Introduction
الكلى أمر ضروري لتوازن السوائل، وتنظيم ضغط الدم وتنقية النفايات من الجسم. على الرغم من الثدييات قادرة على إصلاح النيفرون القائمة بعد الإصابة باستخدام الخلايا الظهارية متباينة 1-4، ويبدو أنها تفتقر إلى مجموعة من الخلايا الجذعية المحجوزة 5 وغير قادر على تشكيل النيفرون جديدة من جديد. وعلى النقيض من الثدييات والأسماك الكبار قادرون على تشكيل النيفرون جديدة في جميع أنحاء حياة الكبار لدعم نمو الأسماك وردا على إصابة 6،7. الزرد، دانيو rerio، هو كائن نموذجا لا تقدر بثمن لدراسة الجهاز تجديد 10/08 وديه القدرة على تقديم رؤى قوية في طلبات الحصول على هندسة إصلاح كلى الانسان. وقد تبين التحوير 11 لتسمية مجموعة من الخلايا كليون السلف في الكلى الزرد الكبار 12، ولكن آليات السيطرة على رد lhx1a + الخلايا لإصابة ص: تيراغرام (EGFP Lhx1a)emain غير واضح.
وجنتاميسين أمينوغليكوزيد هو مضاد حيوي يستخدم على نطاق واسع مع الآثار المعروفة كلى والسامة في البشر 13. حقن داخل الصفاق من الجنتاميسين هو طريقة المتبعة في إحداث إصابات الكلى الحادة في الأسماك 6. هذه الاصابة في يحاكي الأسماك فقدان خلايا الطلائية وتندب من الكبيبات التي تحدث في البشر بعد جنتاميسين جرعة زائدة من 14. حمل إصابة في الزرد عن طريق الحقن الجنتاميسين هو وسيلة مريحة للحمل لذلك، متزامن استجابة قوية تجديد، مع العديد من النيفرون الجديدة المنتجة والشروع في وقت واحد من خلال مراحل تشكيل وانتشار والتمايز.
هذا البروتوكول تفاصيل لدينا وسيلة لإصابة قوية وقابلة للتكرار في الزرد الكلى الكبار من خلال الاستفادة من عملية الفرز البصرية موسع للحد من القيم المتطرفة. علينا أن نستفيد من حقيقة أن إصابة مع الجنتاميسين يؤدي إلى موت الأنسجة الظهارية الكلى وشكلأيون من القوالب أنبوبي كلوي، والتي ثم تتراكم في الجماهير في القنوات الكلوة الجنينية الموسطة ومجرور. يتم تمرير هذه من الأسماك ويمكن ملاحظتها بالعين المجردة في الماء. وهذا يسمح لنا للكشف عن الأسماك مع إصابة غير قاتلة قوية، والتي يمكن بعد ذلك تجميعها لمزيد من التجارب. التقليل من أعداد الأسماك لم يصب أو الأسماك التي تموت قبل أن تصل إلى نقطة النهاية من التجربة يؤدي إلى أكثر اتساقا وكفاءة جمع البيانات وتحليلها. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك حاجة لأجهزة خاصة أو الكواشف، مما يجعل فعالية من حيث التكلفة هذه الطريقة ومناسبة للاستخدام في الأوساط الأكاديمية والتعليمية. باستخدام طريقة لدينا، ونحن هنا تظهر آثار زيادة جرعة جنتاميسين على تجديد الكلى، فضلا عن تأثير ارتفاع درجات الحرارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية مستشفى ماساتشوستس العام للاستخدام الحيواني في مجال البحوث.
1. إعداد المسبق
- تحديد عدد البالغين الزرد 6-12 شهرا لإصابة. خطة لتصيب 10-20٪ أكثر من الأسماك وستكون هناك حاجة. من أجل تقليل التباين والعمر استخدام مطابقة الأسماك الشقيق تربيتها معا في نفس الخزان بحيث تكون تقريبا بنفس الحجم ويكون التباين أقل الجيني. الأسماك الإناث هي أسهل بكثير لحقن بالمقارنة مع ذكور السمك، ويرجع ذلك إلى سعة أكبر من البطن. ومع ذلك، من الذكور والإناث تعطي نتائج مماثلة.
