Introduction
El riñón es esencial para la homeostasis de fluidos, la regulación de la presión arterial y la filtración de los residuos del cuerpo. Aunque los mamíferos son capaces de reparar nefronas existentes después de la lesión utilizando células epiteliales diferenciadas 1-4, que parecen carecer de una piscina de células madre reservadas 5 y son incapaces de formar nuevas nefronas de novo. En contraste a los mamíferos, peces adultos son capaces de formar nuevas nefronas largo de la vida adulta para apoyar el crecimiento de los peces y en respuesta a la lesión 6,7. El pez cebra, Danio rerio, es un organismo modelo de gran valor para el estudio de la regeneración de órganos 8-10 y tiene el potencial para proporcionar información de gran alcance en las aplicaciones de la ingeniería de la reparación de los riñones humanos. La Tg (Lhx1a: EGFP) transgén 11 se ha demostrado para etiquetar un conjunto de células progenitoras nefrona en el riñón adultos de pez cebra 12, sin embargo los mecanismos que controlan la respuesta de lhx1a + células a una lesión rEmain claro.
La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido ampliamente utilizado con efectos nefrotóxicos y ototóxicos conocidos en humanos 13. La inyección intraperitoneal de gentamicina es un método establecido de inducir lesión renal aguda en peces 6. Esta lesión en imita pescado la pérdida de epitelio tubular y la cicatrización de los glomérulos que se produce en los seres humanos después de la gentamicina sobredosis 14. La inducción de lesiones en el pez cebra por inyección de gentamicina es una manera conveniente de inducir una respuesta regeneración síncrono fuerte, con muchas nuevas nefronas producidos y de proceder simultáneamente a través de etapas de la formación, la proliferación y la diferenciación.
Este protocolo detalla nuestro método de lesión robusta y reproducible en el pez cebra riñón adulto mediante la utilización de un proceso de selección visual no invasiva para reducir al mínimo los valores atípicos. Aprovechamos el hecho de que las lesiones con gentamicina conduce a la muerte del tejido renal epitelial y formatoión de cilindros tubulares renales, que luego se acumulan en masas en los conductos mesonéfricos y cloaca. Estos son pasados por el pescado y se pueden observar visualmente en el agua. Esto nos permite a la pantalla para los peces con una fuerte lesión no letal, que luego pueden ser agrupados para su posterior experimentación. Reducir al mínimo el número de peces o no lesionado que mueren antes de llegar al punto final del experimento conduce a más uniforme y la recopilación de datos eficiente y análisis. Además, no se requieren dispositivos especiales o reactivos, por lo que este método rentable y adecuado para su uso en un entorno académico o la enseñanza. Usando este método, aquí mostramos las crecientes efectos de la dosis de gentamicina en la regeneración del riñón, así como el efecto del aumento de temperatura.
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Protocol
Declaración de Ética: NOTA: Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices del Hospital General de Massachusetts para el uso de animales en la investigación.
1. Preparación previa
- Determinar cuántos adultos de pez cebra 6-12 meses de edad para herir. Plan de lesionar 10-20% más pescado que se necesitará. Con el fin de minimizar la variabilidad, el uso edad igualada peces hermanos fueron criados en el mismo tanque de modo que son aproximadamente del mismo tamaño y tienen menos variabilidad genética. Hembras son mucho más fáciles de inyectar en comparación con el pez macho, debido a la mayor capacidad del abdomen. Sin embargo, los machos y las hembras dan resultados similares.
- Al hacer el experimento por primera vez, trazar una curva dosis para determinar la dosis de gentamicina apropiado para una cepa específica de pescado. Pruebe cada nuevo lote de gentamicina antes de su uso en los experimentos ya que la pureza de gentamicina varía de lote a lote. Una dosificación adecuada debe determinarse mediante la evaluación expressiel de los marcadores de lesiones tales como lhx1a. (Ver Figura 1 A - D).
