Introduction
Die Niere ist für die Flüssigkeit Homöostase, Blutdruckregulation und Filtration von Abfall aus dem Körper. Obwohl Säugetiere sind in der Lage, bestehende Nephrone nach Verletzung mit differenzierten Epithelzellen 1-4 reparieren, scheinen sie einen Pool von reservierten Stammzellen 5 fehlt und sind unfähig, neue Nephrone de novo bilden. Im Gegensatz zu Säugetieren, sind erwachsene Fische können neue Nephronen während des Erwachsenenlebens zu bilden, um das Wachstum der Fische und in Reaktion auf eine Verletzung 6,7 unterstützen. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein unschätzbares Modellorganismus für das Studium der Organregeneration 8-10 und hat das Potenzial, leistungsstarke Einblicke in die Anwendungen für Engineering der Reparatur von menschlichen Nieren zu schaffen. Die Tg (Lhx1a: EGFP) Transgen 11 ist gezeigt worden, um einen Pool von Nephron-Vorläuferzellen im erwachsenen Zebrafisch Nieren 12 kennzeichnen jedoch Mechanismen, die die Reaktion der lhx1a + Zellen verletzungs rEmain unklar.
Das Aminoglycosid Gentamicin ist ein häufig verwendetes Antibiotikum mit bekannten nephrotoxischen und ototoxic Wirkungen bei Menschen 13. Intraperitoneale Injektion von Gentamicin ist ein etabliertes Verfahren zur Induktion der akuten Nierenschädigung in Fisch 6. Diese Verletzung in Fisch imitiert den Verlust von Tubulusepithel und Vernarbung der Glomeruli, die nach Gentamicin 14 Dosierung beim Menschen auftritt. Induzieren Schädigung im Zebrafisch Refobacin Injektion ist ein bequemer Weg induzieren eine starke, synchrone Regenerierung Reaktion mit vielen neuen Nephronen erzeugt und gleichzeitig durch die Stufen der Bildung, Proliferation und Differenzierung fortfahren.
Dieses Protokoll Details unserer Verfahren für robuste und reproduzierbare Verletzung im erwachsenen Zebrafisch Niere durch die Verwendung eines nicht-invasiven bild Screening-Prozess, um Ausreißer zu minimieren. Wir nutzen die Tatsache, dass Verletzungen mit Gentamicin führt zum Tod von epithelialen Nierengewebe und FormatIon der Nierentubuli Abgüsse, die dann in Massen sammeln sich in den Mesonephros Kanäle und Kloake. Diese werden durch den Fisch geführt und kann visuell im Wasser beobachtet werden. Dies erlaubt uns, für Fische mit stark nicht-tödliche Verletzungen, die dann für weitere Experimente gebündelt werden können screenen. Minimierung der Zahl der unverletzten Fische oder Fische, die vor Erreichen der Endpunkt des Experiments führt zu mehr einheitliche und effiziente Datenerfassung und -analyse zu sterben. Darüber hinaus sind keine speziellen Geräte oder Reagenzien erforderlich, so dass diese Verfahren kostengünstiger und geeigneter für die Verwendung in einem akademischen oder Lehr Einstellung. Mit unserem Verfahren, hier zeigen wir die zunehmenden Auswirkungen von Gentamicin-Dosis auf die Nierenregeneration sowie die Wirkung der erhöhten Temperatur.
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Protocol
HINWEIS: Ethics Statement: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Massachusetts General Hospital Richtlinien für Tierversuche in der Forschung durchgeführt.
1. Voraus Vorbereitung
- Ermitteln Sie, wie viele erwachsenen Zebrafisch 6-12 Monate alt, um zu verletzen. Plan, um 10-20% mehr Fische als benötigt zu verletzen. Um Schwankungen zu minimieren, abgestimmte Einsatz Alter Geschwister Fische in der gleichen Tank gemeinsam aufgezogen, so dass sie ungefähr die gleiche Größe und weniger genetische Variabilität. Weiblichen Fische sind viel einfacher zu injizieren, verglichen mit dem männlichen Fische aufgrund der größeren Kapazität des Bauches. , Männchen und Weibchen geben jedoch ähnliche Ergebnisse.
