Introduction
肾脏是流体平衡，血压调节和过滤废物从体内必需的。虽然哺乳动物可以利用受伤分化的上皮细胞后1-4修复肾单位存在，他们似乎缺乏保留的干细胞5的游泳池，并不能形成新的肾单位从头 。在对比哺乳动物，成鱼能够形成整个成年生活新肾支持鱼的生长，并且响应于损伤6,7。斑马鱼， 斑马鱼 ，是一种宝贵的模式生物器官再生8-10的研究，并有可能提供强大的洞察到应用程序中来改造人类的肾脏的修复。 的Tg（Lhx1a：EGFP）转基因11已经显示然而标记肾祖细胞的池，在成年斑马鱼肾12，控制lhx1a的响应+细胞损伤ř机制emain不清楚。
氨基糖甙类的庆大霉素是一种广泛使用抗生素与人类已知的13和肾耳毒性作用。腹腔注射庆大霉素是一家成立于鱼6诱发急性肾损伤的方法。这种损伤的鱼模仿的肾小管上皮细胞，而发生在人类过量服用庆大霉素后14肾小球疤痕的损失。斑马鱼中的庆大霉素注射诱导损伤是引起强烈的，同步再生反应，产生了许多新的肾单位，同时继续通过形成，增殖和分化阶段的便捷方式。
该协议通过利用无创可视化的筛选过程中尽量减少离群点细节我们的方法可再生的损伤的成年斑马鱼肾脏。我们注意到，与庆大霉素损伤导致的肾上皮组织和格式死亡的事实优势离子肾小管演员，然后积聚成群众中肾管和泄殖腔。这些是由鱼传递，并且可以在水目视观察。这使我们能够对鱼类具有较强的非致命伤害，然后可以为汇集进一步的实验筛选。最小化的未受伤的鱼或鱼，才到达实验的终点导致更均匀和高效的数据收集和分析该模具的数量。此外，没有任何特殊的设备或试剂要求，使得这种方法具有成本效益，并适用于在学术或教学环境中使用。使用我们的方法，在这里，我们表明肾再生庆大霉素剂量的增加效果以及增加温度的作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：伦理学声明：所有实验均按照用于研究使用动物马萨诸塞州总医院的指导方针进行。
1.事前准备
- 确定有多少成年斑马鱼6-12个月大的伤害。计划伤害10-20％以上的鱼比是必要的。为了尽量减少可变性，使用年龄匹配的同胞的鱼饲养在同一个罐，使它们大致相同的尺寸，并具有更少的遗传变异。母鱼更容易注入相比公鱼，由于腹部的更大的容量。但是，男性和女性给予了类似的结果。
- 当做实验首次，绘制剂量曲线，以确定适当庆大霉素剂量为鱼的特定菌株。在实验中使用之前测试每一批新的庆大霉素庆大霉素以来的纯度一批不同于一批。适当的剂量应通过评估expressi确定上的损伤标记物如lhx1a。 （参见图1A - D）。
- 准备庆大霉素解决方案。庆大霉素原液可被存储在-20℃，解冻后使用。例如，对于一个80毫克/公斤的剂量（80毫克庆大霉素/ kg体重的）在一个鱼体重0.5克，制备庆大霉素2毫克/毫升在磷酸盐缓冲盐水作为一种方便的工作溶液。这提供了一个20微升庆大霉素为腹腔注射成鱼。
注：在一般情况下，80-120毫克/千克取得良好的效果，但剂量低至40毫克/公斤，可适当。庆大霉素也可在溶液中购买，以尽量减少有害暴露于实验室人员。
注：庆大霉素高剂量可能是有毒的。戴上手套，重粉面膜的时候。 - 制备100毫升0.016％三卡因水用于麻醉鱼。制备一个25倍的库存三卡因（4克/ 1L）溶于无菌milliQ水中的调节至pH 7，并储存在4℃直至使用。淡化4米升在100毫升鱼水的0.016％工作浓度。
注：三卡因是一种麻醉剂和皮肤有刺激性，搬运时戴上手套。 - 做鱼舀出塑料移液管的切割灯泡成勺形和切割2槽底部排水。负载1毫升注射器（带10微升等级）与庆大霉素准备解决方案，并附加一个30½摹针。去除气泡。拧上的注射器针头，以确保在针的斜角尖背向和针筒标记是朝前和可读性。对于控制注射，准备一个注射器和针头用无菌PBS。
- 准备一个规模用干净的表面或船的重量，以及纸巾晒鱼和鱼保持注射。
