Introduction
Il rene è essenziale per l'omeostasi del fluido, la regolazione della pressione sanguigna e la filtrazione dei rifiuti dal corpo. Anche se i mammiferi sono in grado di riparare i nefroni esistenti dopo la lesione utilizzando cellule epiteliali differenziate 1-4, sembrano mancare di un pool di cellule staminali riservati 5 e sono in grado di formare nuovi nefroni de novo. A differenza dei mammiferi, i pesci adulti sono in grado di formare nuovi nefroni per tutta la vita adulta per sostenere la crescita del pesce e in risposta al danno 6,7. Il zebrafish, Danio rerio, è un organismo modello prezioso per lo studio della rigenerazione degli organi 8-10 e ha il potenziale per fornire potenti intuizioni in applicazioni per l'ingegneria la riparazione di reni umani. Il Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 ha dimostrato di etichettare un pool di cellule progenitrici nephron in zebrafish adulti rene 12, tuttavia i meccanismi che controllano la risposta delle cellule lhx1a + al danno rEmain chiaro.
La gentamicina aminoglicoside è un antibiotico ampiamente usato con noti effetti nefrotossici e ototossici nell'uomo 13. Iniezione intraperitoneale di gentamicina è un metodo consolidato di indurre danno renale acuto nei pesci 6. Questa lesione nel pesce imita la perdita dell'epitelio tubolare e cicatrici di glomeruli che si verifica negli esseri umani dopo gentamicina sovradosaggio 14. Indurre lesioni in zebrafish per iniezione gentamicina è un modo conveniente di indurre una forte risposta rigenerazione sincrono, con molti nuovi nefroni prodotte e, contemporaneamente, di procedere attraverso le fasi di formazione, la proliferazione e la differenziazione.
Dettagli Questo protocollo il nostro metodo per lesioni robusto e riproducibile in zebrafish adulti rene utilizzando un processo di screening non invasivo visivo per ridurre al minimo i valori anomali. Approfittiamo del fatto che il pregiudizio con gentamicina porta alla morte del tessuto renale epiteliali e formatoioni di calchi tubulari renali, che poi si accumulano in masse nei condotti mesonefrici e cloaca. Questi sono passati dai pesci e possono essere osservati visivamente in acqua. Questo ci permette di schermo per il pesce con forte infortunio non letale, che può essere messo in comune per ulteriori sperimentazioni. Minimizzare il numero di pesci illeso o pesce che muoiono prima di raggiungere il punto finale dell'esperimento porta a più uniforme ed efficiente la raccolta di dati e di analisi. Inoltre, non sono richiesti particolari dispositivi o reagenti, rendendo questo metodo conveniente e adatto per l'uso in un ambiente accademico o di insegnamento. Utilizzando il nostro metodo, qui mostriamo effetti sempre maggiori delle dosi gentamicina sulla rigenerazione del rene, nonché l'effetto di aumento della temperatura.
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Protocol
NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida del Massachusetts General Hospital per l'impiego di animali nella ricerca.
1. preparazione preliminare
- Determinare il numero di adulti zebrafish 6-12 mesi di ferire. Piano per ferire il 10-20% in più pesce di quanto sarà necessario. Per ridurre al minimo la variabilità, utilizzo età abbinato pesci allevati sibling insieme nella stessa vasca in modo che siano all'incirca le stesse dimensioni e la variabilità genetica meno. Pesci femminili sono molto più facile per iniettare rispetto al pesce maschio, a causa della maggiore capacità dell'addome. Tuttavia, i maschi e le femmine danno risultati simili.
- Quando si esegue l'esperimento per la prima volta, tracciare una curva dose per determinare il dosaggio appropriato gentamicina per uno specifico ceppo di pesci. Verificare ogni nuovo lotto di gentamicina prima dell'uso in esperimenti dal momento che la purezza di gentamicina varia da lotto a lotto. La dose deve essere determinato valutando expressisu di marcatori di pregiudizio, come lhx1a. (Vedi Figura 1A - D).