- Wenn dabei den Versuch zum ersten Mal, eine Dosiskurve zu zeichnen, um die geeignete Dosierung für ein Gentamycin spezifischen Stammes von Fisch zu bestimmen. Testen jeder neuen Charge von Gentamicin vor der Verwendung in Experimenten, da die Reinheit des Gentamicin variiert von Charge zu Charge. Die richtige Dosierung sollte durch die Bewertung expressi bestimmt werdenauf Verletzungsmarker wie lhx1a. (Siehe 1A - D).
- Bereiten Gentamicin-Lösung. Gentamicin-Stammlösung kann in -20 ° C gelagert und zur späteren Verwendung aufgetaut werden. Zum Beispiel für eine 80 mg / kg-Dosis (80 mg Gentamicin / kg Körpergewicht) in einem Fisch einem Gewicht von 0,5 g, herzustellen 2 mg / ml Gentamycin in phosphatgepufferter Salzlösung als eine bequeme Arbeitslösung. Dies stellt eine 20 ul Gentamycin zur intraperitonealen Injektion in den Fisch.
HINWEIS: In der Regel 80 bis 120 mg / kg erzielen gute Ergebnisse, aber so geringen Dosen wie 40 mg / kg geeignet sein. Gentamicin kann auch in Lösung erworben werden, um die Exposition gegenüber gefährlichen Laborpersonal zu minimieren.
HINWEIS: Gentamicin in hohen Dosen giftig sein können. Tragen Sie Handschuhe und Maske bei einem Gewicht von Pulver. - Bereiten Sie 100 ml von 0,016% Tricaine Wasser für Anästhesie Fisch. Bereiten Sie eine Bestandsaufnahme 25x Tricaine (4 g / 1 L) in sterilem Milli-Q-Wasser gelöst, auf pH 7 und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verdünnen Sie 4 ml in 100 ml Wasser für Fisch einer Arbeitskonzentration von 0,016%.
HINWEIS: Tricaine ist ein Anästhetikum und hautreizend, Handschuhe bei der Handhabung. - Machen Sie einen Fisch aus einem Kunststofftransferpipette schöpfen, indem die Lampe in Form einer Kugel und Schneid 2 Steckplätze in den Boden, das Wasser abgeleitet. Last 1 ml Spritzen (mit 10 ul Abstufungen) mit der vorbereiteten Lösung Gentamicin und fügen Sie eine 30½ G Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen. Drehen Sie die Nadel auf die Spritze, um sicherzustellen, dass die gebogene Spitze auf der Nadel abgewandten und die Spritze Markierungen nach vorne und lesbar. Für Steuereinspritzungen, bereiten eine Spritze und Nadel mit sterilem PBS.
- Bereiten Sie eine Skala mit einer sauberen Oberfläche oder wiegen Boot sowie Papierhandtücher zum Trocknen von Fisch und zum Halten von Fisch für die Injektion.
- Bereiten einzelnen kleinen Halbliter-Behälter mit Deckel zur Aufnahme von Fisch zur Beobachtung über Nacht nach der Injektion. Kleinen transparenten Kunststoff Führungskäfige sind für diesen Zweck nützlich. DieseBehälter nicht weiß - im Idealfall sollten sie klar sein, so dass die weißen epithelialen Abgüsse von den Fischschuppen auf einem schwarzen Tischplatte beachten. Füllen Sie jeden Container mit genug Fisch Wasser für die Fische, um bequem zu schwimmen.
2. intraperitoneale Injektion von Gentamicin
- Betäuben die Fische in 0,016% Tricaine Lösung in Fischwasser. Warten Sie auf den Kiemenventilationsrate zu verlangsamen und die Fische nicht mehr auf Berührung reagieren.
