Introduction
O rim é essencial para a homeostase dos fluidos, regulação da pressão arterial e filtragem de resíduos do corpo. Embora os mamíferos são capazes de reparar néfrons existentes após a lesão usando células epiteliais diferenciadas 1-4, eles parecem não ter um pool de células-tronco reservadas 5 e são incapazes de formar novos néfrons de novo. Em contraste com os mamíferos, peixes adultos são capazes de formar novas nefrónios ao longo da vida adulta para apoiar o crescimento dos peixes e, em resposta a uma lesão 6,7. O peixe-zebra, Danio rerio, é um organismo modelo de valor inestimável para o estudo da regeneração de órgãos 10/08 e tem o potencial de fornecer insights poderosos em aplicações de engenharia a reparação de rins humanos. A Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 foi mostrado para identificar um conjunto de células progenitoras no nefrónio do rim adulto zebrafish 12, no entanto, os mecanismos que controlam a resposta de células lhx1a + para r lesãoemain claro.
A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo amplamente utilizado com efeitos nefrotóxicos e ototóxicos conhecidos em humanos 13. Injeção intra-peritoneal de gentamicina é um método estabelecido de induzir lesão renal aguda em peixes 6. Esta lesão em peixes imita a perda de epitélio tubular e cicatrizes de glomérulos que ocorre em seres humanos após overdose de gentamicina 14. Indução de lesão no peixe-zebra por injecção de gentamicina é uma maneira conveniente de induzir uma resposta forte de regeneração, síncrona, com muitas novas nefrónios produzidos e procedendo em simultâneo através de estágios de formação, diferenciação e proliferação.
Este protocolo detalhes o nosso método de lesão robusta e reproduzível no peixe-zebra rim adulto, utilizando um processo de triagem visual não invasivo para minimizar valores atípicos. Nós tirar proveito do facto de que a lesão com gentamicina leva à morte do tecido renal epitelial e formatoion de moldes tubulares renais, que depois se acumulam em massas nas condutas mesonéfricos e cloaca. Estes são passados pelos peixes e pode ser observada visualmente na água. Isto permite-nos para triagem de peixe com forte lesão não-letal, que pode então ser combinadas para fazer novas experiências. Minimizando o número de peixes ou peixe ileso que morrem antes de chegar ao ponto final do experimento leva a mais uniforme e eficiente de coleta de dados e análise. Além disso, não são necessários dispositivos especiais ou reagentes, tornando este método custo-efetivo e adequado para uso em um ambiente acadêmico ou de ensino. Utilizando o nosso método, aqui mostram os efeitos de doses crescentes de gentamicina sobre a regeneração do rim, assim como o efeito do aumento da temperatura.
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Protocol
Declaração de Ética: NOTA: Todos os experimentos foram realizados de acordo com orientações Hospital Geral de Massachusetts para o uso de animais em pesquisa.
1. Preparação Prévia
- Determine quantas adulto zebrafish 6-12 meses de idade para ferir. Plano de ferir 10-20% mais peixes do que será necessário. A fim de minimizar a variabilidade, o uso combinado de peixe irmão idade criados em conjunto no mesmo tanque de modo que eles são aproximadamente do mesmo tamanho e têm menor variabilidade genética. Peixe fêmea são muito mais fáceis de injectar em comparação com o macho de peixe, devido à maior capacidade do abdómen. No entanto, os machos e as fêmeas dão resultados semelhantes.
- Ao fazer a experiência, pela primeira vez, traçar uma curva de dose para determinar a dosagem apropriada de gentamicina para uma estirpe específica de peixe. Testar cada novo lote de gentamicina antes do uso em experiências uma vez que a pureza de gentamicina varia de lote para lote. Dosagem adequada deve ser determinada pela avaliação expressisobre marcadores de prejuízo, tais como lhx1a. (Ver Figura 1A - D).