- عندما تفعل هذه التجربة للمرة الأولى، رسم منحنى الجرعة لتحديد الجرعة المناسبة جنتاميسين لسلالة معينة من الأسماك. اختبار كل دفعة جديدة من الجنتاميسين قبل استخدامها في التجارب منذ نقاء جنتاميسين يختلف من دفعة لدفعة واحدة. وينبغي تحديد الجرعة المناسبة من خلال تقييم expressiعلى علامات الإصابة مثل lhx1a. (انظر الشكل 1A - D).
- يعد حل الجنتاميسين. يمكن تخزين محلول المخزون الجنتاميسين في -20 ° C وإذابة لاستخدامها لاحقا. على سبيل المثال، للحصول على 80 ملغ / كغ جرعة (80 ملغ جنتاميسين / كجم من وزن الجسم) في سمكة وزنها 0.5 غرام، وإعداد 2 ملغ / مل الجنتاميسين في الفوسفات مخزنة المالحة كحل عمل مريحة. هذا يوفر 20 ميكرولتر من الجنتاميسين للحقن داخل الصفاق في الأسماك.
ملاحظة: بشكل عام، 80-120 ملغ / كغ تحقيق نتائج جيدة، ولكن جرعات منخفضة تصل إلى 40 ملغ / كغ قد يكون مناسبا. جنتاميسين كما يمكن شراؤها في حل للحد من التعرض للخطر لموظفي المختبر.
ملاحظة: جنتاميسين في الجرعات العالية يمكن أن تكون سامة. ارتداء قفازات وقناع عندما يزن مسحوق. - إعداد 100 مل من 0.016٪ من المياه تريكين عن التخدير الأسماك. إعداد الأسهم 25X من تريكين (4 جم / 1 L) الذائب في الماء المعقم milliQ التكيف مع درجة الحموضة 7 وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تمييع 4 ملتر في 100 مل من الماء الأسماك لتركيز العمل من 0.016٪.
ملاحظة: تريكين هو مخدر والجلد مهيجة، وارتداء القفازات عند التعامل مع. - جعل السمك مغرفة من نقل الماصة البلاستيكية عن طريق خفض لمبة في شكل مغرفة وقطع +2 فتحات في أسفل لتصريف المياه. المحاقن تحميل 1ML (مع 10 التدرج ميكرولتر) مع الحل الجنتاميسين استعداد وإرفاق G إبرة 30½. إزالة أي فقاعات الهواء. تحريف إبرة على حقنة للتأكد من أن الطرف الزاوية على الإبرة يواجه بعيدا وعلامات حقنة تواجه الأمام، ويمكن قراءتها. لحقن السيطرة، وإعداد المحاقن والإبر مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
- بإعداد جدول مع سطح نظيف أو وزن القارب وكذلك المناشف الورقية لتجفيف الأسماك والأسماك لعقد لحقن.
- إعداد الحاويات نصف لتر صغيرة فردية مع الأغطية لعقد الأسماك للحقن المراقبة آخر بين عشية وضحاها. شفافة أقفاص التزاوج بلاستيكية صغيرة مفيدة لهذا الغرض. هذهيجب أن الحاويات لا تكون بيضاء - من الناحية المثالية ينبغي أن يكون واضحا بحيث يلقي الظهارية البيضاء أبكاها الأسماك يمكن ملاحظة على مقاعد البدلاء الأسود أعلى. ملء كل حاوية مع أسماك المياه ما يكفي للأسماك تسبح بشكل مريح.
2. حقن داخل الصفاق من جنتاميسين
- تخدير الأسماك في 0.016٪ محلول تريكين في أسماك المياه. انتظر معدل التهوية الخيشومية لإبطاء وللأسماك للم تعد تستجيب للمس.
- تلقط الأسماك باستخدام مغرفة الأسماك، والانتقال من الرأس نحو الذيل من أجل تجنب إصابة الخياشيم أو الزعانف. ضع السمك على مناشف ورقية لامتصاص الماء الزائد من خلال تحويل سمكة خارج بلطف على جانبها والتخلص من الماء الزائد من المغرفة.