- Schöpfen die Fische mit dem Fisch Schaufel, sich von Kopf zu Schwanz, um nicht zu verletzen, die Kiemen oder Flossen. Den Fisch auf Küchenpapier, um das überschüssige Wasser durch Drehen der Fisch aus sanft auf die Seite aufnehmen und schütteln Sie überschüssiges Wasser aus der Schaufel.
- Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie in die wiegen Boot auf der Skala auf Null gestellt und wiegen die Fische. Runde auf den nächsten 0,25 g, und berechnen Sie die entsprechende Menge an Gentamicin zu injizieren.
HINWEIS: Für eine 0,5 g Fisch mit einem 20 & mgr; l Injektion in 80 mg / kg-Dosis. - Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie auf einer trockenen gefalteten Papiertuch. Wenn die Injektion mit der rechten Hand den Papiertuch in der linken Hand und legen Sie den Kopf des Fisches nach links, mit der Bauch leicht zugänglich.
- Halten Sie die Spritze mit der Nadel in einem 45 ° Winkel auf die Haut des Bauches, anterior der Kloake. Drücken Sie die Nadel unter die Haut, dann den Winkel zu verringern, und schieben Sie die Nadel nach vorne unter die Haut, die Vermeidung der inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der entsprechenden Menge, innehalten, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit kommt heraus um die Nadel, dann ziehen Sie die Nadel. Wenn die Fische halten stetigen ist ein Problem, Klammer Ellbogen Oberkörper, um sie zu stabilisieren.
HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Gentamicin-Lösung. - Drop jeden Fisch zu einem individuellen Behälter. Beobachten Sie die Fische und deren Verwertung aus der Narkose. Halten Fisch bei 28,5 ° C über Nacht.
HINWEIS: Wenn die Fische nicht sofort wieder zu beleben, mit einem Kunststoff-transfer-Pipette, um Wasser zu bewässern über die Kiemen, um es wieder zu beleben. - Verwenden Sie die gleiche Spritze und Nadel bei der Injektion mehrere Fische mit der gleichen Dosis von Gentamicin. Entsorgen Sie die Spritze und Nadel in die entsprechende Biohazard Behälter für spitze Gegenstände.
3. Nacheinspritzung Beobachtung der Verletzungen
- Am nächsten Tag (1 Tag nach der Verletzung), legen Sie die injizierten Fische in ihrem Behälter auf einer dunklen Oberfläche. Weiß Abgüsse von Toten Epithelgewebe von den verletzten Fisch ausgeschieden sollte sichtbar sein. (Siehe Abbildung 1 E - H). Wenn es keine Zylinder entweder der Fisch nicht durch die Gentamicin Injektion verletzt (entweder die Dosierung zu niedrig, oder einige der Gentamicin während des Spritzvorgangs ausgetretene) oder der Fisch wurde ernsthaft verletzt zu einer vollständigen Blockierung der Harnleiter und Kloake mit abgestoßen Gewebe.
HINWEIS: Wenn die Fische nicht in der Lage, um die Abgüsse vom Körper es in der Regel innerhalb von 2-3 Tagen sterben, zu löschen und damit unbrauchbar für längereAssays. Wenn keine Zylinder sichtbar sind, einschläfern die Fische in Tricaine Wasser für mindestens 10 min eingetaucht, nachdem gill Bewegung stoppt. - Wenn weißes Seiden Abgüsse sichtbar sind, stellen Sie den Fisch beiseite und weiterhin die Überprüfung der anderen Fischen. Eine geeignete Dosis von Gentamicin in 80-90% der Fische wobei brauchbaren Ergebnis. Pool des verletzten Fisch und dann teilen sie in verschiedene Behandlungsgruppen, falls gewünscht.
4. Pflege von Einholen von Fisch
- Halten Fische in sauberes Wasser und menschenleeren Umgebung. Schmutzwasser und Gedränge wird, um Infektionen und ungewollten Tod führen. Versuchen Sie, nicht mehr als 6 Fisch / 500 ml Fisch Wasser täglich, wenn möglich zu halten und das Wasser wechseln.