- Preparare la soluzione di gentamicina. Gentamicina soluzione madre può essere conservata a -20 ° C e scongelato per un uso successivo. Ad esempio, per una dose di 80 mg / kg (80 mg / kg gentamicina di peso corporeo) in un pesce del peso di 0,5 g, preparare 2 mg / ml di gentamicina in tampone fosfato come una soluzione di lavoro comoda. Questo fornisce un 20 microlitri di gentamicina per iniezione intraperitoneale nel pesce.
NOTA: In generale, 80-120 mg / kg ottenere buoni risultati, ma dosi di 40 mg / kg può essere appropriato. Gentamicina può anche essere acquistato in soluzione per ridurre al minimo l'esposizione pericolosa al personale di laboratorio.
NOTA: Gentamicina in dosi elevate può essere tossico. Indossare guanti e maschera nel valutare in polvere. - Preparare 100 ml di acqua tricaine 0,016% per anestetizzare il pesce. Preparare uno stock 25x di tricaine (4 g / 1 L) disciolto in acqua sterile MilliQ regolare a pH 7 e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Diluire 4 ml in 100 ml di acqua pesce per la soluzione di lavoro di 0,016%.
NOTA: Tricaine è un anestetico e pelle irritante, indossare guanti durante la manipolazione. - Fare un pesce paletta da un pipetta plastica tagliando la lampadina a forma di paletta e taglio 2 slot nella parte inferiore per drenare l'acqua. Siringhe carico 1ml (con 10 gradazioni microlitri) con la soluzione di gentamicina preparata e attribuiscono un ago G 30½. Rimuovere eventuali bolle d'aria. Girare l'ago della siringa per fare in modo che la punta angolata sul ferro sia rivolta e le marcature siringa si trovano ad affrontare in avanti e leggibile. Per le iniezioni di controllo, preparare una siringa e l'ago con PBS sterile.
- Preparare una scala con una superficie pulita o pesare barca così come i tovaglioli di carta per asciugare il pesce e per lo svolgimento di pesce per l'iniezione.
- Preparare singoli contenitori piccole da mezzo litro con coperchio per lo svolgimento di pesce per l'iniezione di osservazione posto durante la notte. Piccole gabbie di plastica accoppiamento trasparenti sono utili per questo scopo. Questecontenitori non devono essere bianco - idealmente dovrebbero essere chiaro in modo che i calchi epiteliali bianchi versate dai pesci possono essere osservati in cima a una panchina nera. Riempire ogni contenitore con acqua abbastanza pesce per il pesce a nuotare comodamente.
2. iniezione intraperitoneale di gentamicina
- Anestetizzare il pesce nella soluzione tricaine 0,016% in acqua i pesci. Attendere che il tasso di ventilazione branchia per rallentare e per il pesce a rispondere non più al tatto.
- Raccogliere il pesce con la paletta pesce, muovendo dalla testa verso la coda, al fine di evitare di ferire le branchie o pinne. Mettere il pesce su carta assorbente per assorbire l'acqua in eccesso ruotando il pesce con delicatezza su un fianco e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso dal scoop.
- Raccogliere il pesce di nuovo e metterlo in barca pesare sulla bilancia azzerato e pesare il pesce. Rotonda con l'approssimazione di 0,25 g, e calcolare la giusta quantità di gentamicina da iniettare.
NOTA: Per un 0,5 g di pesce utilizzare una iniezione di 20 ml a 80 dose mg / kg. - Raccogliere il pesce di nuovo e metterlo su un tovagliolo di carta piegato a secco. Se l'iniezione con la mano destra, tenere il tovagliolo di carta nella mano sinistra e mettere la testa del pesce che punta a sinistra, con la pancia facilmente accessibile.
- Tenere la siringa con l'ago con un angolo per la pelle della pancia, anteriore alla cloaca 45 °. Spingere l'ago sotto la pelle, quindi diminuire l'angolo e far scorrere l'ago in avanti sotto la pelle, evitando gli organi interni. Spingere il pistone la giusta quantità, mettere in pausa per assicurarsi che nessun liquido esce intorno all'ago, quindi estrarre l'ago. Se tiene il pesce costante è un problema, gomiti bretelle contro tronco per essere stabilizzati.