- Prepare la solución de gentamicina. Solución madre de gentamicina puede ser almacenada en -20 ° C y se descongeló para su uso posterior. Por ejemplo, para un / kg dosis 80 mg (80 mg de gentamicina / kg de peso corporal) en un pez de pesaje 0,5 g, preparar 2 mg / ml de gentamicina en solución salina tamponada con fosfato como una solución de trabajo conveniente. Esto proporciona una 20 l de gentamicina para la inyección intraperitoneal en el pescado.
NOTA: En general, 80 a 120 mg / kg de lograr buenos resultados, pero dosis tan bajas como 40 mg / kg puede ser apropiado. La gentamicina también se puede comprar en solución para minimizar la exposición peligrosa para el personal de laboratorio.
NOTA: La gentamicina en dosis altas puede ser tóxico. Use guantes y máscara al pesar en polvo. - Preparar 100 ml de 0,016% de agua tricaína para anestesiar a los peces. Preparar un balance de 25x tricaína (4 g / 1 L) disuelto en agua estéril milliQ ajustar el pH a 7 y se almacena a 4 ° C hasta su uso. Diluir 4 ml en 100 ml de agua de pescado para una concentración de trabajo de 0,016%.
NOTA: tricaína es un irritante de anestesia y la piel, use guantes al manipular. - Haz un pez cucharada de una pipeta de transferencia de plástico mediante la reducción de la bombilla en forma de cuchara y cortar 2 ranuras en la parte inferior para drenar el agua. Jeringas de 1 ml de carga (con 10 l gradaciones) con la solución de gentamicina preparado y adjuntar una aguja G 30½. Eliminar las burbujas de aire. Gire la aguja de la jeringa para asegurarse de que la punta en ángulo de la aguja está de espaldas y las marcas de jeringas están mirando hacia adelante y legible. Para las inyecciones de control, preparar una jeringa y aguja con PBS estéril.
- Preparar una escala con una superficie limpia o pesar barco, así como toallas de papel para el secado de pescado y para la celebración de los peces para la inyección.
- Preparar pequeños contenedores de medio litro con tapas individuales para la celebración de los peces para la inyección de observación post durante la noche. Las pequeñas jaulas de apareamiento de plástico transparentes son útiles para este propósito. Estascontenedores no deben ser blanco - idealmente deben ser claros para que los elencos epiteliales blancas derramadas por los peces se pueden observar en un banco de copa negro. Llene cada recipiente con agua suficiente pescado para los peces para nadar cómodamente.
2. La inyección intraperitoneal de Gentamicina
- Anestesiar a los peces en solución tricaína 0,016% en agua los peces. Espere a que la tasa de ventilación de enmalle para frenar y para que los peces ya no responder al tacto.
- Recoja los peces usando la pala de pescado, pasando de la cabeza hacia la cola con el fin de evitar lesiones en las branquias o aletas. Coloque el pescado en toallas de papel para absorber el exceso de agua girando el pescado con cuidado en su lado y sacuda el exceso de agua de la primicia.
- Recoja los peces de nuevo y lo coloca en el barco pesando en la escala cero y pesar el pescado. Redondea a la 0.25 g más cercano, y calcular la cantidad apropiada de gentamicina para inyectar.
NOTA: Para un 0.5 g de pescado utiliza una inyección de 20 l al 80 mg / kg dosis. - Recoja los peces de nuevo y colóquela sobre una toalla de papel plegado seco. Si la inyección con la mano derecha, mantenga la toalla de papel en la mano izquierda y coloque la cabeza del pez señala a la izquierda, con el vientre de fácil acceso.
- Mantenga la jeringa con la aguja en un ángulo de 45 ° a la piel del vientre, anterior a la cloaca. Empuje la aguja debajo de la piel, a continuación, disminuir el ángulo y deslice la aguja hacia adelante bajo la piel, evitando los órganos internos. Presione el émbolo de la cantidad adecuada, hacer una pausa para asegurarse de que ningún líquido está saliendo alrededor de la aguja, y luego retire la aguja. Si la celebración de los peces es un problema constante, apoyando los codos contra el torso para estabilizar ellos.
