarse de que esté seco.
- Limpie el equipo. Para la limpieza diaria, lavar los paneles de piso, bandejas de residuos, y los platos de Petri. Una vez por semana, limpiar toda la cámara de acondicionamiento. No utilice productos de limpieza perfumados para evitar la introducción de olores no deseados en el aparato experimental.
- Continuar sesiones de TFD todos los días hasta las ratas muestran discriminación estable en sus respuestas la entrada del puerto de la CS + CS vs. NOTA: Las entradas de Port hechas en respuesta a la CS + deben incrementar las sesiones, mientras que las entradas portuarias realizadas en respuesta a la CS-deben permanecer bajo. El número exacto de sesiones de TFD necesario para alcanzar discriminado respuesta condicionada puede variar, pero, como guía, planeamos aproximadamente 20 sesiones.
6. Extinción
- Equipe cada cham acondicionadoBer con visuales, olfativas, y estímulos táctiles para crear un contexto que es distinta de la de las ratas experimentaron durante las sesiones de PDT. Por ejemplo, si Contexto 1 se utilizó en PDT, configurar la cámara como Contexto 2 para sesiones de extinción. Consulte el contexto utilizado durante la extinción como Contexto B.
- Realizar sesiones de extinción de forma idéntica a sesiones de TFD, pero no entregar cualquier etanol durante el CS +.
- Utilice el mismo programa de ordenador que se utilizó durante la TFD para presentar el + CS y CS.
- Para mantener la coherencia entre las fases del experimento, cargar una jeringa vacía en la bomba de jeringa, y dejar la bomba encendida. Asegúrese de que el tubo de polietileno no contiene etanol antes de sesiones de extinción.
- Continuar sesiones de extinción todos los días hasta las ratas ya no muestran respuesta discriminado entre el CS + y CS. NOTA: Las entradas de Port hechas en respuesta a la CS + deben disminuyen gradualmente a través de sesiones de extinción, hasta que no haya diference entre entradas de puerto realizadas en respuesta a la CS + y entradas de puerto realizadas en respuesta a la CS. El número exacto de sesiones de extinción necesarios para extinguir respuesta condicionada puede variar, pero como guía, planificar en aproximadamente 8 sesiones.
- Limpie el equipo al final de cada sesión, como se describe en el paso 5.7.
7. Contexto inducida Prueba Renovación
- Equipar a cada cámara de acondicionamiento con los visuales, olfativas, táctiles y estímulos para crear el contexto que se vivió durante sesiones de TFD. Por ejemplo, si una rata dada experimentó Contexto 1 en sesiones de TFD, configurar su cámara como Contexto 1 en la sesión de prueba. Consulte el contexto utilizado durante la prueba de la renovación como Contexto A.
- Llevar a cabo la prueba de renovación inducida contexto-idéntica a sesiones de TFD, pero no entregar cualquier etanol durante la prueba de la renovación. Presentar el
CS + y CS-como antes durante sesiones de TFD, pero retener el etanol.- Utilice el mismo pr computadoraograma que se utilizó durante la TFD para presentar el CS + y CS.
- Para mantener la coherencia entre las fases, cargar una jeringa vacía en la bomba de jeringa, y dejar la bomba encendida. Asegúrese de que el tubo de polietileno no contiene etanol antes de la sesión de pruebas.
- Observe renovación inducida contexto-de-pavloviano acondicionado comportamiento de búsqueda de alcohol. NOTA: Este efecto de renovación será evidente por un aumento selectivo en el número de entradas de puerto realizadas en respuesta a la CS +, sin ningún cambio en el comportamiento de la entrada del puerto hizo en respuesta a la CS, en relación con CS + y CS-respondieron observó en el final del entrenamiento de extinción.
- Limpie el equipo al final de la sesión, como se describe en el paso 5.7.
Representative Results
Acceso etanol intermitente en la jaula de alojamiento: El consumo de etanol (g / kg) y aumento de la preferencia de etanol a través de sesiones de acceso etanol intermitente en la jaula de alojamiento, por lo general alcanzar niveles estables dentro de 8 a 12 sesiones (Figura 1). En el conjunto de datos se muestra en la Figura 1, el consumo estable etanol promediado en las dos últimas sesiones de acceso etanol jaula varió desde 1,33 hasta 6,44 g / kg para las ratas individuales. La fase de consumo de etanol jaula del experimento se puede detener una vez que el g / kg Consumo ha estabilizado, y las ratas se mantuvo a este nivel estable de beber durante un número de sesiones.