NOTA: Maneggiare con guanti soluzione di gentamicina. - Eliminare ogni pesce in un singolo contenitore. Osservare il pesce e assicurarne il recupero dall'anestesia. Mantenere pesce a 28,5 ° C durante la notte.
NOTA: Se il pesce non rivivere subito, utilizzare un trans plasticafer pipetta per irrigare l'acqua attraverso le branchie di rianimarlo. - Utilizzare lo stesso siringa e l'ago quando si inietta pesce multipla con la stessa dose di gentamicina. Smaltire la siringa usata e l'ago nel apposito contenitore per rischio biologico taglienti.
3. osservatorio Iniezione di lesioni
- Il giorno successivo (lesione dopo 1 giorno), posizionare il pesce iniettato nel suo contenitore su una superficie scura. Calchi bianche di tessuto epiteliale morti escreta dai pesci feriti dovrebbero essere visibili. (Vedi Figura 1E - H). Se non ci sono calchi, o il pesce non è stato ferito dall'iniezione gentamicina (sia la dose era troppo bassa, o alcune delle gentamicina fuoriuscito durante il processo di iniezione) o il pesce era gravemente ferito conseguente blocco completo degli ureteri e cloaca con il tessuto sloughed.
NOTA: Se il pesce non è in grado di cancellare i calchi dal suo corpo che di solito muoiono entro 2-3 giorni ed è quindi inutilizzabile per piùsaggi. Se non calchi sono visibili, eutanasia il pesce in acqua tricaine immergendo per almeno 10 minuti dopo il movimento branchia si arresta. - Se calchi tessuto bianche sono visibili, impostare il pesce da parte e continuare a controllare lo altri pesci. Una dose appropriata di gentamicina comporterà 80-90% del pesce essere utilizzabile. Pool i pesci feriti e poi divisi in diversi gruppi di trattamento, se desiderato.
4. Cura di Recupero di pesce
- Tenere pesce in acqua pulita e ambiente poco affollate. Acqua sporca e affollamento sarà portare a infezioni e la morte involontaria. Cercate di mantenere non più di 6 pesci / 500 ml di acqua pesce e cambiare l'acqua ogni giorno, se possibile.
NOTA: Si tratta di un volume minimo per la conservazione di spazio o se il ricercatore desidera effettuare esperimenti utilizzando trattamenti farmacologici costosi. - Non date da mangiare il pesce fino a 3 giorni dopo l'infortunio. Pesce Recupero non mangeranno in un primo momento, e qualsiasi cibo nel serbatoio si decompongono e promuovere batteri growth. Partendo a 3 giorni dopo lesioni, alimentare una piccola quantità una volta al giorno.
5. Analisi di feriti Reni
- Per l'ibridazione in situ per l'espressione lhx1a mRNA, i reni possono essere raccolte da pesce timepoints desiderati. Eutanasia pesce in acqua tricaine su ghiaccio di almeno 10 minuti fino a quando il movimento branchia si arresta, quindi rimuovere la testa con una lametta e aprire la cavità del corpo e rimuovere gli organi interni con una pinza.
- Lasciare il rene a posto (organo pigmentato attaccato alla parete dorsale del corpo) e fissare il pesce in 4% paraformaldeide in PBS durante la notte. Sezionare il rene 15 e continuare con lo standard ibridazione in situ.
- Brevemente, lavare i reni in PBST (tampone fosfato 0,5% Tween 20), permeabilizzate con proteinasi K in PBST (10 ug / ml) per 1 ora a temperatura ambiente. Post-fissare con 4% paraformaldeide, e lavato ancora con PBST.
- Poi pre-ibridare i reni durante la notte a 68; ° C in tampone di ibridazione (50% formammide, 5x SSC, 50 ug / ml di eparina, 500 ug / ml tRNA, 0,1% Tween20, pH 6,0).