Anmerkung: Dies ist ein Minimalvolumen für die Konservierung der Raum oder der Prüfer wünscht Experimente mit teuren Arzneimittelbehandlungen durchzuführen. - Haben die Fische zu füttern nicht bis 3 Tage nach der Verletzung. Einholen von Fisch wird zunächst nicht zu essen, und alle Lebensmittel in den Tank zersetzt und fördern Bakterien growth. Ab 3 Tage nach der Verletzung, füttern Sie eine kleine Menge einmal täglich.
5. Analyse der Verletzte Nieren
- Für in-situ-Hybridisierung für lhx1a mRNA-Expression kann Nieren von Fisch in gewünschten Zeitpunkten geerntet werden. Euthanize Fisch in Tricaine Wasser auf Eis mindestens 10 min bis gill Bewegung stoppt, entfernen Sie dann den Kopf mit einer Rasierklinge und öffnen Sie die Körperhöhle und entfernen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette.
- Verlassen Sie die Niere statt (pigmentierte Orgel an der dorsalen Körperwand befestigt) und befestigen Sie den Fisch in 4% Paraformaldehyd in PBS über Nacht. Sezieren die Niere 15 und fahren Sie mit Standard-in-situ-Hybridisierung.
- Kurz gesagt, wasche die Nieren in PBST (phosphatgepufferte Salzlösung 0,5% Tween 20), mit Proteinase K in PBST (10 ug / ml) für 1 h bei Raumtemperatur permeabilisiert. Post-fix mit 4% Paraformaldehyd und mit PBST gewaschen.
- Dann vorge hybridisieren die Nieren über Nacht bei 68; ° C in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5 × SSC, 50 ug / ml Heparin, 500 ug / ml tRNA, 0,1% Tween20, pH 6,0).
- Die Proben mit Digoxigenin markierten Sonde in Hybridisierungspuffer inkubieren, dann für 5-10 min waschen mit je 100%, 75%, 50%, 25% Hybridisierungspuffer bei 68 ° C, dann in Raumtemperatur und zweimal Waschen für 30 min mit 2 × SSC mit 0,1% Tween 20, und waschen zweimal für 30 min mit 0,2 × SSC mit 0,1% Tween20.
- Äquilibrieren die Probe 3x 5 min in MAB (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) gewaschen und über Nacht bei 4 ° C in MAB mit 10% Ziegenserum blockiert. Dann inkubieren Proben über Nacht in Anti-Digoxigenin-AP Fab 1: 5.000 in MAB.
- Für 1 h in MAB wasche die Probe 5x und äquilibrieren 3x 15 min in NTMT (0,1 M Tris pH 9,5, 0,05 M MgCl 2, 0,01 M NaCl, 50 & mgr; l Tween 20).
- Dann behandeln die Nieren mit NBT / BCIP zu Signal zu erfassen. Befestigen Sie die Nieren mit 4% Paraformaldehyd und in Dimethylformamid inkubiert, um remove überschüssige NBT / BCIP, über Nacht in entionisiertem Wasser gebleicht. Waschen Sie die Nieren und dann in PBST fotografieren mit 50% Glycerin unter einem Deckglas.
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Representative Results
Gentamicin Verletzung kann visuell durch Beobachtung der Nierenepithelzellen Abgüsse im Wasser (1) bestätigt werden. Verschiedene Dosierungen von Gentamicin wurden verwendet, um erwachsenen Wildtyp TuAB Zebrafisch zu verletzen, was zu immer mehr lhx1a + Zellaggregaten in der regenerierenden Nieren (1A - D). Weiß Abgüsse können leicht in das Wasser 1 Tag nach Verletzung (- H 1E) zu sehen. Eine geringe Dosis von Gentamicin in Folge die meisten Fische, die keine Casts, während höhere Dosen resultierte in über 75% der Fische, die Abgüsse (1I). In allen Gruppen, die Auswahl für Fisch mit Abgüsse zu einer höheren durchschnittlichen Schadensniveau (Abbildung 1J).