- تلقط الأسماك مرة أخرى ووضعه في وزن القوارب على نطاق وركزت وتزن السمكة. جولة لأقرب 0.25 غرام، وحساب كمية مناسبة من الجنتاميسين لحقن.
ملاحظة: للحصول على 0.5 غرام الأسماك استخدام حقن 20 ميكرولتر في 80 ملغ / كغ جرعة. - تلقط الأسماك مرة أخرى ووضعه على منشفة ورقية مطوية الجافة. إذا عن طريق الحقن باستخدام اليد اليمنى، مع الاستمرار على منشفة ورقية في اليد اليسرى ووضع رأس السمكة لافتا اليسار، مع البطن يمكن الوصول إليها بسهولة.
- عقد المحاقن مع إبرة في زاوية 45 درجة إلى جلد البطن، سابقة لمجرور. دفع الإبرة تحت الجلد مباشرة، ثم إنقاص زاوية وحرك إبرة إلى الأمام تحت الجلد، وتجنب الأعضاء الداخلية. كساد الغطاس كمية مناسبة، وقفة للتأكد من عدم السائل هو الخروج حول الإبرة، ثم سحب الإبرة. إذا عقد السمك ثابت هو المشكلة، المرفقين هدفين ضد الجذع لتحقيق الاستقرار لهم.
ملاحظة: ارتداء القفازات عند التعامل مع حل الجنتاميسين. - إسقاط كل السمك في وعاء على حدة. مراقبة الأسماك وضمان تعافيها من التخدير. حفاظ على الأسماك في 28.5 درجة مئوية خلال الليل.
ملاحظة: إذا لم الأسماك إحياء الفور، استخدم البلاستيك العابرةفر الماصة للري المياه عبر الخياشيم لإحيائه. - استخدام نفس الحقنة والإبرة عند حقن الأسماك متعددة مع نفس جرعة الجنتاميسين. التخلص من المحاقن المستخدمة والإبرة في وعاء واقية الأدوات الحادة المناسبة.
3. بعد الحقن مراقبة الإصابة
- في اليوم التالي (إصابة آخر 1 يوم)، ووضع الأسماك حقن في الحاوية الخاصة به على سطح الظلام. يجب أن يلقي البيضاء الأنسجة الظهارية الميتة تفرز عن طريق الأسماك أصيب تكون مرئية. (انظر الشكل 1E - H). إذا لم تكن هناك قوالب، سواء كانت الأسماك لم يصب بأذى من قبل حقن جنتاميسين (كانت إما جرعة منخفضة جدا، أو بعض من الجنتاميسين تسربت أثناء عملية الحقن) أو كان السمك بجروح بالغة مما أدى إلى انسداد كامل للالحالب ومجرور مع الأنسجة المنزوعة.
ملاحظة: إذا كان السمك غير قادرة على مسح يلقي من جسمها وسوف يموت عادة في غضون 2-3 أيام، وبالتالي فهي غير صالحة للاستعمال لفترة أطولالمقايسات. إذا لم يلقي مرئية، الموت ببطء السمك في الماء تريكين عن طريق غمر لمدة 10 دقيقة على الأقل بعد توقف حركة الخياشيم. - إذا يلقي الأنسجة البيضاء مرئية، تعيين الأسماك جانبا ومواصلة التحقق من الأسماك الأخرى. والجرعة المناسبة من الجنتاميسين يؤدي إلى 80-90٪ من الأسماك كونها صالحة للاستعمال. تجمع الأسماك الجرحى ومن ثم تقسيمها إلى مجموعات العلاج المختلفة إذا رغبت في ذلك.
4. رعاية استعادة السمك
- حفاظ على الأسماك في المياه النظيفة والبيئة غير مزدحم. والمياه القذرة والازدحام تؤدي إلى إصابات والموت غير مقصود. محاولة للحفاظ على ما لا يزيد عن 6 السمك / 500 مل من الماء الأسماك وتغيير المياه يوميا إن أمكن.