- Incubare i campioni con digossigenina marcato sonda nel tampone di ibridazione, quindi lavare per 5-10 min ciascuno con 100%, 75%, 50%, 25% tampone di ibridazione a 68 ° C, poi si trasferisce a temperatura ambiente e lavata due volte per 30 min con 2x SSC con 0,1% Tween20, e lavare due volte per 30 min con 0.2x SSC con 0,1% di Tween20.
- Equilibrare campione 3x 5 min a MAB (0,1 M di acido maleico, 0,15 M di NaCl, pH 7,5) e bloccate notte a 4 ° C in MAB con siero di capra 10%. Poi incubare i campioni durante la notte in anti-digossigenina-AP Fab 1: 5.000 a MAB.
- Lavare il 5x campione per 1 ora in MAB ed equilibrare 3x per 15 min a NTMT (0.1 M Tris pH9.5, 0,05 M MgCl 2, 0,01 M di NaCl, 50 microlitri Tween20).
- Poi trattare i reni con NBT / BCIP per rilevare il segnale. Fissare i reni con paraformaldeide al 4% e incubate in dimetilformammide a remove eccesso NBT / BCIP, sbiancato notte in acqua deionizzata. Lavare i reni e poi fotografare in PBST con il 50% di glicerolo sotto un vetrino.
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Representative Results
Infortunio gentamicina può essere confermata visivamente dall'osservazione di calchi epiteliali renali in acqua (Figura 1). Diverse dosi di gentamicina sono stati usati per danneggiare adulto tipo selvatico TuAB zebrafish, con conseguente aumento del numero di lhx1a + aggregati cellulari nel rene rigenerante (Figura 1A - D). Calchi bianche possono essere facilmente visibile in acqua 1 giorno dopo la lesione (Figura 1E - H). Una bassa dose di gentamicina ha provocato la maggior parte dei pesci aventi non calchi, mentre dosi più elevate hanno portato a oltre il 75% di pesce con calchi (Figura 1I). In tutti i gruppi, selezionando per i pesci con calchi portato ad un più alto livello medio del pregiudizio (Figura 1J).
Dopo conferma visiva di lesioni, pesci possono essere raggruppati e poi divisi in gruppi di controllo e di trattamento per esperimenti (Figura 2). Wildtype TuAB zebrafish adulti sono stati feriti con un 80mg / kg dose di gentamicina. Un giorno dopo l'infortunio, pesce con calchi sono stati selezionati, riunito e poi diviso in shock termico e gruppi shock termico. Pesci shock termico sono stati esposti a 37 ° C per 16 ore durante la notte e un periodo di riposo 8 ore a 28,5 ° C ogni giorno. A quattro giorni e 7 giorni pesce infortunio dopo sono stati fissati per l'intero monte ibridazione in situ e il livello di pregiudizio è stato valutato dalla densità di lhx1a + aggregati. Shock termico da solo non produce una risposta ferita (Figura 2A, D), ma scossa di calore accelera la risposta in pesci feriti rispetto ai controlli da shock termico (Figura 2B, C, G). Da 7 giorni dopo lesione non vi era una differenza significativa tra i gruppi danneggiati (Figura E, F, H).
