Introduction
Le rein est essentiel pour l'homéostasie du fluide, la régulation de la pression artérielle et la filtration des déchets de l'organisme. Bien que les mammifères sont capables de réparer néphrons existantes après une blessure en utilisant des cellules épithéliales différenciées 1-4, ils semblent manquer d'un pool de cellules souches réservés 5 et sont incapables de former de nouveaux néphrons de novo. Contrairement aux mammifères, les poissons adultes sont capables de former de nouveaux néphrons long de la vie adulte pour soutenir la croissance des poissons et en réponse à une blessure 6,7. Le poisson zèbre, Danio rerio, est un organisme modèle inestimable pour l'étude de la régénération d'organes 8-10 et a le potentiel de fournir un aperçu puissants dans les applications pour l'ingénierie de la réparation des reins humains. La Tg (Lhx1a: EGFP) 11 transgène a été montré pour étiqueter un pool de cellules progénitrices néphron dans le rein adulte de poisson zèbre 12, cependant mécanismes contrôlant la réponse des cellules à lhx1a + r blessureEmain claire.
La gentamicine est un antibiotique aminoglycoside largement utilisé avec des effets néphrotoxiques et ototoxiques connus chez l'homme 13. L'injection intrapéritonéale de la gentamicine est une méthode établie d'induire lésion rénale aiguë chez les poissons 6. Cette blessure dans les synoptiques de poissons de la perte de l'épithélium tubulaire et la cicatrisation des glomérules qui se produit chez l'homme après la gentamicine 14 surdosage. Induire des blessures chez le poisson zèbre par injection de gentamicine est un moyen pratique d'induire une réponse forte de régénération, synchrone, avec de nombreux nouveaux produits et néphrons procéder simultanément à travers les étapes de la formation, de la prolifération et de la différenciation.
Ce protocole détaille notre méthode de blessure robuste et reproductible chez l'adulte poisson zèbre rein en utilisant un processus visuel non invasif de dépistage pour réduire au minimum les valeurs aberrantes. Nous profitons du fait que des blessures avec la gentamicine conduit à la mort du tissu rénal épithéliale et le formation de moulages tubulaires rénales, qui accumulent alors en masses dans les conduits et mésonéphriques cloaque. Ceux-ci sont transmises par les poissons et peuvent être observés visuellement dans l'eau. Cela nous permet de l'écran pour le poisson avec une forte blessure non mortelle, qui peut ensuite être mis en commun pour plus d'expérimentation. Minimiser le nombre de poissons indemne ou poissons qui meurent avant d'atteindre le critère d'évaluation de l'expérience conduit à plus uniforme et la collecte de données et une analyse efficaces. En outre, aucun des dispositifs spéciaux ou de réactifs sont nécessaires, ce qui rend cette méthode rentable et appropriée pour une utilisation dans un cadre universitaire ou de l'enseignement. Grâce à notre méthode, nous montrons ici les effets croissants de dose de gentamicine sur régénération rénale ainsi que l'effet de l'augmentation de la température.
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Protocol
Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices de l'Hôpital général du Massachusetts pour l'utilisation des animaux dans la recherche.
1. Préparation à l'avance
- Déterminer combien de poisson zèbre adulte 6-12 mois de blesser. Régime de blesser 10-20% plus de poissons que sera nécessaire. Afin de minimiser la variabilité, l'utilisation appariés pour l'âge des poissons frère élevés ensemble dans le même réservoir de sorte qu'ils sont à peu près la même taille et ont moins de variabilité génétique. Poissons femelles sont beaucoup plus faciles à injecter par rapport au poisson mâle, en raison de la plus grande capacité de l'abdomen. Cependant, les mâles et les femelles donnent des résultats similaires.
- Quand vous faites l'expérience pour la première fois, tracer une courbe de dose pour déterminer le dosage approprié pour la gentamicine une souche spécifique de poissons. Testez chaque nouveau lot de gentamicine avant utilisation dans des expériences depuis la pureté de la gentamicine varie d'un lot à. Un dosage correct devrait être déterminée en évaluant expressisur des marqueurs de préjudice tels que lhx1a. (Voir Figure 1A - D).