Para analizar los datos de esta fase, realizar el análisis por separado de medidas repetidas de la varianza (ANOVA) a través del factor de la sesión para el consumo de etanol (g / kg) y la preferencia de etanol en un mismo sujeto.
Esquema de procedimiento de renovación inducida contexto: Cada fase de laprocedimiento experimental (PDT, extinción, prueba de la renovación) se ilustra en la Figura 2. Ver el pie de figura para obtener más detalles.
Medidas y datos de respuesta de análisis: En todas las fases de comportamiento se describen a continuación, las respuestas de entrada del puerto realizadas durante el CS + y CS se normalizan con referencia a pre-CS respuestas de entrada de puerto de línea de base. Para crear las medidas normalizadas CS, restar el número de entradas de puerto realizadas durante el intervalo de la línea de base pre-CS (el 10 segundos inmediatamente antes de la aparición CS) a partir del número de entradas de puerto hechas durante las presentaciones de la CS + y CS. El normalizado CS + y CS-medidas normalizadas sirven como indicadores de comportamiento suscitó específicamente por presentaciones CS, elevado por encima de los niveles basales.
Realizar medidas repetidas ANOVA separados con los factores sujetos dentro-repetidas de sesión y tipo CS (CS + vs CS) para el PDT y fases de extinción. Para las comparaciones entre fase (PDT, extinción, renovaral test), los datos de uso promediado en las dos últimas sesiones de TFD y la extinción y la sesión de datos de prueba de renovación en medidas repetidas ANOVA. Para el seguimiento de los efectos significativos principales e interacciones, uso post hoc pruebas t para muestras independientes o apareadas que se corrigen para comparaciones múltiples. Criterio de significación se fijó en α = 0,05.
PDT: respuestas de entrada a puerto a los aumentos de CS + a través de sesiones de TFD, mientras que las respuestas de entrada del puerto de la CS-permanecen bajos y estables, en general. Tenga en cuenta que las respuestas de entrada a puerto a la CS puede aumentar ligeramente en las primeras sesiones de entrenamiento PDT; sin embargo, entradas de puerto hechas en respuesta a la CS se estabilizan a un nivel mucho más bajo que las hechas en respuesta a la CS +. Discriminación éxito se evidencia por una elevación estadísticamente significativa en entradas de puerto durante el CS + en comparación con el CS (Figura 3). Este resultado indica que-pavloviano acondicionado comportamiento de búsqueda de alcohol tiene seres establecido para el CS +, pero no el CS.
Extinción: respuestas de entrada a puerto a la CS + disminuyen gradualmente a través de sesiones de extinción. Respuestas de entrada a puerto a la CS-siguen siendo bajos y estables a través de sesiones de extinción. Idealmente, discriminado responder es abolida a finales de entrenamiento de extinción, como lo demuestra la falta de una diferencia estadísticamente significativa entre entradas de puerto a la CS + y CS. Sin embargo, no es raro que un cierto grado de discriminación de responder a permanecer, incluso al final de la formación extinción. En este caso, es importante verificar que las respuestas de entrada a puerto a la CS + al final del entrenamiento de extinción son estadísticamente más baja que las respuestas de entrada del puerto de la CS + en el inicio de la extinción, así como al final de la terapia fotodinámica (Figura 3) . Este patrón de resultados indica que-pavloviano acondicionado comportamiento de búsqueda de alcohol se haya extinguido significativamente.
Inducida Contexto-examen de renovación: Portrespuestas de entrada a los aumentos de CS + en la prueba de la renovación inducida contexto, en relación con entradas de puerto CS + observadas al final del entrenamiento de extinción. Este aumento es selectivo para el CS +, como entradas de puerto de la CS se mantienen inalterados. Además, las entradas de puerto a la CS + son estadísticamente elevada en comparación con entradas de puerto de la CS en el examen de renovación inducida contexto-(Figura 4). Confirmación estadística de las comparaciones de entradas de puerto CS + entre la extinción y prueba, así como comparaciones de CS + y CS-entradas de puerto dentro de prueba, indica una renovación selectiva de la conducta de búsqueda de alcohol-pavloviano acondicionado inducida por el contexto alcohol asociado a prueba.
Figura 1 La escalada del consumo de etanol y la preferencia inducida por etanol acceso intermitente en la jaula. Media y# 177; SEM (A) el consumo de etanol (g / kg) y (B) de preferencia etanol a través de 12 sesiones de acceso etanol intermitente en la jaula hogar. Ambas medidas suelen aumentar a través de sesiones y luego se estabilizan. Consumo estable etanol promediado en las dos últimas sesiones de acceso etanol jaula oscilado 1,33-6,44 g / kg para las ratas individuales. Estos datos se obtuvieron utilizando ratas macho Long-Evans potable 15% (v / v) de etanol.