ملاحظة: هذا هو الحد الأدنى من حجم للحفاظ على الفضاء أو إذا أراد المحقق لإجراء التجارب باستخدام العلاجات باهظة الثمن. - لا إطعام السمك حتى 3 أيام بعد الإصابة. سوف يتعافى الأسماك لا تأكل في البداية، وسوف أي طعام في خزان تتحلل وتعزيز البكتيريا غرامowth. ابتداء من الساعة 3 أيام بعد الإصابة، وإطعام كمية صغيرة مرة في اليوم.
5. تحليل المصاب الكلى
- لالتهجين الموضعي لlhx1a التعبير مرنا في والكلى يمكن أن تحصد من الأسماك في timepoints المطلوب. الموت ببطء السمك في الماء تريكين على الجليد 10 دقيقة على الأقل حتى توقف حركة الخياشيم، ثم إزالة الرأس بشفرة حلاقة وفتح تجويف الجسم وإزالة الأعضاء الداخلية بالملقط.
- ترك الكلية في المكان (الجهاز المصطبغة تعلق على جدار الجسم الظهرية) وتحديد الأسماك في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. تشريح خارج الكلى 15 وتواصل مع مستوى التهجين في الموقع.
- لفترة وجيزة، وغسل الكلى في PBST (الفوسفات مخزنة المالحة 0.5٪ توين 20)، permeabilized مع بروتين K في PBST (10 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. آخر إصلاح مع 4٪ لامتصاص العرق، وغسلها مرة أخرى مع PBST.
- ثم قبل هجن الكلى بين عشية وضحاها في 68؛ ° C العازلة في التهجين (50٪ الفورماميد، 5X SSC، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، 500 ميكروغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال، 0.1٪ Tween20، ودرجة الحموضة 6.0).
- احتضان العينات مع digoxigenin المسمى التحقيق في المخزن التهجين، ثم يغسل لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما مع 100٪، 75٪، 50٪، 25٪ العازلة التهجين عند 68 ° C، ثم انتقل إلى درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين لمدة 30 دقيقة مع 2X SSC بنسبة 0.1٪ Tween20، ويغسل مرتين لمدة 30 دقيقة مع 0.2x SSC بنسبة 0.1٪ Tween20.
- تتوازن العينة 3X 5 دقائق في MAB (0.1 M حمض الماليك، 0.15 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وسدت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في MAB مع 10٪ مصل الماعز. ثم احتضان عينات بين عشية وضحاها في مكافحة digoxigenin-AP فاب 1: 5000 في MAB.
- غسل العينة 5X لمدة 1 ساعة في MAB، وتتوازن 3X لمدة 15 دقيقة في NTMT (0.1 M تريس pH9.5، 0.05 M MgCl 2، 0.01 M كلوريد الصوديوم، و 50 ميكرولتر Tween20).
- ثم علاج الكلى مع NBT / BCIP للكشف عن إشارة. إصلاح الكلى مع 4٪ لامتصاص العرق وحضنت في ثنائي ميثيل الفورماميد إلى ريمولقد الزائد NBT / BCIP، ابيض بين عشية وضحاها في الماء منزوع الأيونات. غسل الكلى ومن ثم تصوير في PBST مع 50٪ الجلسرين تحت ساترة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن التأكد من الإصابة جنتاميسين بصريا من قبل مراقبة يلقي الظهارية الكلوية في الماء (الشكل 1). استخدمت جرعات مختلفة من الجنتاميسين لإصابة البالغين wildtype TuAB الزرد، مما أدى إلى زيادة أعداد lhx1a + المجاميع الخلوية في الكلى تجديد (الشكل 1A - D). يمكن بسهولة أن ينظر يلقي البيضاء في الماء 1 يوم بعد الإصابة (الشكل 1E - H). وأسفرت جرعة منخفضة من الجنتاميسين في معظم الأسماك عدم وجود يلقي، في حين أسفرت جرعات أعلى في أكثر من 75٪ من الأسماك جود يلقي (الشكل 1I). في جميع الفئات، واختيار للأسماك مع يلقي أدى إلى متوسط ارتفاع مستوى الإصابة (الشكل 1J).