- Preparar a solução de gentamicina. Solução de estoque de gentamicina pode ser armazenado em -20 ° C e descongelada para utilização posterior. Por exemplo, para um 80 mg / kg (80 mg gentamicina / kg de peso corporal) num peixe pesando 0,5 g, preparar a 2 mg / ml de gentamicina em solução salina tamponada com fosfato como uma solução de trabalho conveniente. Isto proporciona uma 20 uL de gentamicina por injecção intraperitoneal no peixe.
NOTA: De um modo geral, 80-120 mg / kg de alcançar bons resultados, mas doses tão baixas quanto 40 mg / kg podem ser adequadas. Gentamicina também podem ser comprados em solução para minimizar a exposição perigosos para o pessoal de laboratório.
NOTA: Gentamicina em doses elevadas pode ser tóxico. Usar luvas e máscara quando pesando pó. - Prepare 100 ml de 0,016% tricaina água para anestesiar peixes. Preparar um estoque de tricaina (4 g / 1 L) dissolvido em água MilliQ estéril de 25x ajustar até pH 7 e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. Diluir 4 ml em 100 ml de água de peixe para uma concentração de trabalho de 0,016%.
NOTA: tricaina é um anestésico e pele irritante, usar luvas ao manusear. - Faça um peixe colher fora de uma pipeta de transferência de plástico cortando o bulbo em forma de colher e corte de 2 slots no fundo para drenar a água. Seringas de 1ml de carga (com 10 gradações ul) com a solução de gentamicina preparado e anexar uma agulha G 30½. Remova as bolhas de ar. Torça a agulha da seringa para se certificar de que a ponta angular sobre a agulha está enfrentando afastado e as marcas de seringa são voltadas para a frente e legível. Para injeções de controle, preparar uma seringa e agulha estéril com PBS.
- Prepare uma escala com uma superfície limpa ou pesar barco, bem como toalhas de papel para secar peixes e para a realização de peixes para injecção.
- Prepare pequenos recipientes individuais de meio litro com tampa para a realização de peixes para observação pós durante a noite injeção. As pequenas gaiolas transparentes acasalamento plástico são úteis para este fim. EstesOs contentores não deve ser branco - idealmente, devem ser claras para que os moldes epiteliais brancas derramadas pelos peixes podem ser observados numa bancada de preto. Encha cada recipiente com água peixe suficiente para os peixes a nadar confortavelmente.
2. Injecção Intraperitoneal de gentamicina
- Anestesiar os peixes em solução tricaina 0,016% em água peixe. Aguarde até que a taxa de ventilação branquial a abrandar e que o peixe já não respondem ao toque.
- Recolher o peixe usando a colher peixes, movendo-se de cabeça na direção da cauda, a fim de evitar ferir as guelras ou barbatanas. Coloque o peixe em papel toalha para absorver o excesso de água, girando o peixe fora suavemente em seu lado e sacuda o excesso de água do furo.
- Recolher o peixe novamente e colocá-lo no barco pesar na escala zerada e pesar o peixe. Redondo com a aproximação de 0,25 g, e calcular a quantidade adequada de gentamicina a injectar.
NOTA: Para uma 0,5 g de peixe usam uma injecção de 20 ul às 80 mg / kg dose. - Recolher o peixe novamente e coloque-o sobre uma toalha de papel dobrado seco. Se injetar com a mão direita, segure a toalha de papel na mão esquerda e coloque a cabeça do peixe apontando para a esquerda, com a barriga de fácil acesso.
- Segurar a seringa com a agulha com um ângulo de 45 ° para a pele do ventre, anterior para a cloaca. Empurrar a agulha debaixo da pele, então diminuir o ângulo e deslizar para a frente a agulha sob a pele, evitando os órgãos internos. Empurrar o êmbolo a quantidade adequada, pausa para garantir que nenhum líquido está saindo em torno da agulha, em seguida, retirar a agulha. Se segurando o peixe é um problema constante, cotovelos cinta contra o torso para estabilizá-los.