- 准备个人的小半升有盖的容器举行的鱼一夜之间观察注射后。小透明塑料笼交配是用于此目的的。这些容器不应白色 - 理想，他们应该清楚，这样的鱼棚白色上皮管型在黑色的台面进行观察。填写每个容器有足够的鱼水的鱼游泳舒适。
庆大霉素2.腹腔注射
- 在麻醉鱼水0.016％三卡因溶液的鱼。等待鳃通风量，以减缓和鱼不再响应触摸。
- 舀起使用鱼舀鱼，从头部向尾部，以避免伤及鳃鳍或移动。放在纸巾鱼通过在其一侧轻轻转动捞出来吸收过量的水，从勺甩掉多余的水份。
- 再舀上来的鱼，并把它在权衡船在归零规模和权衡鱼。一轮以最接近0.25克，并计算庆大霉素注射适量。
注：0.5g的鱼用20微升注射80毫克/公斤的剂量。 - 再舀上来的鱼，并把它放在一个干燥的折叠纸巾。如果用右手注入，按住纸巾在左手，并把鱼的头指向左边，用肚皮方便。
- 握住针注射器以45°角，腹部皮肤，先于泄殖腔。按刚下皮肤进针，然后下降的角度和向前滑动针在皮肤下，避免内脏。压低柱塞适量，暂停，以确保没有液体出来时分针，然后拔出针头。如果拿着鱼稳定是一个问题，对躯干肘部支撑，以稳定他们。
注：当处理庆大霉素溶液戴上手套。 - 每条鱼落入一个单独的容器中。观察鱼，并保证从麻醉中复苏。保持鱼在28.5℃下过夜。
注：如果鱼没有立即恢复，使用反胶FER吸管灌溉水在其鳃来恢复它。 - 当用相同剂量庆大霉素注入多个鱼使用相同的注射器和针头。处理用过的注射器和针头插入相应的生物危害锐器容器。
损伤3.注射后观察
- 第二天（1天伤后），放置在其容器注入的鱼放在一个黑暗的表面。死亡的上皮组织中受伤的鱼排出的白色塑像应该是可见的。 （参见图1E - H）。如果没有管型，无论是鱼由庆大霉素注射没有受伤（或者剂量太低，或者一些在注射过程中泄漏的庆大霉素）或鱼严重受伤导致输尿管和泄殖腔的完全阻断与脱落的组织。
注：如果鱼是无法清除其体内的塑像它通常会在2-3天内死亡，因此不能用于再测定。如果没有强制转换是可见的，通过浸渍至少10分钟鳃运动停止后安乐死在三卡因水中的鱼。 - 如果白石膏组织可见，抛开鱼并继续检查其他鱼类。庆大霉素的适当的剂量将导致鱼是可用的80-90％。池鱼受伤，然后将它们如果需要分成不同的治疗组。
4.护理恢复的鱼
- 保持鱼在清水和拥挤的环境。脏水和拥挤会导致感染和意外死亡。如果可能，尝试每天保持不超过6尾/500毫升鱼水和换水。
注意：这是一个最小的体积为节约空间或如果研究者希望执行使用昂贵的药物治疗实验。 - 不要喂的鱼，直到后3天的伤害。恢复鱼不会吃第一，并在坦克任何食品会发生分解，并促进细菌克owth。第3天开始伤后，每天喂一次少量。
肾脏损伤5.分析
- 对于为 lhx1a表达原位杂交，肾脏可以从鱼都收获希望的时间点。冰在三卡因水中鱼实施安乐死，至少10分钟，直至鳃运动停止，然后取出头用刀片并打开体腔，并用钳子取出内脏。
- 留在原地（贴在背体壁色素器官），肾和PBS固定在4％多聚甲醛鱼过夜。解剖出肾15并继续原位杂交标准。
- 简要地说，洗净肾脏在PBST（磷酸盐缓冲盐水0.5％吐温20），进行1小时，在室温下透化用蛋白酶K在PBST（10微克/毫升）。用4％多聚甲醛后固定，并用PBST再洗涤。
- 然后预杂交肾脏过夜68;℃下在杂交缓冲液（50％甲酰胺，5×SSC，50微克/毫升肝素，500微克/毫升的tRNA，0.1％吐温20，pH 6.0）中。
- 孵育在杂交缓冲液中地高辛标记探针的样品中，然后再洗涤5-10分钟每次用100％，75％，50％，25％，杂交缓冲液在68℃，然后转移到室温，并清洗两次，每次30分钟，用2×SSC，0.1％吐温20，和清洗两次，每次30分钟，用0.2×SSC，0.1％吐温20。
- 平衡样品3×5分钟，在生物圈（0.1M马来酸，0.15M氯化钠，pH值7.5）和封闭过夜，在4℃在生物圈用10％山羊血清。然后孵育样本过夜抗地高辛-AP的Fab 1：5000人与生物圈。