. Figura 2 un esquema del procedimiento experimental El procedimiento consta de tres fases: entrenamiento en discriminación pavloviano (PDT), la extinción, y la prueba de la renovación inducida contexto-. Durante cada sesión de TFD, las ratas reciben 16 ensayos de un estímulo condicionado auditivo (CS +) que señala la entrega de etanol y 16 ensayos deun segundo estímulo auditivo (CS) que no está asociado con la entrega de etanol. Sesiones de TFD se llevan a cabo en Contexto A, compuesto por una configuración específica de visual, olfativa, y los estímulos táctiles. Durante sesiones de extinción, que se realizan en el Contexto B, integrado por un conjunto diferente de los estímulos visuales, olfativos, táctiles y, el CS + y CS se presentan, pero el etanol no serán revelados. Para el examen de renovación inducida contexto, las ratas se volvieron a Contexto A, y el CS + y CS se presentan sin etanol. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Adquisición y extinción de discriminados-pavlovianas respuesta condicionada para el etanol. Media ± SEM entradas de puerto normalizado made durante el CS + y CS a través de PDT (sesiones de 1 - 18) en el Contexto A y extinción (sesiones 19 - 26) en el Contexto B. Estos datos se obtuvieron utilizando ratas Long-Evans machos, se entrenó con 10% (v / v) etanol como el estímulo incondicionado (EI) que fue presentada en asociación con el + CS durante la TFD. * P <0,05, CS + CS frente. Figura publicado originalmente en Chaudhri, Sahuque, y Janak (2008). Usado con permiso de Elsevier.
Figura 4. renovación de ± SEM entradas-pavlovianas respuesta condicionada para el etanol. Media normalizada portuarias realizadas durante el CS + y CS en sesiones de TFD en Contexto A, sesiones de extinción en Contexto B, y la prueba de la renovación en el Contexto A. Los datos son inducidos Context- promedio durante las dos últimas sesiones de TFD y extinción; la prueba de la renovación es una sola sesión. Estoslos datos se obtuvieron usando ratas macho Long-Evans, formados con 10% (v / v) de etanol como el estímulo no condicionado (US), que fue presentada en asociación con el CS + durante la TFD. * P <0,05; ** P <0,001, CS + CS frente. #p <0,05, CS + TFD frente al CS + extinción. ^ P <0,05, CS + extinción frente a test CS +. Figura publicado originalmente en Chaudhri, Sahuque, y Janak (2008). Usado con permiso de Elsevier.
Discussion
Los resultados de este procedimiento revelan que los estímulos ambientales específicos que acompañan habitualmente la entrega de alcohol pueden adquirir la capacidad de conducir la conducta de búsqueda de alcohol. También demuestran que los estímulos contextuales asociados a la disponibilidad o ausencia de alcohol antes puede guiar acondicionado respuestas de comportamiento a las señales discretas alcohol predictivo.
Los pasos críticos dentro del protocolo
Contextos de la presente tarea incorporan estímulos externos a la rata. Sin embargo, el estado interoceptivo de la rata a prueba también puede constituir un "contexto" que podría afectar a la renovación 20. Por tanto, es importante para habituarse ratas a los procedimientos que pueden ocurrir antes de la prueba renovación y cambiar su estado interoceptive, como microinfusions intracraneales o inyecciones sistémicas. Por otra parte, la habituación a microinfusions o inyecciones sistémicas debería llevarse a cabo antes de la extinción y tanto PDT sESIONES, para prevenir este tipo de procedimientos se vean asociados a una fase específica de la prueba.
Los parámetros temporales, como la duración CS, intervalo EC-EI, y el intervalo entre ensayos (ITI), hace tiempo se sabe que influyen en respuesta condicionada en una variedad de paradigmas de acondicionamiento 21-26. Del mismo modo, los parámetros temporales pueden influir en la observación del efecto de renovación en nuestro procedimiento. Cualquier conjunto de parámetros distintos a los especificados en el protocolo debe ser validada experimentalmente en estudios piloto antes de proceder a emplearlos en investigaciones de mayor tamaño.
Modificaciones y solución de problemas
La investigación anterior ha encontrado que la cantidad de etanol que las ratas consumen en la jaula de alojamiento puede variar en función del proveedor de la que se compran ratas 17,27. Por lo tanto, el proveedor es una consideración importante para esta fase del estudio. Del mismo modo, la elección de la cepa de rata debe ser considered con cuidado, ya que hay numerosos informes de la cepa diferencias en el consumo de etanol 28-31.