NOTA: Use guantes al manipular la solución de gentamicina. - Caída de cada pez en un recipiente individual. Observar a los peces y asegurar su recuperación de la anestesia. Mantenga el pescado a 28,5 ° C durante la noche.
NOTA: Si el pescado no revive inmediatamente, use un trans plásticofer pipeta para regar agua a través de sus branquias de revivirlo. - Usar la misma jeringa y la aguja cuando la inyección de pescado múltiple con la misma dosis de gentamicina. Deseche la jeringa y aguja usada en el recipiente previsto apropiado.
3. Publicar Observación La inyección de Lesiones
- Al día siguiente (después de la lesión 1 día), coloque el pescado se inyecta en su contenedor sobre una superficie oscura. Yesos blancos de tejido epitelial muerta excretado por los peces heridos deben ser visibles. (Ver Figura 1E - H). Si no hay moldes, ya sea el pescado no estaba lesionado por la inyección de gentamicina (ya sea la dosis era demasiado baja, o algunos de la gentamicina se filtró durante el proceso de inyección) o el pescado estaba gravemente herido que resulta en un bloqueo completo de los uréteres y de cloaca con el tejido desprendido.
NOTA: Si el pescado no puede borrar los moldes de su cuerpo por lo general va a morir dentro de 2-3 días y por lo tanto inutilizable durante más tiempoensayos. Si no hay moldes son visibles, la eutanasia a los peces en el agua tricaína por inmersión durante al menos 10 minutos después detiene el movimiento de enmalle. - Si votas tejidos blancos son visibles, establezca el pescado a un lado y continuar revisando los otros peces. Una dosis adecuada de gentamicina resultará en el 80-90% de los peces de ser utilizable. Aunar los peces heridos y luego los divide en diferentes grupos de tratamiento si se desea.
4. Cuidado de pescado Recuperación
- Mantenga pez en el agua limpia y el medio ambiente con poca gente. El agua sucia y el hacinamiento dará lugar a infecciones y la muerte no intencional. Trate de mantener no más de 6 peces / 500 ml de agua peces y cambiar el agua diariamente si es posible.
NOTA: Este es un volumen mínimo para la conservación de espacio o si el investigador desea para llevar a cabo experimentos utilizando los tratamientos con fármacos caros. - No alimentar a los peces hasta 3 días después de la lesión. Recuperación de peces no comen en un primer momento, y cualquier alimento en el tanque se descomponen y promover bacterias growth. A partir de 3 días después de la lesión, alimentar a una pequeña cantidad una vez al día.
5. Análisis de Lesionados Riñones
- Para la hibridación in situ para la expresión de ARNm lhx1a, los riñones se pueden cosechar a partir de peces en puntos de tiempo deseados. La eutanasia pez en el agua tricaína en hielo al menos 10 minutos hasta que el movimiento de enmalle se detiene, luego retire la cabeza con una hoja de afeitar y abrir la cavidad del cuerpo y eliminar los órganos internos con fórceps.
- Deje el riñón en su lugar (órgano pigmentada unido a la pared dorsal del cuerpo) y fijar el pescado en 4% de paraformaldehído en PBS durante la noche. Diseccionar el riñón 15 y continuar con el estándar de hibridación in situ.
- Brevemente, lavar los riñones en PBST (tampón fosfato salino 0,5% de Tween 20), se permeabilizaron con proteinasa K en PBST (10 g / ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Post-fijar con paraformaldehído al 4%, y se lavó de nuevo con PBST.
- Entonces pre-hibridar los riñones durante la noche a 68; ° C en tampón de hibridación (50% formamida, 5x SSC, 50 mg / ml de heparina, 500 mg / ml tRNA, 0,1% de Tween 20, pH 6,0).