<strong> Figura 1: Rigenerazione in risposta a danno renale acuto da gentamicina è dose dipendente (A - D) espressione LHX 1 un mRNA segna aggregati cellulari, che sono nuovi progenitori nephron.. (A) 7 giorni dopo l'iniezione di controllo ip, di tipo selvatico TuAB adulto zebrafish hanno normalmente aggregati cellulari in tutto rene 0-2 LHX 1a +. (B - D) 7 giorni dopo esposizione pesce iniezione gentamicina LHX molti aggregati cellulari 1a +, indicando la risposta neonephrogenesis.This robusti è dose dipendente, con alte concentrazioni di gentamicina conseguente più LHX 1 a + cluster. (E - H) 1 giorno dopo l'iniezione di gentamicina, pesce espellere calchi bianchi composti da tessuto epiteliale morti dai reni. (E) Una raccolta di calchi da un totale di 12 pesci che presentano la varietàdi forme e dimensioni. Si noti la differenza tra calchi bianche indicano lesioni rispetto al rosso-arancio salamoia digerito gamberetti. (F - H) Esempi di calchi raccolti da singoli pesci 1 giorno dopo lesioni permettendo l'acqua nel serbatoio di risolvere, pipettaggio il sedimento fuori e osservando al microscopio. (F) Escrementi senza calchi, indica l'assenza di lesioni da un pesce trattato con 40 mg / kg la dose. (G) di media grandezza che indica calchi ferita da un pesce trattato con 60 mg / kg la dose. (H) calchi più grandi con tessuto sloughed supplementare che indica ferita da un pesce trattato con 80 mg / kg la dose. (I) La percentuale dei pesci feriti con calchi viene aumentata a 60 mg / kg e 80 mg / kg. (J) Dopo 7 giorni, iniettato pesci sono stati trattati per montare tutto ibridazione in situ per valutare lesioni. Lhx1a + aggregati sono stati contati in una singola immagine 5x presa al più ampio point di ciascuna zona dei reni e dei reni è stata misurata utilizzando ImageJ. Numero medio di aggregati / mm 2 è indicata per ogni dose. In ogni caso, pesce con calchi aveva una media superiore rispetto al gruppo totale per ciascuna dose. p <0,5 per 40 mg / kg rispetto a 80 mg / kg. Barra di scala in AD = 0,2 mm, E = 1 mm, FH = 2 mm.
Figura 2:. Temperatura rigenerazione dipendente 24 ore dopo l'iniezione gentamicina, ferito tipo selvatico TuAB zebrafish adulto con calchi sono stati raggruppati e poi diviso in un gruppo di shock termico e nessun gruppo shock termico. I pesci sono stati mantenuti a 37 ° C per 16 ore durante la notte ogni notte dopo un periodo di riposo 8 ore a 28,5 ° C durante ogni giorno. (A, D) Controllo illeso pesce non ha espresso lhx1a dopo shock termico. (B, C) sh caloreock accelera la risposta di rigenerazione, con più cluster già apparendo a 4 giorni dopo l'infortunio, rispetto ai pesci feriti senza shock termico (p <0.5, test t). (E, F) Dopo 7 giorni, non vi è alcuna differenza significativa tra i pesci feriti trattati con shock termico e senza shock termico. (G, H) Quantificazione del danno contando lhx1a + aggregati per mm 2. Ogni punto rappresenta un singolo pesce. Numero di pesci e medio di risposta sono indicati sopra ogni gruppo. Barra di scala = 0.2 mm.
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Discussion
Il pesce zebra è ideale per studiare la rigenerazione di organi adulti tra cui il rene mesonefrico 6 adulti. Recenti studi hanno approfittato di marcatori molecolari e nuove linee giornalista transgenici per caratterizzare meglio i passaggi che si verificano durante la rigenerazione nefrone e quali le cellule potrebbero essere responsabili 7,12. Osservazione di calchi urinari è stata utilizzata da più di un secolo per diagnosticare la malattia del rene nell'uomo 16. Qui si usa la presenza di calchi come un indicatore semplice, non invasivo e l'inizio della misura del danno renale acuto dopo l'iniezione gentamicina. Osserviamo che i pesci che non producono calchi sono o solo leggermente feriti (e non formano nuovi nefroni) o troppo feriti per recuperare e di solito muoiono entro i primi 3 giorni. Pertanto, un passaggio critico all'interno del protocollo è l'osservazione individuale di pesce dopo la lesione, e la presenza di urinaria getta come indicatore di livelli adeguati di ferita. Vediamo anche espressione lhx1ain aggregati a partire da giorno 4 dopo l'infortunio. Questo indica che i primi 3 giorni dopo la lesione sono un periodo cruciale per il recupero.
Se un gran numero di pesci sono indenne, o troppi pesci stanno morendo nel corso dell'esperimento, controllare per assicurarsi che le iniezioni intraperitoneale sono stato fatto in modo corretto. Può essere utile per aggiungere un colorante non tossico come il rosso fenolo alla soluzione gentamicina per visualizzare eventuali perdite durante l'iniezione. Marcatura l'ago con un pennarello indelebile o un pezzo di nastro 2 mm dalla punta può servire come guida per impedire spingere l'ago troppo nel pesce. Inoltre, il dosaggio di gentamicina può essere necessario un aggiustamento. Iniettare pesce con un range di dosi gentamicina e testare i reni per l'espressione di mRNA lhx1a mediante ibridazione in situ o RT-PCR quantitativa.