NOTA: Utilize luvas ao manusear solução de gentamicina. - Solte cada peixe em um recipiente individual. Observar os peixes e garantir a sua recuperação da anestesia. Manter os peixes a 28,5 ° C durante a noite.
NOTA: Se o peixe não reviver imediatamente, use um plástico transfer pipeta para irrigar água através de suas brânquias de reanimá-lo. - Utilizar a mesma seringa e agulha, aquando da injecção peixe múltiplos com a mesma dose de gentamicina. Elimine a seringa ea agulha usado para o recipiente de risco biológico farelos apropriado.
3. Publicar Injeção Observação de Lesão
- No dia seguinte (um dia após a lesão), coloque o peixe injetado em seu recipiente sobre uma superfície escura. Elencos brancas de tecido epitelial mortos excretado pelos peixes feridos devem ser visíveis. (Ver Figura 1E - H). Se não existem moldes, ou o peixe não foi lesionado por injecção de gentamicina (ou a dose é muito baixa, ou alguma da gentamicina vazado durante o processo de injecção) ou o peixe foi gravemente ferido, resultando em um bloqueio completo dos ureteres e da cloaca com tecido descartado.
NOTA: Se o peixe é incapaz de limpar os moldes de seu corpo, geralmente morrem dentro de 2-3 dias e é, portanto, inutilizáveis por mais tempoensaios. Se não há elencos são visíveis, eutanásia do peixe na água tricaina por imersão durante pelo menos 10 minutos após o movimento de emalhar pára. - Se elencos dos tecidos brancos são visíveis, defina o peixe de lado e continuar a verificar os outros peixes. Uma dose apropriada de gentamicina resultará em 80-90% de o peixe ser utilizável. A piscina do peixe ferido e, em seguida, divida-os em diferentes grupos de tratamento, se desejar.
4. Cuidados de Recuperação de Peixe
- Manter os peixes em água limpa e meio ambiente sem aglomeração. A água suja e aglomeração vai levar a infecções e morte não intencional. Tente manter não mais do que 6 peixes / 500 ml de água de peixe e trocar a água diariamente, se possível.
NOTA: Este é um volume mínimo para a conservação do espaço ou se o investigador deseja realizar experimentos usando tratamentos com medicamentos caros. - Não alimente o peixe até 3 dias após a lesão. Recuperando peixe não vai comer no início, e qualquer alimento no tanque vai se decompor e promover bactérias growth. A partir de 3 dias após o ferimento, alimentar uma pequena quantidade, uma vez por dia.
5. Análise de feridos Rins
- Para a hibridização in situ para a expressão do mRNA lhx1a, rins podem ser colhidas a partir de peixes em intervalo de tempo desejados. Euthanize peixe na água tricaina em gelo pelo menos 10 minutos até que o movimento de emalhar pára, em seguida, remover a cabeça com uma lâmina de barbear e abrir a cavidade do corpo e remover os órgãos internos com uma pinça.
- Deixar o rim no lugar (órgão pigmentada fixada na parede do corpo dorsal) e corrigir o peixe em paraformaldeído a 4% em PBS durante a noite. Dissecar o rim 15 e continuar com o padrão de hibridação in situ.
- Resumidamente, lavar os rins em PBST (solução salina tamponada com fosfato 0,5% de Tween 20), permeabilizadas com proteinase K em PBST (10 ug / ml) durante 1 hora à temperatura ambiente. Pós-corrigir com paraformaldeído a 4%, e lavou-se novamente com PBST.
- Em seguida, pré-hibridação dos rins durante a noite a 68; ° C em tampão de hibridação (formamida a 50%, 5x SSC, 50 ug / ml de heparina, 500 ug / ml de ARNt, 0,1% de Tween 20, pH 6,0).