- Préparer la solution de gentamicine. Solution stock gentamicine peut être stocké dans -20 ° C et décongelé pour un usage ultérieur. Par exemple, pour une dose de 80 mg / kg (80 mg de gentamicine / kg de poids corporel) dans un poisson pesant 0,5 g, préparer 2 mg / ml de gentamicine dans du sérum physiologique tamponné avec un phosphate en tant que solution de travail pratique. Ceci permet d'obtenir une 20 ul de gentamicine pour injection intra-péritonéale dans le poisson.
NOTE: En général, 80 à 120 mg / kg obtenir de bons résultats, mais des doses aussi faibles que 40 mg / kg peut être appropriée. Gentamicine peut également être acheté dans une solution pour minimiser l'exposition dangereux pour le personnel de laboratoire.
NOTE: gentamicine à fortes doses peut être toxique. Portez des gants et un masque lors de la pesée de poudre. - Préparez 100 ml de 0,016% d'eau de tricaïne pour anesthésier les poissons. Préparer un 25x bilan de tricaïne (4 g / 1 L) dissous dans de l'eau milliQ stérile ajuster le pH à 7 et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. Diluer 4 ml dans 100 ml d'eau du poisson pour une concentration de travail de 0,016%.
NOTE: tricaïne est un anesthésique et la peau irritant, porter des gants lors de la manipulation. - Faire un poisson évider d'une pipette de transfert en plastique en coupant la poire en forme de cuillère et couper 2 fentes dans le fond pour drainer l'eau. Seringues charge de 1 ml (avec 10 gradations pi) avec la solution de gentamicine prêts et attachent une aiguille 30½ G. Retirer les bulles d'air. Twist l'aiguille sur la seringue pour vous assurer que la pointe est inclinée sur l'aiguille est confrontée suite et les graduations de la seringue sont tourné vers l'avant et lisible. Pour les injections de contrôle, préparer une seringue et une aiguille avec du PBS stérile.
- Préparer une échelle avec une surface propre ou peser bateau ainsi que des serviettes en papier pour sécher le poisson et pour la tenue de poissons pour l'injection.
- Préparer des petits contenants individuels demi-litre avec des couvercles pour la tenue de poissons pour l'injection du poste d'observation pendant la nuit. Les petites cages transparentes en matière plastique d'accouplement sont utiles à cet effet. Cesrécipients ne doit pas être blanc - idéalement, ils devraient être claires afin que les moulages blancs épithéliales versées par les poissons peuvent être observés sur une paillasse noire. Remplir chaque récipient avec de l'eau de poissons suffisant pour le poisson à nager confortablement.
2. injection intrapéritonéale de gentamicine
- Anesthésier le poisson dans une solution de tricaïne 0,016% dans l'eau du poisson. Attendez que le taux de ventilation des branchies à ralentir et que le poisson ne plus répondre au toucher.
- Ramasser le poisson en utilisant le scoop de poisson, le déplacement de la tête vers la queue afin d'éviter de blesser les branchies ou les nageoires. Placez le poisson sur des serviettes en papier pour absorber l'excès d'eau en tournant le poisson doucement sur le côté et secouer l'excès d'eau scoop.
- Ramasser le poisson à nouveau et le placer dans le bateau peser sur l'échelle mise à zéro et peser le poisson. Ronde à l'0,25 g près, et de calculer la quantité appropriée de la gentamicine à injecter.
NOTE: Pour un poisson de 0,5 g utiliser une injection de 20 pi à 80 mg / kg dose. - Ramasser le poisson à nouveau et le placer sur une serviette en papier pliée sec. Si l'injection de la main droite, maintenez la serviette en papier dans la main gauche et placez la tête du poisson pointant vers la gauche, avec le ventre facilement accessible.
- Tenez la seringue avec l'aiguille à un angle à la peau du ventre, antérieure à l'cloaque 45 °. Enfoncez l'aiguille juste sous la peau, puis diminuer l'angle et faites glisser l'aiguille de l'avant sous la peau, en évitant les organes internes. Appuyez sur le piston de la quantité appropriée, une pause pour faire en sorte qu'aucun liquide ne sort autour de l'aiguille, puis retirer l'aiguille. Si la tenue régulière le poisson est un problème, bretelles coudes contre votre buste pour les stabiliser.