بعد تأكيد البصري للإصابة، والأسماك يمكن تجميعها ومن ثم تقسيمها إلى مجموعات المراقبة والعلاج للتجارب (الشكل 2). أصيب الزرد الكبار Wildtype TuAB مع 80ملغم / كغم من جرعة الجنتاميسين. يوم واحد بعد الإصابة، وقد تم اختيار السمك مع قوالب، تجميع ثم تنقسم إلى الصدمة الحرارية وتوجد مجموعات الصدمة الحرارية. تعرضت الأسماك صدمة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة بين عشية وضحاها وفترة الراحة 8 ساعة في 28.5 درجة مئوية في كل يوم. في 4 أيام و 7 أيام الأسماك إصابة آخر تم إصلاحها لجبل بأكمله في الموقع التهجين وتم تقييم مستوى الإصابة التي كتبها كثافة lhx1a + الركام. الصدمة الحرارية وحدها لا تنتج استجابة الإصابة (الشكل 2A، D)، ولكن الصدمة الحرارية يسرع الاستجابة في الأسماك الجرحى مقارنة مع أي ضوابط الصدمة الحرارية (الشكل 2B، C، G). قبل 7 أيام بعد الإصابة لم يعد هناك فرق كبير بين المجموعات المصابة (الشكل E، F، H).
<قوي الشكل> 1: التجديد في الاستجابة لإصابة الكلى الحادة الجنتاميسين هو الجرعة التي تعتمد (A - D) يمثل LHX 1 مرنا التعبير المجاميع الخلوية، التي هي الأسلاف نفرون جديدة. (A) 7 أيام بعد الحقن تحكم الملكية الفكرية، wildtype الزرد TuAB الكبار وعادة ما يكون 0-2 LHX 1A + المجاميع الخلوية في الكلى كله. (B - D) بعد 7 أيام حقن جنتاميسين عرض الأسماك العديد من LHX 1A + المجاميع الخلوية، مشيرا إلى استجابة قوية neonephrogenesis.This هو الجرعة التي تعتمد، مع تركيزات أعلى من الجنتاميسين مما أدى إلى مزيد LHX 1 على + المجموعات. (E - H) 1 يوم بعد حقن جنتاميسين، الأسماك تفرز يلقي البيضاء تتكون من الأنسجة الظهارية الميتة من الكليتين. (E) مجموعة من القوالب من ما مجموعه 12 السمك تبين متنوعةمن الأشكال والأحجام. لاحظ الفرق بين يلقي بيضاء تشير إلى إصابة مقارنة مع البرتقالي المحمر محلول ملحي هضمها الروبيان. (F - H) أمثلة من القوالب التي تم جمعها من الأسماك الفردية بعد 1 يوم الإصابة عن طريق السماح للماء في الخزان إلى تسوية، pipetting لالرواسب بها ومراقبة تحت المجهر. (F) الغائط مع عدم وجود قوالب، مشيرا إلى عدم وجود إصابات من الأسماك تعامل مع 40 ملغ / كغ جرعة. (G) متوسطة الحجم يلقي تشير إلى إصابة من الأسماك تعامل مع 60 ملغ / كغ جرعة. (H) يلقي أكبر مع الأنسجة المنزوعة إضافية تشير إلى إصابة من الأسماك تعامل مع 80 ملغ / كغ جرعة. (I) نسبة الأسماك أصيب يلقي يزداد بنسبة 60 ملغ / كغ و 80 ملغم / كغم. (J) بعد 7 أيام، حقن تمت معالجة الأسماك لجبل بأكمله في الموقع التهجين لتقييم الإصابة. احصي lhx1a + المجاميع في صورة واحدة 5X التي اتخذت في أوسع صوقد تم قياس كثافة كل منطقة الكلى والكلى باستخدام يماغيج. / مم 2 ويرد متوسط عدد المجاميع لكل جرعة. في كل حالة، كان السمك مع يلقي بمعدل أعلى من المجموعة الكلية في كل جرعة. ص <0.5 لمدة 40 ملغ / كغ مقارنة مع 80 ملغ / كغ. شريط النطاق في AD = 0.2 ملم، E = 1 ملم، FH = 2mm و.