- Incubar as amostras com digoxigenina marcado sonda em tampão de hibridação, em seguida, lavar durante 5-10 minutos cada, com 100%, 75%, 50%, 25% de tampão de hibridação a 68 ° C, em seguida, mudou-se para a temperatura ambiente e lava-se duas vezes durante 30 min com 2 x SSC com 0,1% de Tween 20, e lava-se duas vezes durante 30 min com 0,2x SSC com 0,1% de Tween20.
- Equilibrar a amostra 3x 5 min em MAB (0,1 M de ácido maleico, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) e bloqueadas durante a noite a 4 ° C em MAB com 10% de soro de cabra. Em seguida, incubar amostras durante a noite em anti-digoxigenina-AP Fab 1: 5.000 em MAB.
- Lava-se a 5x amostra durante 1 h em MAB, e equilibrar 3x durante 15 minutos em NTMT (0,1 M de Tris pH 9,5, 0,05 M de MgCl2, 0,01 M de NaCl, 50 uL de Tween 20).
- Em seguida, tratar os rins com NBT / BCIP para detectar o sinal. Corrigir os rins com paraformaldeído a 4% e incubadas em dimetilformamida a remove excesso de NBT / BCIP, branqueada durante a noite em água deionizada. Lavar os rins e, em seguida, fotografar em PBST com 50% de glicerol sob uma lamela.
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Representative Results
Lesão de gentamicina pode ser confirmado visualmente pela observação de moldes epiteliais renais em água (Figura 1). Diferentes doses de gentamicina foram usadas para ferir adulto zebrafish wildtype TuAB, resultando em um número crescente de lhx1a + agregados celulares no rim regeneração (Figura 1A - D). Gesso branco pode ser facilmente visto na água um dia após a lesão (Figura 1E - H). Uma baixa dose de gentamicina resultou na maior parte dos peixes que não tenham elencos, enquanto doses mais elevadas resultou em mais de 75% dos peixes tendo moldes (Figura 1-I). Em todos os grupos, a seleção para peixes com gesso resultou em uma média maior nível da lesão (Figura 1J).
Após a confirmação visual da lesão, os peixes podem ser combinadas e, em seguida, divididos em grupos de controlo e de tratamento para as experiências (Figura 2). Peixe-zebra adulto tipo selvagem TuAB ficaram feridas com um 80mg / kg de dose de gentamicina. Um dia após a lesão, peixe com elencos foram selecionados, reunidas e, em seguida, dividido em choque térmico e não há grupos de choque térmico. Peixes de choque térmico foram expostos a 37 ° C durante 16 horas durante a noite e um período de repouso de 8 horas a 28,5 ° C, a cada dia. Aos 4 dias e 7 dias pós lesão peixes foram fixados para toda montagem de hibridização in situ e nível da lesão foi avaliada pela densidade de lhx1a + agregados. O choque térmico por si só não produz uma resposta a uma lesão (Figura 2A, D), mas o calor acelera o choque de resposta em comparação com peixe lesionado não há controlos de choque térmico (Figura 2B, C, G). Por sete dias após a lesão já não havia uma diferença significativa entre os grupos lesionados (Figura E, F, H).
