Introduction
Böbrek vücuttan akışkan homeostazı, kan basıncı düzenleme ve atık, süzme için gereklidir. Memeliler yaralanma farklılaşmış epitel hücreleri 1-4 kullandıktan sonra mevcut nefron onarmak için mümkün olsa da, ayrılmış kök hücrelerin 5 havuzu eksikliği gibi görünüyor ve yeni nefron de novo oluşturmak mümkün değildir. Memelilerde aksine, yetişkin balık yaralanma 6,7 balık büyümesini ve karşılık olarak desteklemek için yetişkin yaşam boyunca yeni nefron oluşturabildiği. Zebra balığı, Danio rerio, organ rejenerasyonu 8-10 çalışma için paha biçilmez bir model organizmadır ve insan böbrekler onarımı mühendislik uygulamaları içine güçlü anlayışlar sağlama potansiyeline sahiptir. Tg (Lhx1a: EGFP) transgen Bununla birlikte, 11, yetişkin zebrabalıkları böbrek 12 yaralanma R + hücrelerinin lhx1a tepkisini kontrol eden mekanizmaların nefron progenitör hücrelerin bir havuz etiket gösterilmiştirbelirsiz Emain.
aminoglikozid gentamisin insanlarda 13 bilinen nefrotoksik ve ototoksik etkileri ile yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Gentamisin intraperitoneal enjeksiyon balık 6 akut böbrek hasarı uyaran bir yöntemdir. Balık taklit Bu yaralanma tübüler epitel ve doz aşımı 14 gentamisin sonra insanlarda meydana glomerül yara kaybı. Gentamisin enjeksiyonu ile Zebra balığı yaralanma uyaran üretilen birçok yeni nefron ile güçlü, senkron rejenerasyon yanıtı uyaran ve aynı zamanda oluşumu, çoğalma ve farklılaşma aşamalarından geçerek geçmeden uygun bir yoldur.
Bu protokol aykırı aza indirmek için noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak yetişkin zebrafish böbrek sağlam ve tekrarlanabilir yaralanma için yöntem ayrıntıları. Biz gentamisin ile yaralanma epitel böbrek dokusu ve biçimi ölümüne yol açtığı gerçeğini yararlanmakDaha sonra mezonefrik kanalları ve cloaca kitleler halinde birikir renal tübüler atmalarını, ion. Bu balıklar tarafından iletilir ve su içinde görsel olarak gözlenebilir. Bu bize daha sonra deneyler için toplanmış olabilir güçlü ölümcül olmayan yaralanma ile balık ekrana verir. Onlar deneyin bitiş daha düzgün ve verimli veri toplama ve analizi yol açar ulaşmadan önce ölmek yaralanmamış balık ya da balık sayıları en aza indirilmesi. Buna ek olarak, özel cihazlar veya reaktif akademik veya öğretim ortamında kullanılmak üzere bu yöntem maliyet-etkin ve uygun hale gereklidir. Bizim yöntemi kullanarak, burada böbrek rejenerasyonu üzerine gentamisin dozu artan etkileri yanı sıra artan sıcaklığın etkisini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Etik Beyanı: Bütün deneyler, araştırmada hayvan kullanımı için Massachusetts General Hastanesi esaslara uygun olarak yapılmıştır.
1. Ön Hazırlık
- Kaç yetişkin zebrabalıkları 6-12 aylık yaralama belirleyin. Plan gerekli olacak% 10-20 daha fazla balık yaralama. Değişkenliği en aza indirmek için, kullanımı yaşı kabaca aynı boyutta ve daha az genetik değişkenlik için, aynı tankın birlikte yetiştirilen eş balık eşleşti. Kadın balık nedeniyle karnın geniş kapasiteli, erkek balıkların göre enjekte çok daha kolay. Ancak, erkekler ve dişiler benzer sonuçlar verir.
- İlk kez deney yaparken, balık belirli bir suş için uygun olan gentamisin dozajı belirlemek için bir doz eğri çizilir. Gentamisin saflık partiden partiye değişiklik beri deneylerde kullanılmadan önce gentamisin her yeni toplu test edin. Uygun bir dozaj expressi değerlendirerek belirlenmelidirBöyle lhx1a olarak yaralanma belirteçlerin üzerinde. (- D Şekil 1A bakınız).
- Gentamisin çözüm hazırlayın. Gentamisin stok çözeltisi, -20 ° C'de saklanır ve daha sonraki kullanım için çözülmüş olabilir. Örneğin, 0.5 g ağırlığındaki bir balık, bir 80 mg / kg dozda (vücut ağırlığı 80 mg gentamisin / kg) için, uygun bir çalışma çözeltisi olarak fosfat tamponlu tuzlu su içinde gentamisin 2 mg / ml hazırlar. Bu balıklara intraperitonal enjeksiyon için gentamisin 20 ul içerir.
Not: Genellikle, 80-120 mg / kg uygun olabilir, 40 mg / kg kadar düşük iyi sonuçlar fakat dozlar elde edin. Gentamisin ayrıca laboratuvar personeline tehlikeli maruziyeti en aza indirmek için çözelti içinde satın alınabilir.