- 洗样品5倍1小时的人与生物圈计划，并平衡3倍于NTMT 15分钟（0.1米的Tris pH9.5，0.05M的氯化镁 ，0.01 M氯化钠，50微升吐温20）。
- 然后对待NBT / BCIP肾脏检测信号。固定用4％多聚甲醛的肾脏并孵育在二甲基甲酰胺字符型数据已经超额NBT / BCIP，在去离子水中漂白过夜。洗肾脏，然后拍摄在PBST中与下一个盖玻片50％甘油。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
庆大霉素损伤可目视由肾上皮管型的观察中的水（ 图1）的确认。庆大霉素不同剂量被用来伤害野生成年斑马鱼TuAB，导致在增加再生肾脏lhx1a +细胞聚集（ 图1A - D）的数字。白石膏可以很容易地看出，在水下1伤天之后（ 图1E - H）。庆大霉素低剂量导致不具有强制类型转换大多数鱼，而高剂量导致了鱼类有管型（ 图1I）的75％。在所有组中，选择用于鱼与石膏导致更高的平均损伤水平（ 图1J）。
损伤的可视确认后，鱼可以合并，然后分成对照组和治疗组进行实验（ 图2）。野生型TuAB成年斑马鱼受伤与80毫克/公斤剂量的庆大霉素。受伤后的一天，鱼石膏像被选中，汇集，然后分成热休克和无热休克组。热休克鱼暴露于37℃16小时过夜，并在每天28.5℃的8小时的休息时间。在第4天和7天后伤鱼原位杂交固定整装和伤害水平进行lhx1a +聚集的密度进行评估。热休克单独不会产生损伤反应（ 图2A中的D），但热休克加速相比，没有热休克对照（ 图2B，C，G）在受伤鱼的响应。 7天伤后不再有受伤的群体（ 图E，F，H）之间的差异显著。
<STRONG>图1：庆大霉素回应急性肾损伤再生是剂量依赖性的（A - D）LHX 1 mRNA的表达标志着细胞聚集，这是新的肾单位祖细胞。 （ 一 ）控制腹腔注射，野生型TuAB成年斑马鱼后第7天，通常有0-2 LHX 1A +在整个肾脏细胞聚集。 （B - D）的庆大霉素注射鱼显示许多LHX 1a中 +细胞聚集后7天，这表明强大的neonephrogenesis.This响应是剂量依赖性的，具有较高的庆大霉素浓度导致更LHX 1 +簇。 （E - 高）1庆大霉素注射后的一天，鱼排泄白石膏组成从肾脏死亡的上皮组织。 （ 五）强制转换的共有12鱼类展示各种集合的形状和大小。注意白石膏指示损伤相比红橙色消化卤虫之间的差异。 （F - 高）通过使水箱中的水沉降，吹打沉淀出来，并在显微镜下观察1天损伤后从鱼个体收集管型的例子。 （F）与粪便不蒙上，表示没有从与40毫克/公斤剂量治疗的鱼体受伤。 （G）中等规模蒙上表示从与60毫克/公斤剂量治疗的鱼体受伤。 （H）放大铸件附加脱落组织表示从与80毫克/公斤剂量治疗的鱼体受伤。 （Ⅰ）受伤的鱼与石膏的比例增加，在60毫克/公斤和80毫克/公斤。 （J）的 7天后，注射鱼原位杂交处理以整装评估损伤。lhx1a +聚集在在最宽婆截取的单个5×图像进行计数每个肾脏和肾区INT被使用ImageJ测量。聚集体的平均数目/ mm 2的示出了用于每个剂量。在每一种情况下，鱼用石膏有较高的平均比在各剂量的总基。 P <0.5 40毫克/千克相比80毫克/公斤。比例尺在AD = 0.2毫米，E = 1毫米，FH =2毫米。
图2：温度依赖再生庆大霉素注射后24小时，受伤的野生型TuAB成年斑马鱼与石膏像被合并，然后分成热休克组和无热休克组。在每天的鱼均保持在每晚上之后用8小时的休息期间37℃下16小时过夜28.5℃。 （A，D）控制未受伤的鱼不表达热休克后lhx1a。 （B，C）SH热玉珠加速再生反应，具有多个聚类已经出现在损伤后4天相比没有热休克受伤鱼（对<0.5，学生t检验）。 （E，F）经过7天 ，有热休克和无热休克治疗受伤的鱼之间没有显著差异。受伤的每平方毫米计算lhx1a +骨料（G，H）定量。每个点代表一个单独的鱼。鱼和平均响应数来表示每组的上方。比例尺= 0.2毫米。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