Nach visuelle Bestätigung der Verletzung, kann Fisch gebündelt und dann aufgeteilt in Kontroll- und Behandlungsgruppen für Experimente (Abbildung 2). Wildtyp TuAB erwachsenen Zebrafisch wurden mit einem 80 Verletztemg / kg Dosis von Gentamicin. Einen Tag nach der Verletzung wurden Fisch mit Abgüssen ausgewählt, vereinigt und dann in Hitzeschock und keine Hitzeschock-Gruppen aufgeteilt. Hitzeschock Fische wurden auf 37 ° C für 16 Stunden über Nacht und einem 8 h Ruhezeit bei 28,5 ° C jeden Tag ausgesetzt sind. 4 Tage und 7 Tage nach der Verletzung Fische wurden für ganze Berg in-situ-Hybridisierung fixiert und Schadensschwelle wurde von Dichte lhx1a + Aggregate bewertet. Hitzeschock allein macht eine Verletzung Antwort (2A, D) nicht zu produzieren, aber Hitzeschock beschleunigt die Reaktion in verletzten Fisch im Vergleich zu keinem Hitzeschock-Kontrollen (2B, C, G). Von 7 Tage nach der Verletzung gab es nicht mehr einen signifikanten Unterschied zwischen verletzten Gruppen (Abbildung E, F, H).
<strong> Abbildung 1: Regeneration in Antwort auf akuten Nierenschädigung durch Gentamicin ist dosisabhängig (A - D) lhx 1 a-mRNA-Expression markiert Zellaggregaten, die neue nephron Vorläuferzellen sind.. (A) von 7 Tagen nach Steuer ip-Injektion, Wildtyp TuAB erwachsenen Zebrafisch haben in der Regel 0-2 lhx 1a + Zellaggregaten in der gesamten Niere. (B - D) 7 Tage nach der Injektion Gentamycin Fische zeigen viele lhx 1a + Zellaggregaten, was robuste neonephrogenesis.This Antwort dosisabhängig ist, mit höheren Konzentrationen von Gentamicin was zu mehr lhx 1 a + Clustern. (E - H) 1 Tage nach der Injektion von Gentamicin, Fische scheiden weiß Abgüsse aus toten Epithelgewebe aus den Nieren. (E) Eine Sammlung von Abgüssen von insgesamt 12 Fische, die die Vielfaltvon Formen und Größen. Beachten Sie den Unterschied zwischen weißen Abgüsse anzeigt Verletzungen im Vergleich zu rot-orange verdaut Artemia. (F - H) Beispiele für Abgüsse aus einzelnen Fische 1 Tag nach Verletzungen, indem man das Wasser im Tank zu regeln, Pipettieren der Bodensatz aus und beobachtet unter dem Mikroskop gesammelt. (F) Exkremente ohne Casts und zeigt keine Verletzung von einem Fisch mit der 40 mg / kg Dosis behandelt. (G) Mittelgroße wirft anzeigt, Verletzungen von einem Fisch mit der 60 mg / kg Dosis behandelt. (H) Größere Besetzungen mit zusätzlichem Gewebe abgestoßen anzeigt Verletzungen von einem Fisch mit der 80 mg / kg Dosis behandelt. (I) Der Prozentsatz der verletzten Fisch mit Abgüssen bei 60 mg / kg und 80 mg / kg erhöht. (J) Nach 7 Tagen injiziert Fische wurden für ganze Berg in-situ-Hybridisierung verarbeitet werden, um Verletzungen zu beurteilen. Lhx1a + Aggregate wurden in einem 5-fach Bild an der breitesten po genommen gezähltint jeder Niere und Nierenbereich wurde mit ImageJ gemessen. Durchschnittliche Zahl der Aggregate / mm 2 ist für jede Dosis dargestellt. Jeweils Fisch Abgüsse hatte einen höheren Durchschnitt als der Gesamtgruppe bei jeder Dosis. p <0,5 für 40 mg / kg im Vergleich zu 80 mg / kg. Maßstabsleiste in AD = 0,2 mm, E = 1 mm, 2 mm FH =.