- Incubar las muestras con la sonda marcada con digoxigenina en tampón de hibridación, a continuación, lavar durante 5-10 min cada uno con 100%, 75%, 50%, 25% tampón de hibridación a 68 ° C, luego se trasladó a temperatura ambiente y lavar dos veces durante 30 min con 2x SSC con 0,1% de Tween 20, y lavar dos veces durante 30 min con 0,2 x SSC con 0,1% de Tween 20.
- Equilibrar la muestra 3x 5 min en el MAB (0,1 M de ácido maleico, NaCl 0,15 M, pH 7,5) y se bloquearon durante la noche a 4 ° C en el MAB con 10% de suero de cabra. Entonces incubar las muestras durante la noche en anti-digoxigenina-AP Fab 1: 5000 en MAB.
- Lavar el 5x muestra para 1 hr en MAB, y equilibrar 3x durante 15 min en NTMT (0,1 M Tris pH 9,5, 0,05 M MgCl 2, M NaCl 0,01, 50 l de Tween 20).
- Luego tratar los riñones con NBT / BCIP para detectar la señal. Fijar los riñones con paraformaldehído al 4% y se incubaron en dimetilformamida a remove exceso de NBT / BCIP, blanqueada durante la noche en agua desionizada. Lavar los riñones y luego fotografiar en SAFT con un 50% de glicerol bajo un cubreobjetos.
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Representative Results
Lesión gentamicina puede ser confirmada visualmente por la observación de moldes epiteliales renales en el agua (Figura 1). Diferentes dosis de gentamicina se utilizaron para herir a adultos de pez cebra TUAB tipo salvaje, lo que resulta en un número creciente de lhx1a + agregados celulares en el riñón regeneración (Figura 1A - D). Yesos blancos pueden verse fácilmente en el agua 1 día después de la lesión (Figura 1E - H). Una dosis baja de gentamicina resultó en la mayoría de los peces que no tienen moldes, mientras que dosis más altas resultaron en más del 75% del pescado que tiene moldes (Figura 1I). En todos los grupos, la selección de los peces con elencos dio lugar a un nivel de daño promedio más alto (Figura 1J).
Después de la confirmación visual de la lesión, los peces pueden ser agrupados y luego se dividieron en grupos de control y tratamiento para los experimentos (Figura 2). Wildtype TUAB pez cebra adultos resultaron heridos con un 80mg / kg dosis de gentamicina. Un día después de la lesión, se seleccionaron los peces con los moldes, se juntaron y luego se dividió en choque térmico y no hay grupos de choque térmico. Peces de choque de calor fueron expuestos a 37 ° C durante 16 horas durante la noche y un período de descanso 8 horas a 28,5 ° C cada día. A los 4 días y 7 días después de la lesión de pescado se fija para todo el montaje hibridación in situ y el nivel de la lesión fue evaluada por la densidad de lhx1a + agregados. Heat shock sola no produce una respuesta de la lesión (Figura 2A, D), pero de choque térmico acelera la respuesta en los peces lesionados en comparación con los controles no hay choque térmico (Figura 2B, C, G). A los 7 días después de la lesión ya no había una diferencia significativa entre los grupos lesionados (figura E, F, H).