NOTE: Porter des gants lors de la manipulation solution de gentamicine. - Déposez chaque poisson dans un conteneur individuel. Observer les poissons et assurer sa récupération de l'anesthésie. Gardez poissons à 28,5 ° C pendant la nuit.
NOTE: Si le poisson ne rétablit pas immédiatement, utiliser un plastique transfer pipette pour irriguer l'eau à travers ses branchies pour la faire revivre. - Utilisez la même seringue et l'aiguille lors de l'injection multiple poisson avec la même dose de gentamicine. Jetez la seringue et l'aiguille dans le container approprié approprié.
3. Poster Injection Observation des blessures
- Le lendemain (blessure de poste 1 jour), placer le poisson injecté dans son conteneur sur une surface sombre. Moulages blancs de morts tissu épithélial excrété par les poissons blessés doivent être visibles. (Voir la figure 1E - H). Si il n'y a pas des moulages, soit le poisson n'a pas été blessé par l'injection de gentamicine (soit la dose était trop faible, ou une partie de la gentamicine fuite pendant le processus d'injection) ou le poisson a été grièvement blessé entraînant un blocage complet des uretères et cloaque avec le tissu muées.
NOTE: Si le poisson est incapable de dégager les moulages de son corps, il meurent habituellement dans les 2-3 jours et est donc inutilisable pour plusdosages. Si aucun moulages sont visibles, euthanasier les poissons dans l'eau de tricaïne par immersion pendant au moins 10 min après le mouvement des branchies arrête. - Si moulages de tissus blancs sont visibles, mis le poisson de côté et continuer à vérifier les autres poissons. Une dose appropriée de la gentamicine se traduira par 80-90% des poissons étant utilisable. Mutualiser les poissons blessés et ensuite les diviser en différents groupes de traitement, si désiré.
4. Soins de poisson Récupération
- Gardez le poisson dans l'eau propre et l'environnement peu fréquentée. L'eau sale et le surpeuplement vont conduire à des infections et de décès non intentionnel. Essayez de garder pas plus de 6 poissons / 500 ml d'eau de poissons et de changer l'eau tous les jours si possible.
NOTE: Ceci est un volume minimal pour la conservation de l'espace ou si l'enquêteur souhaite réaliser des expériences à l'aide de traitements médicamenteux coûteux. - Ne pas nourrir le poisson jusqu'à 3 jours après la blessure. Récupération poissons ne mangent pas au premier abord, et de toute la nourriture dans le réservoir se décomposent et promouvoir bactéries growth. À partir de 3 jours après la lésion, nourrir une petite quantité une fois par jour.
5. Analyse des blessés reins
- Pour l'hybridation in situ pour l'expression de l'ARNm lhx1a, les reins peuvent être récoltées à partir de poissons à timepoints souhaités. Euthanasier les poissons dans l'eau tricaïne sur la glace au moins 10 min jusqu'à ce que le mouvement des branchies arrête, puis retirez la tête avec une lame de rasoir et d'ouvrir la cavité du corps et enlever les organes internes avec une pince.
- Laissez le rein en place (orgue pigmentée fixé à la paroi dorsale du corps) et fixer le poisson dans 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant une nuit. Disséquer le rein 15 et continuer avec la norme hybridation in situ.
- En bref, les reins laver dans du PBST (tampon phosphate salin à 0,5% de Tween 20), perméabilisées avec de la proteinase K dans du PBST (10 ug / ml) pendant 1 heure à température ambiante. Post-fixer avec 4% de paraformaldehyde, et lavé de nouveau avec du PBST.
- Ensuite pré-hybrider les reins jusqu'au lendemain à 68; ° C dans du tampon d'hybridation (50% formamide, 5x SSC, 50 pg / ml d'héparine, 500 ug / ml d'ARNt, 0,1% de Tween 20, pH 6,0).