Abb. 2: Temperaturabhängige Regeneration 24 Stunden nach der Injektion Gentamicin, verletzte Wildtyp TuAB erwachsenen Zebrafisch mit Abgüsse wurden gesammelt und dann aufgeteilt in einen Hitzeschock-Gruppe und eine Gruppe ohne Hitzeschock. Fische wurden bei 37 ° C für 16 Stunden über Nacht jede Nacht danach mit einer 8 h Ruhezeit bei 28,5 ° C während jedes Tages aufrechterhalten wird. (A, D) unverletzten Kontrollfische nicht lhx1a nach Hitzeschock auszudrücken. (B, C) Wärme shock beschleunigt die Regeneration Reaktion, mit mehreren Clustern bereits bei 4 Tage nach der Verletzung im Vergleich zu verletzten Fisch ohne Hitzeschock (p <0,5, Student-t-Test) erscheinen. (E, F) Nach 7 Tagen gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen verletzten Fisch mit Hitzeschock und ohne Hitzeschock behandelt. (G, H) Quantifizierung der Schädigung durch Zählen lhx1a + Aggregaten pro mm 2. Jeder Punkt stellt eine einzelne Fische. Anzahl der Fische und durchschnittliche Antwort oberhalb jeder Gruppe angezeigt. Maßstabsbalken = 0,2 mm.
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Discussion
Der Zebrafisch ist ideal für das Studium der Regeneration von erwachsenen Organen, einschließlich der erwachsenen Niere Mesonephros 6. Jüngste Studien haben den Vorteil von molekularen Markern und neuen transgenen Reporter Linien besser zu charakterisieren die Schritte, die während Nephron Regeneration auftreten und welche Zellen verantwortlich 7,12 sein könnten. Beobachtung Harnzylinder ist seit über einem Jahrhundert verwendet, um Nierenerkrankungen beim Menschen 16 zu diagnostizieren. Hier verwenden wir das Vorhandensein von Abgüsse als eine einfache, nicht-invasive und frühen Indikator für das Ausmaß der akuten Nierenschädigung nach Gentamicin Injektion. Wir beobachten, dass Fische, die nicht produzieren Würfe sind entweder nur leicht verletzt (und nicht neue Nephronen zu bilden) oder zu verletzten sich zu erholen und in der Regel innerhalb der ersten 3 Tage sterben. Daher ist ein kritischer Schritt im Protokoll der einzelnen Beobachtungs Fisch nach einer Verletzung, und die Anwesenheit von Harnzylindern als Indikator für die richtige verursachten Verletzungen. Wir sehen auch, lhx1a Ausdruckin Aggregaten ab Tag 4 nach der Verletzung. Dies zeigt, dass die ersten 3 Tage nach der Verletzung sind eine entscheidende Zeit für die Wiederherstellung.
Wenn eine große Anzahl von Fischen sind unverletzt, oder zu viele Fische im Verlauf des Versuchs sterben, stellen Sie sicher, dass die intraperitoneale Injektionen ist es richtig macht. Es kann helfen, eine nicht toxische Farbstoff, wie Phenol-Rot auf die Gentamicin-Lösung in den ein Auslaufen während der Injektion zu visualisieren. Markieren Sie die Nadel mit einer dauerhaften Markierung oder einem Stück Klebeband 2 mm von der Spitze kann als Richtschnur dienen schieben die Nadel zu weit in den Fischen zu verhindern. Zusätzlich muss die Dosierung des Gentamicin möglicherweise angepasst werden. Injizieren Fisch mit einem Bereich von Dosen Gentamycin und Testen der Nieren zur Expression lhx1a mRNA entweder durch in situ-Hybridisierung oder quantitative RT-PCR.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass es Gehäuse einzelnen Fische benötigt über Nacht vor der Wahl verletzt Fisch fürExperimentieren. Sehr früh Veranstaltungen in Regeneration (innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Verletzung) zu untersuchen Fische müssen möglicherweise kontinuierliche experimentellen Behandlung zu unterziehen, auch während der einzelnen Beobachtungszeitraum. Die Behandlung der einzelnen Fische mit Medikamenten, beispielsweise sehr hoch sein kann. Unser Verfahren ist eine Verbesserung gegenüber den bestehenden Verfahren der akuten Nierenschädigung mit Gentamicin, weil es dem Forscher, Ausreißer, indem eine nicht-invasive optische Screeningverfahren zu beseitigen. Diese robuste, gleichmäßige und reproduzierbare Verletzungsmodell kann nun verwendet werden, um Hypothesen über Nieren Regeneration im erwachsenen Zebrafisch effektiv zu testen.