<strong> Figura 1: Regeneración en respuesta a una lesión renal aguda por gentamicina es dependiente de la dosis (A - D) la expresión LHX 1 un ARNm marca agregados celulares, que son nuevos progenitores nefrona.. (A) 7 días después de la inyección de control de IP, tipo salvaje TUAB adultos de pez cebra tienen normalmente 0-2 LHX 1a + agregados celulares en todo el riñón. (B - D) 7 días después de la inyección de pescado pantalla gentamicina muchos LHX 1a + agregados celulares, lo que indica la respuesta neonephrogenesis.This sólidos depende de la dosis, con mayores concentraciones de gentamicina que resulta en más LHX 1 a + clusters. (E - H) 1 día después de la inyección de gentamicina, peces excretan yesos blancos consisten en tejido epitelial muertos desde los riñones. (E) Una colección de moldes de un total de 12 peces mostrando la variedadde formas y tamaños. Tenga en cuenta la diferencia entre los moldes blancos que indican lesión en comparación con naranja rojizo salmuera digerido camarón. (F - H) Ejemplos de moldes recogidos de peces individuales 1 día después de la lesión por permitiendo que el agua en el tanque para asentarse, pipeteando el sedimento y la observación bajo un microscopio. (F) Excrement sin moldes, indicando que no hay lesión de un peces tratados con la 40 mg / kg dosis. (G) de tamaño mediano moldes de lo que indica una lesión de un pez tratado con la de 60 mg / kg. (H) moldes más grandes con el tejido desprendido adicional que indica una lesión de un pez tratado con la de 80 mg / kg. (I) El porcentaje de peces heridos con elencos se incrementa a 60 mg / kg y 80 mg / kg. (J) Después de 7 días, inyecta peces fueron procesadas para todo el montaje hibridación in situ para evaluar la lesión. Lhx1a + agregados fueron contados en una sola imagen 5x tomada en la po más ampliaint de cada zona de los riñones y el riñón se midió usando ImageJ. Número medio de los agregados / mm 2 se muestra para cada dosis. En cada caso, el pescado con elencos tenían un promedio más alto que el total del grupo en cada dosis. p <0,5 para 40 mg / kg en comparación con 80 mg / kg. Barra de escala en el año = 0,2 mm, E = 1 mm, FH = 2 mm.
Figura 2:. La regeneración depende de la temperatura de 24 horas después de la inyección de gentamicina, heridos TUAB tipo salvaje pez cebra adulto con elencos se agruparon y luego se dividió en un grupo de choque térmico y un grupo sin choque térmico. Los peces se mantuvieron a 37 ° C durante 16 horas cada noche durante la noche después con un período de reposo 8 horas a 28,5 ° C durante cada día. (A, D) Control ileso peces no expresaron lhx1a después de choque térmico. (B, C) sh Heatock acelera la respuesta de regeneración, con más grupos ya que aparece a los 4 días después de la lesión en comparación con los peces heridos sin choque térmico (p <0,5, la prueba t de Student). (E, F) Después de 7 días, no hay ninguna diferencia significativa entre los peces lesionado tratado con choque térmico y no de choque térmico. (G, H) Cuantificación de la lesión mediante el recuento lhx1a + agregados por mm 2. Cada punto representa un pez individual. Número de pescado y de respuesta promedio se indican por encima de cada grupo. La barra de escala = 0,2 mm.
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Discussion
El pez cebra es ideal para el estudio de la regeneración de órganos adultos incluyendo el adulto riñón mesonéfrico 6. Estudios recientes han aprovechado de marcadores moleculares y nuevas líneas reportero transgénicos para caracterizar mejor los pasos que se dan durante la regeneración de nefronas y lo que las células podrían ser responsables 7,12. Observación de desechos urinarios se ha utilizado durante más de un siglo para diagnosticar la enfermedad renal en humanos 16. Aquí se utiliza la presencia de elencos como un indicador fácil, no invasivo y principios de la extensión de la lesión renal aguda después de la inyección de gentamicina. Observamos que los peces que no producen moldes son o bien sólo ligeramente heridos (y no se forman nuevas nefronas) o demasiado lesionado para recuperarse y por lo general mueren dentro de los primeros 3 días. Por lo tanto, un paso crítico dentro del protocolo es la observación individual de pescado después de la lesión, y la presencia de urinario arroja como un indicador de los niveles de daño adecuados. También vemos la expresión lhx1aen los agregados a partir de 4 días después de la lesión. Esto indica que los primeros 3 días después de la lesión son un período crucial para la recuperación.
Si un gran número de peces son ileso, o demasiados peces están muriendo durante el transcurso del experimento, asegúrese de que las inyecciones intraperitoneales se están haciendo correctamente. Puede ayudar a añadir un colorante no tóxico como el rojo fenol a la solución de gentamicina para visualizar cualquier fuga durante la inyección. Marcado de la aguja con un marcador permanente o una pieza de cinta de 2 mm de la punta puede servir como una guía para evitar empujando la aguja demasiado lejos en el pescado. Además, puede ser necesario ajustar la dosis de gentamicina. Inyectar pescado con una gama de dosis de gentamicina y probar los riñones para la expresión de mRNA lhx1a ya sea por hibridación in situ o RT-PCR cuantitativa.