El trabajo previo en un paradigma de condicionamiento aversivo ha demostrado que la edad de desarrollo de ratas influye en la observación de la renovación de una respuesta de miedo condicionado pavloviano 32. La falta de un efecto de renovación en ratas muy pequeños (menores de día postnatal 20) se ha sugerido que se debe a la alteración de la codificación de la información contextual 33. Por tanto, la edad de desarrollo de las ratas para ser usados en la presente procedimiento debe ser tomada en consideración.
Se ha observado Renovación de pavloviano condicionado comportamiento de búsqueda de alcohol cuando se utilizaron 10% 9,16, 15% 14, 20 o 15% soluciones de etanol durante el acceso etanol jaula hogar y PDT fases del experimento. Los investigadores podrían utilizar cualquiera de estas concentraciones de etanol a los efectos del establecimiento de este procedimiento en su laboratories.
Durante la adquisición de la formación discriminación pavloviano es importante comprobar los orificios de fluido después de cada sesión para asegurarse de que todo el etanol que se entregó se ha consumido. Dejando ratas en las cámaras de acondicionamiento de unos 10 - 15 minutos después de cada sesión puede hacerse a principios de PDT para fomentar el consumo de cualquier etanol que no se consumía durante la sesión. El número de ratas que salen de etanol consumido en los puertos debería disminuir a medida que progresa la TFD. Si a finales de ratas PDT son o bien (a) no se consume todo el etanol y / o (b) que no responden a la CS + entonces estos temas deben ser retirados del estudio. La mayoría de las ratas responden a la más fiable + CS de la CS. Sin embargo, algunas ratas pueden responder a altos niveles para ambas señales, con lo que no muestra evidencia de discriminación. Las ratas que muestran altos responden tanto a la CS + y CS durante la TFD no son lanzadas desde el estudio. En nuestra experiencia, estos sujetos muestran una discriminación notabledurante la primera sesión de extinción en ausencia de etanol, lo que sugiere que sus altos niveles de respuesta a la CS durante la TFD son impulsados por la presencia de etanol en el puerto de fluido. Estos sujetos también tienden a mostrar efectos de renovación robustos.
Limitaciones del procedimiento
Debido a que el examen de renovación se lleva a cabo en ausencia de etanol, entradas de puerto acondicionado provocados por el CS + disminuyen gradualmente a través de la sesión de prueba. Por lo tanto, el importe global de la conducta generada en la prueba, en contra de lo que los cambios inducidos experimentalmente pueden ser evaluados, es bastante bajo. Debido a que en esta tarea de responder tiende a ser mayor en el inicio a partir del cierre de la sesión de pruebas, es importante examinar los efectos de las manipulaciones experimentales sobre la respuesta condicionada a modo de prueba por prueba.
Las entradas en el receptáculo de fluido proporcionan la medida dependiente principal en esta tarea. Sin embargo, una entrada de puerto errónea podría ser registrado si un animal está lo suficientemente cerca del receptáculo de fluido para romper el haz infrarrojo a través de la apertura de la puerta de fluidos con sus bigotes. Si bien, las respuestas erróneas infrecuentes son obvias como un aumento dramático en el puerto total de las entradas en relación con la conducta del sujeto en las sesiones previas. Grabación en vídeo de los animales podría facilitar la detección de posibles respuestas erróneas, y permitir un análisis más refinado de los comportamientos exhibidos por las ratas en todo el entrenamiento y las pruebas.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos
Renovación inducida Contexto-del comportamiento de búsqueda de drogas se estudia en gran medida utilizando una tarea de condicionamiento instrumental en el que la variable dependiente primaria es una respuesta operante, tal como una prensa de palanca 8,34 o la nariz meter 12. En el presente procedimiento, la respuesta de búsqueda de drogas es "enfoque condicionado 'al puerto de líquido que se produce al presentaciones deel + CS. Esta respuesta probablemente se adquiere a través del aprendizaje pavloviano, que es el proceso de aprendizaje que media la formación de asociaciones entre estímulos ambientales y los efectos farmacológicos de las drogas de abuso en los seres humanos.
Las aplicaciones futuras
Esta tarea se puede utilizar en combinación con la neurofarmacología, la optogenética y neuroquímica para estudiar los mecanismos neurales que están implicados en la renovación inducida contexto de la conducta de búsqueda de alcohol-pavloviano acondicionado 16. Además, los mecanismos de comportamiento y neuronales que regulan la adquisición y extinción de-pavloviano acondicionado comportamiento de búsqueda de alcohol pueden ser investigados. Por último, esta tarea se puede utilizar para explorar las manipulaciones de extinción que podrían impedir la renovación, una dirección importante para la investigación translacional destinada a reducir el impacto de las drogas asociado contextos ambientales en la reactividad a las señales de predicción de drogas después de la terapia de exposición cue en adi humanacts.