- Incuber les échantillons avec de la digoxigénine marqué la sonde dans un tampon d'hybridation, puis laver pendant 5-10 min chacun avec 100%, 75%, 50%, tampon d'hybridation de 25% à 68 ° C, puis transféré à la température ambiante et laver deux fois pendant 30 min avec 2x SSC avec 0,1% de Tween 20, et laver deux fois pendant 30 min avec 0,2x SSC avec 0,1% de Tween 20.
- Équilibrer l'échantillon 3x 5 min dans MAB (0,1 M d'acide maléique, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) et bloquées pendant une nuit à 4 ° C dans du MAB avec du sérum de chèvre à 10%. Puis incuber pendant la nuit dans des échantillons anti-digoxigénine-AP Fab 1: 5000 dans MAB.
- Laver l'échantillon 5x pendant 1 heure dans MAB, 3x et équilibrer pendant 15 minutes dans NTMT (0,1 M de Tris pH 9,5, 0,05 M de MgCl2, 0,01 M de NaCl, 50 pi de Tween 20).
- Traitez ensuite les reins avec NBT / BCIP pour détecter le signal. Fixer les reins, avec 4% de paraformaldehyde et incubé dans le diméthylformamide à Remove excès de NBT / BCIP, blanchie pendant la nuit dans de l'eau déminéralisée. Laver les reins, puis photographier en PBS avec 50% de glycérol sous une lamelle.
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Representative Results
Blessures gentamicine peut être confirmé visuellement par l'observation des moulages épithéliales rénales dans l'eau (Figure 1). Différentes doses de gentamicine ont été utilisés pour blesser adultes de type sauvage TuAB poisson zèbre, résultant du nombre de lhx1a + agrégats cellulaires dans le rein régénérant (Figure 1A - D) augmentant. Moulages blancs peuvent facilement être vu dans l'eau un jour après une blessure (figure 1E - H). Une faible dose de gentamicine a entraîné dans la plupart des poissons ayant pas moulages, tandis que des doses plus élevées ont entraîné plus de 75% de moulages de poissons ayant (Figure 1I). Dans tous les groupes, la sélection pour les poissons avec des moulages a abouti à un niveau moyen plus élevé de blessures (figure 1J).
Après la confirmation visuelle de blessure, les poissons peuvent être regroupées et sont ensuite répartis en groupes de contrôle et de traitement pour les expériences (figure 2). Type sauvage TuAB poisson zèbre adultes ont été blessés avec un 80mg / kg dose de gentamicine. Un jour, après une blessure, le poisson avec des moulages ont été sélectionnés, mis en commun et ensuite divisé en choc thermique et pas de groupes de choc thermique. poisson de choc thermique ont été exposés à 37 ° C pendant 16 heures pendant une nuit et une période de repos de 8 heures à 28,5 ° C par jour. À quatre jours et 7 jours après la lésion poissons ont été fixés pour le montage toute hybridation in situ et le niveau du préjudice a été évalué par la densité de lhx1a + agrégats. Le choc thermique seul ne produit pas une réponse de blessures (figure 2A, D), mais le choc thermique accélère la réponse dans les poissons blessés par rapport à aucun contrôle de choc thermique (Figure 2B, C, G). En sept jours après la lésion il n'y avait pas plus de différence significative entre les groupes blessés (Figure E, F, H).