Un limite di questa tecnica è che richiede alloggiamento singoli pesci durante la notte prima di selezionare feriti pesce persperimentazione. Per indagare primissimi eventi nella rigenerazione (entro le prime 24 ore dopo l'infortunio) pesce può avere bisogno di sottoporsi a trattamento sperimentale continuo, anche durante il periodo di osservazione individuale. Il costo del trattamento singoli pesci con farmaci, per esempio, può essere molto alta. La nostra tecnica è un miglioramento rispetto al metodo attuale di danno renale acuto con gentamicina, perché permette al ricercatore di eliminare valori anomali utilizzando un processo di screening non invasivo visivo. Questo modello di lesione solida, uniforme e riproducibile può ora essere utilizzato per testare efficacemente ipotesi sulla rigenerazione del rene nel zebrafish adulto.
Abbiamo osservato che, anche se la rigenerazione avviene sia in zebrafish maschio e femmina (tutti i dati riportati sono da femmine), la rigenerazione in risposta a iniezione gentamicina nei maschi è molto più variabile. Ciò può essere dovuto a motivi tecnici, perché i loro corpi sono lunghi, sottili e più muscolare, mentre le femmine hanno una molto più grande bElly con looser, pelle più sottile, permettendo facile iniezione e una cavità peritoneale più grande per accogliere i volumi di iniezione senza perdite. Una possibilità alternativa è che gli androgeni prodotti dai maschi possono avere qualche effetto sul processo di rigenerazione 17. Nachtrab et al. Hanno trovato che l'effetto di androgeni era ceppo dipendente, che indica che il background genetico possa modulare i livelli di androgeni. Lievi variazioni in background genetico dei pesci TuAB utilizzate nel nostro studio potrebbero spiegare la variabilità visto nei maschi, ma presumibilmente gli androgeni non sono l'unica fonte di variazione e altri loci genetici possono contribuire alla eterogeneità nella risposta al danno. Abbiamo anche scoperto che diverse linee transgeniche di zebrafish possono rispondere in modo diverso a lesioni gentamicina. Ad esempio, la Tg (Lhx1a: GFP) 12 linea nelle nostre mani richiede 120 mg / kg per l'induzione efficiente delle lesioni (dati non mostrati). Queste osservazioni evidenziano l'importanza di utilizzare sib dello stesso sessoling controlli in studi sui danni per minimizzare la variabilità sperimentale.
Molte linee transgeniche zebrafish utilizzare un promotore sensibile scossa di calore come mezzo per indurre l'espressione di un transgene. Poiché zebrafish sono poikilothermic e non regolare la loro temperatura corporea, sono costretti a svolgere funzioni fisiologiche alla temperatura del loro ambiente. Nel contesto di esperimenti usando il promotore hsp70 esprimere transgeni dominanti per modulare la risposta di rigenerazione, abbiamo inaspettatamente osservato che la risposta di rigenerazione è stato accelerato dalla temperatura più elevata. Pertanto, determinare l'effetto della temperatura sulla risposta di rigenerazione in un dato sistema diventa cruciale programmare i tempi di esperimenti (catturare il picco della risposta di rigenerazione per esempio) e rende il confronto alla rigenerazione a temperature normali problematici. Altri sistemi inducibili che utilizzano ad esempio CreERT e tamoxifene per l'induzione transgene può essere più adatto to studi di rigenerazione del rene adulto. Allo stesso modo, i metodi genetici recenti di induzione lesioni quali CreERT attivazione di transgeni tossici o lesioni inducibile utilizzando batterica nitroreduttasi / metronidazolo 18,19 amplierà la gamma delle possibili esperimenti per comprendere meglio neonephrogenesis e la rigenerazione del rene.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
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