Disclosures
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación Animal de la Universidad Concordia y están en conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Fue posible la publicación de acceso abierto de este artículo por el patrocinio de Med Associates Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy-duty utility cart | Rubbermaid | #4520-88 | Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities |
| Rats, Long-Evans | Harlan | Rats weighed 220-240 g on arrival | |
| Ohaus scale | Fisher | #S402421 | For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it |
| Beta-chips, aspen | Harlan | #7090A | Bedding for home cage |
| Nylabone | Bio-Serv | #K3580 | Enrichment provided in the home cage |
| Autoclavable rodent chow | Agribrands, Charles River | #5075 | For feeding rats |
| Wire bar cage lid | Ancare | #R20SS2B | Custom made with two slots for bottles |
| Cage bottom | Ancare | #R20PC | To house rats |
| Stoppers | Ancare | #8.5 | Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes |
| Ball point tubes, 1.5" length | Ancare | #TD-99 | Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders |
| Water bottles | Ancare | #FSPC8HT | 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper |
| Graduated cylinders, 100 ml | Fisher | #0300741 | To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers |
| Mettler scale | Mettler Toledo | #MS6001S | For weighing water bottles and ethanol cylinders |
| Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter, 1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter | Fisher | #14-169-1A | To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port |
| Needle, 18 g, 1.5" length | Fisher | #B305199 | To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed |
| Syringes, 20 ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #1482316J | To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18 G 1 1/2 needle |
| Syringes, 60 ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #14-820-11 | To flush polyethylene tubing after PDT sessions |
| Single speed syringe pump, 3.33 rpm | Med Associates Inc. | #ENV-018MD | To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol |
| Fluid port | Med Associates Inc. | #ENV-254-CB | To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing |
| Port entry infrared detector | Med Associates Inc. | #ENV-215M | Fixed on both sides of fluid port; need 2 per fluid port |
| Houselight, 28 V, 100 mA | Med Associates Inc. | #ENV-135M | Provides general lighting in conditioning chamber |
| Clicker module | Med Associates Inc. | #ENV-225SM | Auditory stimulus for conditioning chamber |
| White noise generator with speaker | Med Associates Inc. | #PHM-100 | Auditory stimulus for conditioning chamber |
| Bar floor | Med Associates Inc. | #ENV-009A-GF | To go with modular test chamber |
| Bench coat, absorbent | VWR | #89126-790 | Absorbent paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray |
| Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8" x 10" | Johnston Plastics | #30102515 | To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5" x 12.25" pieces |
| Aluminium sheet perforated, 0.063" thick, 48" x 96", 0.250" holes x 0.375" centers | Anica Steel | To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5" x 12.25" pieces | |
| Black cardboard, 0.053" thick, 28" x 44" | Omer DeSerres | #P1909 | To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5" x 13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape. |
| All-purpose strength duct tape, 1.88" x 45 yd. | Duck Tape | Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1. | |
| Modular test chamber | Med Associates Inc. | #ENV-009A | Conditioning chamber |
| Sound attenuating cubicles | Med Associates Inc. | #ENV-200R3AM | Comes with installed 28 V DC fan (#ENV-025F) |
| Petri dish | Fisher | #08748B | Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers |
| PCI interface package | Med Associates Inc. | #DIG-700P2-R2 | Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28 V DC power cable |
| Large tabletop cabinet and power supply | Med Associates Inc. | #SG-6510D | Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package |
| SmartCtrl 8 Input, 16 Output package | Med Associates Inc. | #DIG-716P2 | Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel. |
| Med PC IV software | Med Associates Inc. | #SOF-735 | Software to run programs. Needs to be installed on the computer. |
| Monitor LG, 19" LCD | Concordia computer store | #W1942TQ-BF | Computer monitor; to go with computer running Med PC IV |
| HP Z200 tower workstation | Concordia computer store | #BZ788US#ABA | Computer on which Med PC IV is run |
| Benzaldehyde, ≥99% | Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. | #B37-50 | Dilute in tap water for almond context odor |
| Lemon oil, cold pressed, California | Sigma Aldrich | #W262528-1KG-K | Dilute in tap water for lemon context odor |
| Ethyl alcohol, 95% | Commercial Alcohols | Dilute in tap water to desired concentration |
References
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