<strong> Figure 1: Régénération en réponse à l'insuffisance rénale aiguë par la gentamicine est dose-dépendante (A - D) LHX 1 une expression de l'ARNm marque agrégats cellulaires, qui sont nouveaux progéniteurs néphron.. (A) 7 jours après l'injection de contrôle IP, type sauvage poisson zèbre TuAB adulte ont normalement 0-2 LHX 1a + agrégats cellulaires dans le rein entier. (B - D) 7 jours après l'affichage de poisson d'injection de gentamicine nombre LHX 1a + agrégats cellulaires, indiquant la réponse de neonephrogenesis.This robustes est dose-dépendante, avec des concentrations plus élevées de la gentamicine résultant en plus LHX 1 a + clusters. (E - H) un jour après l'injection de gentamicine, poissons excrètent moulages blancs, comprenant des morts tissu épithélial des reins. (E) Une collection de moulages sur un total de 12 poissons montrant la variétéde formes et de tailles. Notez la différence entre moulages blancs indiquant blessures par rapport à rouge-orange crevette de saumure digéré. (F - H) Exemples de moulages recueillies auprès de chaque poisson un jour après une blessure en permettant à l'eau dans le réservoir à régler, pipetage les sédiments sur et en observant sous un microscope. (F) excréments sans moulages, indiquant l'absence de blessures causées par un poisson traité avec la dose de 40 mg / kg. (G) de taille moyenne moulages indiquant blessures d'un poisson traité avec la dose de 60 mg / kg. (H) plus grands moulages avec le tissu muées supplémentaire indiquant blessures d'un poisson traité avec la dose de 80 mg / kg. (I) Le pourcentage de poissons blessés avec des moulages est augmentée à 60 mg / kg et 80 mg / kg. (J) Après 7 jours, injecté poissons ont été traités pour la montagne toute l'hybridation in situ pour évaluer le dommage. Lhx1a + agrégats ont été comptés dans un seul tableau de 5x prise à la po plus largeint de chaque région des reins et du rein a été mesurée en utilisant ImageJ. Nombre moyen d'agrégats / mm 2 est indiqué pour chaque dose. Dans chaque cas, le poisson avec des moulages avait une moyenne supérieure à l'ensemble du groupe à chaque dose. p <0,5 pour 40 mg / kg par rapport à 80 mg / kg. La barre d'échelle dans AD = 0,2 mm, E = 1 mm, FH = 2mm.
Figure 2:. Régénération dépend de la température de 24 heures après l'injection de gentamicine, blessé type sauvage TuAB poisson zèbre adulte avec des moulages ont été regroupées et ensuite divisé en un groupe de choc thermique et un pas de groupe de choc thermique. Les poissons ont été maintenues à 37 ° C pendant 16 heures pendant une nuit après chaque nuit avec une période de repos de 8 heures à 28,5 ° C au cours de chaque jour. (A, D) contrôle indemne poissons n'a pas exprimé lhx1a après un choc thermique. (B, C) sh de chaleurock accélère la réponse de régénération, avec plusieurs clusters figurant déjà à 4 jours après la lésion par rapport aux poissons blessés sans choc thermique (p <0,5, test t de Student). (E, F) Après 7 jours, il n'y a pas de différence significative entre les poissons blessés traités par choc thermique et aucun choc thermique. (G, H) Quantification de blessure par comptage lhx1a + agrégats par mm 2. Chaque point représente un poisson individuel. Nombre de poissons et de réponse moyen est indiqué ci-dessus chaque groupe. Barre d'échelle = 0,2 mm.
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Discussion
Le poisson zèbre est idéal pour étudier la régénération des organes adultes, y compris l'adulte rénale mésonéphrique 6. Des études récentes ont profité de marqueurs moléculaires et de nouvelles lignes rapporteurs transgénique afin de mieux caractériser les étapes qui se produisent pendant néphrons régénération et ce que les cellules pourraient être responsables 7,12. Observation des cylindres urinaires a été utilisé pendant plus d'un siècle pour diagnostiquer les maladies du rein chez l'homme 16. Ici, nous utilisons la présence de cylindres comme un indicateur facile, non invasif et au début de l'étendue de la lésion rénale aiguë après l'injection de gentamicine. Nous observons que les poissons qui ne produisent pas des moulages sont soit seulement légèrement blessés (et ne forment pas de nouvelles néphrons) ou trop blessé pour récupérer et généralement meurent dans les 3 premiers jours. Par conséquent, une étape critique dans le protocole est l'observation individuelle des poissons après une blessure, et la présence de urinaire jette comme un indicateur de la gravité des blessures appropriées. Nous voyons aussi l'expression de lhx1adans les agrégats à partir de 4 jours après une blessure. Cela indique que les 3 premiers jours après la lésion sont une période cruciale pour la récupération.