وكان يتم تجميع الحرارة تجديد تعتمد 24 ساعة بعد الحقن الجنتاميسين، وأصيب wildtype TuAB الزرد الكبار مع قوالب ثم تنقسم إلى مجموعة الصدمة الحرارية وأي جماعة الصدمة الحرارية: الرقم 2. واستمرت الأسماك عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة بين عشية وضحاها كل ليلة بعد ذلك مع فترة راحة 8 ساعة في 28.5 درجة مئوية خلال كل يوم. (A، D) لم يصب مراقبة الأسماك لم يبد lhx1a بعد الصدمة الحرارية. (B، C) ش الحرارةاوك يسرع استجابة التجدد، مع المزيد من مجموعات تظهر بالفعل في 4 أيام بعد الإصابة مقارنة مع السمك المصاب دون الصدمة الحرارية (ص <0.5، اختبار t الطالب). (E، F) بعد 7 أيام، لا يوجد فرق كبير بين الأسماك أصيب تعامل مع الصدمة الحرارية وليس الصدمة الحرارية. (G، H) الكمي للإصابة عن طريق عد lhx1a + المجاميع في مم 2. كل نقطة تمثل الأسماك الفردية. عدد من الأسماك ومتوسط استجابة يشار إلى أعلى كل مجموعة. شريط النطاق = 0.2 مم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الزرد مثالية لدراسة تجديد أجهزة الكبار بما في ذلك الكبار الكلى وولفي 6. وقد اتخذت الدراسات الحديثة الاستفادة من الواسمات الجزيئية وخطوط مراسل المعدلة وراثيا جديدة لتوصيف أفضل الخطوات التي تحدث أثناء كليون تجديد الخلايا وما قد تكون مسؤولة 7،12. وقد استخدم مراقبة يلقي البولية لأكثر من قرن لتشخيص أمراض الكلى لدى البشر 16. نحن هنا استخدام جود يلقي كمؤشر سهلة، وموسع في وقت مبكر من مدى إصابة الكلى الحادة بعد الحقن الجنتاميسين. نلاحظ أن الأسماك التي لا تنتج إما يصابون يلقي أقل ما يقال فقط (وليس تشكيل النيفرون جديدة) أو المصابين جدا للتعافي، وعادة ما يموت في غضون 3 أيام الأولى. ولذلك، فإن الخطوة الحاسمة في البروتوكول هو الملاحظة الفردية من الأسماك بعد الإصابة، ووجود البول يلقي كمؤشر على مستويات الإصابة المناسبة. ونحن نرى أيضا lhx1a التعبيرفي المجاميع ابتداء من يوم 4 بعد الاصابة. هذا يدل على أن أيام 3 الأولى بعد الإصابة هي فترة حاسمة لتحقيق الانتعاش.
إذا كان عدد كبير من الأسماك ولم يصب، أو الكثير من الأسماك يموتون أثناء التجربة، تحقق للتأكد من أن الحقن داخل الصفاق يجري القيام به بشكل صحيح. فإنه قد يساعد على إضافة صبغة غير سامة مثل الفينول الأحمر إلى حل الجنتاميسين لتصور أي تسرب أثناء الحقن. يمكن وضع علامات الإبرة مع علامة دائمة أو قطعة من الشريط 2 ملم من طرف بمثابة دليل لمنع دفع الإبرة بعيدا جدا في السمك. بالإضافة إلى ذلك، قد تحتاج جرعة الجنتاميسين لتعديلها. حقن السمك مع مجموعة من جرعات جنتاميسين واختبار الكلى للتعبير عن lhx1a مرنا إما عن طريق التهجين الموضعي أو الكمي RT-PCR في.