斑马鱼是理想的学习成人器官再生包括成人中肾肾脏6。最近的研究已经利用分子标记技术和转基因新记者行更好地表征在肾再生发生的步骤，哪些细胞可能是负责7,12。尿管型的观察已使用了一个多世纪来诊断肾脏疾病在人类16。在这里，我们使用管型的存在，作为庆大霉素注射后一种简单，非侵入性的和早期指标的急性肾损伤的程度。我们观察到的鱼，不产生强制类型转换要么只是轻度受伤（和不形成新的肾单位）或过受伤的复苏，通常在第3天死亡。因此，在协议中的一个关键步骤是损伤后的个别观察鱼，和尿的存在蒙上得当损伤水平的指标。我们也看到lhx1a表达在开始聚集在4天伤后。这表明，伤后第3天是恢复的关键时期。
如果大量的鱼是没有受伤，或者太多的鱼在实验过程中奄奄一息，检查，以确保腹腔注射正在处理得当。它可能有助于诸如酚红添加无毒染料的庆大霉素溶液形象化注射过程中的任何泄漏。标记用永久性标记或一块带2毫米的针尖的针可以作为导向，以防止推针太远成鱼。此外，庆大霉素的剂量可能需要调整。与一系列庆大霉素剂量注入鱼和原位杂交或定量RT-PCR或者通过测试肾脏为lhx1a mRNA的表达。
这种技术的局限性在于它需要个人的房屋一夜之间鱼的选择鱼受伤前实验。探讨再生很早事件（第24小时内后受伤）的鱼可能需要经历连续的实验性治疗，甚至在个别的观察期。一种治疗个体的鱼用药物的成本，例如，可以是非常高的。我们的技术是对使用庆大霉素急性肾损伤的现有方法的改进，因为它允许研究者通过利用非侵入性的视觉筛选过程，以消除异常值。这一功能强大的，统一的和可重复的损伤模型，现在可以用来有效地检验关于肾再生的成年斑马鱼的假设。
我们观察到，尽管再生发生在雄性和雌性斑马鱼（此处所示的所有数据都从女性），再生响应于庆大霉素注射在男性是更加可变。这可能是由于技术上的原因，因为他们的身体是长的，薄的和更肌肉，而女性有一个更大一些的B伊丽与宽松，皮肤较薄，允许更容易注入和较大的腹膜腔，以容纳进样体积而不漏。另一种可能性是，由男性产生雄激素可能对再生过程17有一定的影响。 Nachtrab 等人发现，雄激素的作用是应变依赖性的，这表明遗传背景可能调节雄激素的水平。在我们的研究中使用的TuAB鱼遗传背景的微小变化可能解释见于男性的变异性，但据推测雄激素不变化和其它遗传位点的可在响应损伤有助于异质的唯一来源。我们还发现，斑马鱼的不同转基因系可以庆大霉素损伤有不同的反应。例如，所述的Tg（Lhx1a：GFP）的 12线在我们手中，需要用于有效诱导损伤的120毫克/千克（数据未显示）。这些意见强调通过同性同胞的重要性在林志玲受伤控制的研究，以尽量减少实验变异。
许多转基因斑马鱼线使用的热冲击敏感的启动子作为一种手段来诱导转基因的表达。由于斑马鱼是变温，不调节自己的体温，他们被迫在他们的环境温度下进行生理功能。在使用HSP70启动子表达转基因显性调节再生响应实验的背景下，我们意外地发现，再生反应是较高的温度加速。因此，确定在一个给定系统中的再生反应温度的效果变得至关重要规划的实验的定时（捕获例如再生响应的峰值），并使得比较来再生在常温下有问题的。使用例如CreERT和他莫昔芬对转基因诱导其它诱导型系统可能更适合吨成人肾再生Ø研究。同样，损伤诱发的使用细菌硝基还原酶/甲硝唑18,19将扩大实验可能的范围内新的遗传方法，如CreERT激活有毒的转基因诱导或损伤，以更好地理解neonephrogenesis和肾脏再生。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