<strong> Figura 1: Regeneração em resposta à lesão renal aguda por gentamicina é dose-dependente (A - D) expressão LHX 1 mRNA uma marca agregados celulares, que são novos progenitores néfrons.. (A) 7 dias após a injeção ip controle, tipo selvagem TuAB adulto zebrafish têm normalmente 0-2 LHX 1a + agregados celulares em todo o rim. (B - D) 7 dias após a exibição de peixe injecção de gentamicina muitos LHX 1a + agregados celulares, indicando resposta neonephrogenesis.This robustos é dependente da dose, com maiores concentrações de gentamicina, resultando em mais LHX 1 a + clusters. (E - H) um dia após a injecção de gentamicina, peixes excretam moldes brancos constituídos por tecido epitelial mortos dos rins. (E) Uma coleção de moldes de um total de 12 peixes mostrando a variedadede formas e tamanhos. Observe a diferença entre moldes brancas indicando lesão em comparação com laranja-avermelhado salmoura digerido camarão. (M - H) Exemplos de moldes recolhidas de peixes individuais 1 dia após a lesão, permitindo que a água no tanque de resolver, a pipetagem do sedimento para fora e observação com um microscópio. (F) O excremento sem moldes, indicando nenhuma lesão a partir de um peixe tratado com a 40 mg / kg dose. (G) de tamanho médio moldes indicando a partir de uma lesão de peixe tratado com a 60 mg / kg dose. (H) elencos maiores com tecido descartadas adicional indicando lesão de um peixe tratado com a 80 mg / kg. (I) a percentagem de peixes feridos com gesso é aumentada a 60 mg / kg e 80 mg / kg. (J) Após 7 dias, os peixes foram injectados processado para o conjunto de montagem de hibridização in situ para avaliar a lesão. Lhx1a + agregados foram contadas num único quadro de 5x feita no mais amplo point de cada área de rim e rim foi medida utilizando o ImageJ. Número médio de agregados / mm 2 é mostrada para cada dose. Em cada caso, os peixes com moldes tinham uma média mais elevada do que o grupo total em cada dose. p <0,5 para 40 mg / kg em comparação com 80 mg / kg. Barra de escala na AD = 0,2 milímetros, E = 1 milímetro, FH = 2 mm.
Figura 2:. Temperatura regeneração dependente 24 horas após a injecção de gentamicina, ferido wildtype TuAB peixe-zebra adulto com modelos foram reunidas e, em seguida, divididos em um grupo de choque térmico e um no grupo de choque térmico. Os peixes foram mantidos a 37 ° C durante 16 horas durante a noite cada noite depois com um período de repouso de 8 horas a 28,5 ° C durante cada dia. (A, D) Controle de peixe ileso não expressou lhx1a após o choque térmico. (B, C) SH calorock acelera a resposta regenerativa, com mais agrupamentos já aparecendo aos 4 dias após a lesão em comparação com peixe feridas sem choque térmico (p <0,5, teste t de Student). (E, F) Após 7 dias, não há nenhuma diferença significativa entre os peixes feridas tratadas com choque térmico e nenhum choque de calor. (G, H) Quantificação de lesões por contagem lhx1a + agregados por mm 2. Cada ponto representa um peixe individual. Número de peixes e médio de resposta são indicados por cima de cada grupo. Barra de escala = 0,2 mm.
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Discussion
O peixe-zebra é ideal para estudar a regeneração de órgãos adultos, incluindo o rim adulto mesonephric 6. Estudos recentes têm se aproveitado de marcadores moleculares e novas linhas repórter transgénico para melhor caracterizar as etapas que ocorrem durante a regeneração de néfrons e quais as células podem ser responsáveis 7,12. Observação de cilindros urinários foi usado para mais de um século, para diagnosticar a doença renal em seres humanos 16. Aqui usamos a presença de cilindros como um indicador fácil, não invasivo e precoce da extensão da lesão renal aguda após a injecção de gentamicina. Observa-se que os peixes que não produzem moldes ou são apenas levemente ferido (e não formam novos néfrons) ou muito ferido para recuperar e geralmente morrem nos primeiros 3 dias. Portanto, um passo crítico no âmbito do protocolo é a observação individual de peixes após a lesão, e a presença de urinária lança como um indicador dos níveis adequados de ferimento. Vemos também expressão lhx1aem agregados começando no dia 4 após a lesão. Isto indica que os primeiros 3 dias após a lesão são um período crucial para a recuperação.