وجود قيود على هذا الأسلوب هو أنه يتطلب السكن الأسماك الفردية بين عشية وضحاها قبل اختيار إصابة الأسماك لالتجريب. للتحقيق في الأحداث في وقت مبكر جدا في تجديد (داخل ساعة 24 الأولى بعد الإصابة) الأسماك قد تحتاج إلى الخضوع لعلاج تجريبي مستمرة، حتى خلال فترة المراقبة الفردية. تكاليف علاج الأسماك الفردية مع المخدرات، وعلى سبيل المثال، قد تكون مرتفعة جدا. أسلوبنا هو تحسنا على طريقة القائمة للإصابة الكلى الحاد باستخدام الجنتاميسين، لأنه يسمح للباحث للقضاء على القيم المتطرفة من خلال الاستفادة من عملية الفرز البصرية موسع. ويمكن الآن هذا النموذج قوية، موحدة وقابلة للتكرار الإصابة استخدامها لاختبار فعالية فرضيات حول تجديد الكلى في الزرد الكبار.
لاحظنا أنه على الرغم من تجديد يحدث في كل من الزرد الذكور والإناث (جميع البيانات المعروضة هنا هي من الإناث)، وتجديد ردا على حقن جنتاميسين في الذكور أكثر من ذلك بكثير متغير. قد يكون هذا يرجع إلى أسباب فنية، لأن أجسامهم طويلة، رقيقة وأكثر من العضلات، في حين أن الإناث لديها ب أكبر من ذلك بكثيراللي مع مرونة، أرق الجلد، مما يسهل حقن والتجويف البريتوني أكبر لاستيعاب كميات الحقن دون تسرب. وإمكانية بديلة هي أن الأندروجينات التي تنتجها الذكور قد يكون له بعض التأثير على عملية تجديد 17. Nachtrab آخرون وجد أن تأثير الاندروجين كان سلالة تعتمد، مما يدل على أن الخلفية الوراثية قد تعدل مستويات الاندروجين. اختلافات طفيفة في الخلفية الوراثية للأسماك TuAB المستخدمة في دراستنا قد يفسر التباين ينظر في الذكور، ولكن يفترض الأندروجينات ليست هي المصدر الوحيد للاختلاف وغيرها من المواضع الجينية قد تسهم في عدم التجانس في الاستجابة لإصابة. لقد وجدنا أيضا أن خطوط المعدلة وراثيا مختلفة من الزرد قد يستجيبون بشكل مختلف للإصابة جنتاميسين. على سبيل المثال، تيراغرام (Lhx1a: GFP) 12 خط في أيدينا يتطلب 120 ملغ / كغ لتحريض الفعال للإصابة (لا تظهر البيانات). هذه الملاحظات تسلط الضوء على أهمية استخدام السيب من نفس الجنسلينغ يتحكم في الدراسات الإصابة للحد من تقلب التجريبية.
العديد من خطوط المعدلة وراثيا الزرد تستخدم المروج حساس الصدمة الحرارية كوسيلة للحث على التعبير عن التحوير. منذ الزرد ومتغير الحرارة وعدم تنظيم درجة حرارة الجسم، فإنهم يضطرون لأداء وظائف فسيولوجية في درجة حرارة البيئة المحيطة بهم. في سياق التجارب باستخدام المروج HSP70 للتعبير عن الجينات المحورة المهيمنة لتعديل استجابة التجدد، ونحن بشكل غير متوقع لوحظ أن استجابة التجدد وقد تسارعت بسبب ارتفاع درجة الحرارة. لذلك، وتحديد تأثير درجة الحرارة على استجابة التجدد في نظام معين يصبح حاسما في التخطيط لتوقيت التجارب (التقاط ذروة استجابة التجدد على سبيل المثال)، ويجعل المقارنة إلى تجديد في درجات الحرارة العادية إشكالية. نظم محرض الأخرى التي تستخدم على سبيل المثال CreERT وتاموكسيفين لالتحوير الاستقراء قد يكون ر أكثر ملاءمةدراسات س التجديد الكلى للبالغين. وبالمثل، طرق الوراثية أحدث من الإصابة الحث مثل تفعيل CreERT من الجينات المحورة السامة أو الإصابة محرض باستخدام بكتيريا nitroreductase / ميترونيدازول 18،19 سيوسع نطاق التجارب الممكنة من أجل فهم أفضل neonephrogenesis وتجديد الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