Si un grand nombre de poissons sont indemnes, ou trop nombreux poissons meurent au cours de l'expérience, assurez-vous que les injections intra-péritonéales sont faites correctement. Il peut être utile d'ajouter un colorant non toxique tel que le phénol rouge à la solution de gentamicine pour visualiser toute fuite lors de l'injection. Marquage l'aiguille avec un marqueur permanent ou d'un morceau de ruban adhésif 2 mm de la pointe peut servir de guide pour éviter de pousser l'aiguille trop loin dans le poisson. En outre, le dosage de la gentamicine peut avoir besoin d'être ajusté. Injecter poisson avec une gamme de doses de gentamicine et de tester les reins pour l'expression de l'ARNm lhx1a soit par hybridation in situ ou RT-PCR quantitative en.
Une limitation de cette technique est qu'elle nécessite un caisson de chaque poisson une nuit avant de choisir des poissons blessés pourl'expérimentation. Pour étudier événements très précoces dans la régénération (dans les 24 premières heures après la blessure) poisson peut avoir besoin de subir un traitement expérimental continu, même pendant la période d'observation individuelle. Le coût de traitement du poisson individuelle avec des médicaments, par exemple, peut être très élevé. Notre technique est une amélioration sur la méthode actuelle de lésion rénale aiguë en utilisant la gentamicine, car il permet au chercheur d'éliminer les valeurs aberrantes en utilisant un processus visuel non invasif de dépistage. Ce modèle de lésion robuste, uniforme et reproductible peut maintenant être utilisé pour tester efficacement des hypothèses sur régénération rénale chez le poisson zèbre adulte.
Nous avons observé que, bien que la régénération se produit à la fois dans le poisson zèbre mâle et femelle (toutes les données présentées ici sont des femelles), la régénération en réponse à l'injection de gentamicine chez les hommes est beaucoup plus variable. Cela peut être dû à des raisons techniques, parce que leurs corps sont longs, minces et plus musclé, tandis que les femmes ont une plus grande bElly avec une peau plus souple mince, permettant l'injection plus facile et une cavité péritonéale plus grand pour accueillir les volumes d'injection sans fuite. Une autre possibilité est que les androgènes produits par les mâles peuvent avoir un effet sur le processus de régénération 17. Nachtrab et al. Ont trouvé que l'effet était dépendant des androgènes souche, ce qui indique que fond génétique peut moduler les niveaux d'androgènes. De légères variations de fond génétique des poissons d'TuAB utilisées dans notre étude pourraient expliquer la variabilité chez les mâles, mais vraisemblablement androgènes ne sont pas la seule source de variation et d'autres loci génétiques peuvent contribuer à l'hétérogénéité de la réponse à une blessure. Nous avons également constaté que les différentes lignées transgéniques de poisson zèbre peuvent réagir différemment à la blessure la gentamicine. Par exemple, la Tg (Lhx1a: GFP) 12 ligne dans nos mains nécessite 120 mg / kg pour l'induction efficace des blessures (données non présentées). Ces observations soulignent l'importance de l'utilisation de sib de même sexeling contrôle dans les études sur les blessures pour minimiser la variabilité expérimentale.
De nombreuses lignées transgéniques de poisson zèbre utilisent un promoteur sensible à un choc thermique comme moyen pour induire l'expression d'un transgène. Depuis le poisson zèbre sont poïkilothermes et ne pas réguler leur température corporelle, ils sont forcés d'exécuter des fonctions physiologiques à la température de leur environnement. Dans le cadre d'expériences utilisant le promoteur de hsp70 pour exprimer des transgènes dominantes pour moduler la réponse de la régénération, on a observé de manière inattendue que la réaction de régénération a été accélérée par une température plus élevée. Par conséquent, la détermination de l'effet de la température sur la réaction de régénération dans un système donné devient crucial pour la planification d'expériences, le temps (capturant le pic de la réponse de régénération par exemple) et rend la comparaison de régénération à des températures normales problématiques. Autres systèmes inductibles utilisant par exemple CreERT et le tamoxifène pour l'induction du transgène peut être mieux adapté to études de régénération adultes du rein. De même, les méthodes génétiques récentes de blessures induction telles que l'activation CreERT de transgènes toxiques ou des blessures inductible utilisant bactérienne nitroreductase / métronidazole 18,19 élargira la gamme des expériences possibles pour mieux comprendre neonephrogenesis et régénération rénale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
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