Una limitación de esta técnica es que requiere una vivienda peces individuales durante la noche antes de seleccionar peces heridos porexperimentación. Para investigar acontecimientos muy tempranas en la regeneración (dentro de las primeras 24 horas después de la lesión) de pescado puede que tenga que someterse a un tratamiento experimental continua, incluso durante el período de observación individual. El costo del tratamiento de peces individuales con fármacos, por ejemplo, puede ser muy alta. Nuestra técnica es una mejora sobre el método existente de la lesión renal aguda usando gentamicina, porque permite que el investigador para eliminar valores atípicos mediante la utilización de un proceso de selección visual no invasiva. Este modelo de lesión sólida, uniforme y reproducible ahora se puede utilizar para probar hipótesis acerca eficazmente la regeneración renal en el pez cebra adulto.
Hemos observado que, aunque la regeneración se produce tanto en el pez cebra macho y hembra (todos los datos mostrados aquí son de hembras), la regeneración en respuesta a la inyección de gentamicina en los hombres es mucho más variable. Esto puede ser debido a razones técnicas, ya que sus cuerpos son largos, delgados y más musculoso, mientras que las hembras tienen una mucho más grande belly con más flojo de la piel, más delgado, lo que permite la inyección de más fácil y una cavidad peritoneal más grande para acomodar los volúmenes de inyección sin fugas. Una posibilidad alternativa es que los andrógenos producidos por los machos pueden tener algún efecto sobre el proceso de regeneración 17. Nachtrab et al. Encontró que el efecto de los andrógenos era dependiente de la cepa, lo que indica que los antecedentes genéticos podrían modular los niveles de andrógenos. Pequeñas variaciones en el fondo genético de los peces TUAB utilizados en nuestro estudio podrían explicar la variabilidad observada en los varones, pero se supone que los andrógenos no son la única fuente de variación y otros loci genéticos pueden contribuir a la heterogeneidad en la respuesta a la lesión. También hemos encontrado que los diferentes líneas transgénicas de pez cebra pueden responder de manera diferente a la lesión gentamicina. Por ejemplo, la Tg (Lhx1a: GFP) 12 línea en nuestras manos requiere 120 mg / kg para la inducción eficiente de la lesión (datos no mostrados). Estas observaciones ponen de relieve la importancia de la utilización de hermanos del mismo sexoling controla en los estudios de lesiones para minimizar la variabilidad experimental.
Muchas líneas transgénicas de pez cebra utilizan un promotor sensible de choque térmico como un medio para inducir la expresión de un transgén. Desde el pez cebra son poiquilotermos y no regulan su temperatura corporal, se ven obligados a realizar funciones fisiológicas a la temperatura de su entorno. En el contexto de experimentos utilizando el promotor de hsp70 para expresar transgenes dominantes para modular la respuesta de regeneración, se observó inesperadamente que la respuesta de regeneración se acelera por temperatura más alta. Por lo tanto, la determinación del efecto de la temperatura sobre la respuesta de la regeneración en un sistema dado se convierte en crucial para la planificación de la temporización de experimentos (que capturan el pico de la respuesta de regeneración por ejemplo) y hace que la comparación a la regeneración a temperaturas normales problemáticos. Otros sistemas inducibles utilizando por ejemplo CreERT y tamoxifeno para la inducción de transgenes pueden ser más adecuados testudios o de regeneración de riñón adulto. Del mismo modo, los métodos genéticos más recientes de la inducción de lesiones tales como la activación CreERT de transgenes tóxicos o lesiones inducible utilizando bacteriana nitrorreductasa / metronidazol 18,19 ampliará la gama de posibles experimentos para entender mejor neonephrogenesis y regeneración renal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
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