Wir beobachteten, dass, obwohl eine Regeneration erfolgt in männliche und weibliche Zebrafisch (alle hier gezeigten Daten sind von den Weibchen), ist die Regeneration als Reaktion auf Gentamicin-Injektion bei Männern sehr viel variabler. Dies kann aus technischen Gründen, denn ihre Körper sind lange, dünne und muskulöser, während Frauen haben eine viel größere bElly mit lockerer, dünnere Haut, die einen leichteren Injektion und eine größere Bauchhöhle zu Injektionsvolumina ohne Leckage unterzubringen. Eine alternative Möglichkeit ist, dass Androgene Männchen erzeugt wird, kann eine Wirkung auf die Regenerationsprozess 17 haben. Nachtrab et al., Dass die Wirkung der Androgene wurde der Stamm abhängig, was bedeutet, dass der genetische Hintergrund könnte Androgenspiegel modulieren. Abweichungen in der genetische Hintergrund der TuAB Fisch in unserer Studie verwendeten könnte die Variabilität bei Männern, erläutern, aber vermutlich Androgene sind nicht die einzige Quelle der Variation und anderen genetischen Loci zu Heterogenität in der Reaktion auf eine Verletzung beitragen. Wir haben auch festgestellt, dass verschiedene transgene Linien von Zebrabärbling unterschiedlich auf Gentamicin Verletzungen zu reagieren. Zum Beispiel kann die Tg (Lhx1a: GFP) 12 Linie in der Hand erfordert 120 mg / kg für die effiziente Induktion von Verletzungen (Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen unterstreichen die Bedeutung der Verwendung von gleichgeschlechtlichen sibling steuert Verletzungen Studien zu experimentellen Variabilität zu minimieren.
Viele transgene Zebrafisch-Leitungen über eine Hitzeschock empfindlichen Promotors als ein Mittel, um die Expression eines Transgens zu induzieren. Da Zebrafisch sind poikilothermic und machen uns ihre Körpertemperatur nicht regulieren, sind sie gezwungen, die physiologischen Funktionen bei der Temperatur ihrer Umgebung durchzuführen. Im Rahmen von Experimenten mit dem Hsp70-Promotor, um dominant-Transgene exprimieren, um die Regenerationsantwort modulieren, haben wir unerwartet festgestellt, dass die Regenerationsantwort wurde durch höhere Temperaturen beschleunigt wird. Daher wird die Bestimmung der Wirkung der Temperatur auf die Regenerationsantwort in einem gegebenen System wichtig, Zeitplanung die von Experimenten (die Erfassung der Spitzenwert der Regenerationsreaktion zum Beispiel) und einen Vergleich, um die Regeneration bei normalen Temperaturen problematisch. Andere induzierbare Systeme mit beispielsweise CreERT und Tamoxifen für transgene Induktion kann besser geeignet sein to Studien der erwachsenen Nierenregeneration. Ebenso neueren genetischen Methoden Verletzungs Induktion wie CreERT Aktivierung von toxischen Transgenen oder induzierbare Verletzungen mit bakteriellen Nitroreduktase / Metronidazol 18,19 wird den Bereich der möglichen Experimente zu erweitern, um besser zu verstehen, neonephrogenesis und Nierenregeneration.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
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