Se um grande número de peixes são ileso, ou muitos peixes estão morrendo durante o curso do experimento, certifique-se de que as injecções intraperitoneais estão sendo feitas corretamente. Pode ser útil adicionar um corante não tóxico, tal como vermelho de fenol na solução de gentamicina para visualizar qualquer fuga durante a injecção. Marcação da agulha com um marcador permanente ou um pedaço de fita de 2 mm da ponta pode servir como um guia para evitar empurrando a agulha demasiado para dentro do peixe. Além disso, a dosagem de gentamicina pode necessitar de ser ajustada. Injectar peixe com uma gama de doses de gentamicina e testar os rins para a expressão de ARNm lhx1a quer por hibridação in situ ou RT-PCR quantitativo.
A limitação dessa técnica é que ele requer habitação peixes individuais durante a noite antes de selecionar feridos peixe paraexperimentação. Para investigar eventos muito cedo na regeneração (nas primeiras 24 horas após a lesão) de peixe pode precisar se submeter a um tratamento experimental contínua, mesmo durante o período de observação individual. O custo do tratamento de peixes individuais com a droga, por exemplo, pode ser muito alta. A nossa técnica é uma melhoria sobre o método existente de lesão renal aguda usando gentamicina, porque permite que o investigador a eliminar valores extremos, utilizando um processo de triagem visual não invasiva. Este modelo de lesão sólida, uniforme e reprodutível pode agora ser usado eficazmente para testar hipóteses sobre a regeneração do rim do peixe-zebra adulto.
Observou-se que, embora a regeneração ocorre no peixe-zebra macho e fêmea (todos os dados apresentados aqui são de mulheres), a regeneração em resposta à injecção de gentamicina no sexo masculino é muito mais variável. Isto pode ser devido a razões técnicas, porque seus corpos são longos, finos e mais musculoso, enquanto as fêmeas têm um muito maior bElly com pele mais solto, mais fino, permitindo a injeção mais fácil e uma cavidade peritoneal maior para acomodar volumes de injecção sem fugas. Uma possibilidade alternativa é que os androgénios produzidos pelos homens pode ter algum efeito sobre o processo de regeneração 17. Nachtrab et al. Verificaram que o efeito dos androgénios foi estirpe dependente, o que indica que o fundo genético pode modular os níveis de androgênio. Ligeiras variações no fundo genético dos peixes TuAB usados em nosso estudo poderia explicar a variabilidade observada nos homens, mas, presumivelmente, os andrógenos não são a única fonte de variação e outros loci genéticos podem contribuir para a heterogeneidade na resposta à lesão. Descobrimos também que as diferentes linhas de peixes-zebra transgénicos podem responder de forma diferente a lesão gentamicina. Por exemplo, a Tg (Lhx1a: GFP) 12 linha nas nossas mãos requer 120 mg / kg para a indução eficaz da lesão (dados não mostrados). Estas observações ressaltam a importância da utilização sib do mesmo sexoling controla em estudos de lesão para minimizar a variabilidade experimental.
Muitas linhas de peixes-zebra transgénicos utilizar um promotor sensível choque de calor como um meio de induzir a expressão de um transgene. Desde peixe-zebra são poikilothermic e não regular sua temperatura corporal, eles são forçados a desempenhar funções fisiológicas à temperatura de seu ambiente. No contexto de experiências utilizando o promotor de hsp70 para expressar transgenes dominantes para modular a resposta regenerativa, observou-se inesperadamente que a resposta de regeneração foi acelerada pela temperatura mais elevada. Portanto, a determinação do efeito da temperatura sobre a resposta regenerativa em um dado sistema torna-se crucial a planear a temporização de experiências (capturar o pico da resposta de regeneração, por exemplo) e faz a comparação de regeneração a temperaturas normais problemáticos. Outros sistemas indut�eis utilizando por exemplo CreERT e tamoxifeno para a indução transgene pode ser mais adequado tO estudos de regeneração do rim adulto. Da mesma forma, métodos genéticos mais recentes de indução da lesão, como a ativação CreERT de transgenes tóxicos ou lesão induzível usando bacteriana nitroreductase / metronidazol 18,19 vai ampliar o leque de possíveis experimentos para entender melhor neonephrogenesis e regeneração renal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
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