NOT: Yüksek dozlarda Gentamisin toksik olabilir. Eldiven giyin ve toz ağırlığında zaman maske. - Balık anestezi için% 0.016 tricaine 100 ml su hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C de pH = 7 ve saklamak için ayarlama steril MiliQ suyu içinde çözülmüş tricaine (4 g / 1 L) içindeki bir 25x stok hazırlayın. 4 m seyreltin0.016% bir çalışma konsantrasyonu balık, 100 ml su içinde l.
NOT: işlerken Tricaine bir anestezik ve cildi tahriş olduğunu eldiven giyin. - Bir balık, bir kepçe şekline ampul kesme ve suyun tahliye edilmesi alt 2 yuva keserek plastik bir transfer pipet dışarı kepçe olun. Hazırlanan gentamisin çözeltisi (10 ul geçişleri ile) Yük 1ml şırınga ve bir 30½ G iğne takılır. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Iğne ucu açılı dönük ve şırınga işaretleri ileri ve okunabilir karşı karşıya olduğundan emin olmak için şırınga iğne bükün. Kontrol enjeksiyonları için steril PBS ile bir şırınga ve iğne hazırlar.
- Temiz bir yüzeye sahip bir ölçek hazırlayın ya da balık kurutma ve enjeksiyon için balık tutmak için tekne yanı sıra kağıt havlu tartın.
- Gözlem gecede sonrası enjeksiyon için balık tutmak için kapaklı bireysel küçük yarım litrelik kapları hazırlayın. Küçük şeffaf plastik birleşme kafesleri, bu amaç için yararlıdır. Bunlarkonteynerler beyaz olmamalı - balık döken beyaz epitel yayınları siyah tezgah üstünde görülebilir, böylece ideal onlar açık olmalıdır. Balık rahat yüzmek için yeterli balık suyu ile her doldurun.
Gentamisin 2. intraperitoneal enjeksiyon
- Balık su içinde% 0.016 tricaine çözeltisi içinde balık anestezisi. Yavaş solungaç havalandırma oranı ve artık dokunmak yanıt balık bekleyin.
- Solungaçları veya yüzgeçleri zarar önlemek için kuyruk doğru baş hareket, balık kepçe kullanarak balık kadar Scoop. Yan yavaşça balık çevirerek fazla suyu emer ve kepçe aşırı su sıyrılmaya kağıt havlu üzerine balık yerleştirin.
- Yine balık kadar kepçe ve sıfırlanmış ölçekte tartmak tekne yerleştirin ve balık tartın. En yakın 0.25 g Yuvarlak ve enjekte etmek gentamisin uygun miktarda hesaplar.
NOT: 0.5 gr balık için 8 de bir 20 ul enjeksiyon kullanın0 mg / kg doz. - Yine balık kadar kepçe ve kuru katlanmış kağıt havlu üzerine koyun. Sağ elini kullanan enjekte ise, sol elinde kağıt havlu tutun ve karın kolayca erişilebilir olan balığın baş, solu gösteren yerleştirin.
- Kloakanın için karın cildine, anterior 45 ° açıyla iğne ile şırınga tutun. Derinin hemen altında iğneyi itin, ardından açıyı azaltmak ve iç organları kaçınarak, deri altında ileri iğne kaydırın. Daha sonra iğneyi geri çekme, hiçbir sıvı iğne etrafında geliyor emin olmak için duraklatmak, dalgıç uygun miktarda basınız. Balık sabit tutan bir sorun varsa, gövde karşı ayracı dirsekler, onları stabilize etmek.
NOT: gentamisin çözüm tutarken eldiven giyin. - Bağımsız bir kabın her bir balık bırakın. Balık gözlemlemek ve anestezi onun kurtarma sağlamak. 28.5 ° C balık gecede tutun.
NOT: Balık hemen canlandırmak etmezse, plastik trans kullanınkendi solungaçları onu canlandırmak genelinde ferin pipet su sulamak için. - Gentamisin aynı dozda çok balık enjekte ederken, aynı şırınga ve iğne kullanın. Uygun biohazard kesici kabına kullanılan şırınga ve iğne atınız.
Yaralanma 3. Mesaj Enjeksiyon Gözlem
- Ertesi gün (1 gün sonrası yaralanma), karanlık bir yüzeyde kendi kabında enjekte balık yerleştirin. Yaralı balıklar tarafından atılır ölü epitel doku Beyaz yayınları görünür olmalıdır. (- H Şekil 1E bakınız). Hiçbir yayınları, yoksa her iki balık gentamisin enjeksiyonu ile yaralanan olmadı (doz ya da çok düşük, ya da enjeksiyon işlemi sırasında sızan gentamisin bazı) veya balık ciddi üreterler ve kloakanın tam tıkanma sonucu yaralandı sloughed doku ile.
NOT: Balık genellikle 2-3 gün içinde ölecek olan vücuttan atmalarını temizlemek değiştiremiyor ve uzun süre bu nedenle kullanılamaz isetahlilleri. Hiçbir yayınları görünmüyorsa, solungaç hareketi durduktan sonra en az 10 dakika süreyle daldırarak tricaine suda balık euthanize. - Beyaz doku yayınları görünür durumdaysa, bir kenara balık ayarlamak ve diğer balık denetimi devam edin. Gentamisin Uygun bir doz kullanılabilir olan balık% 80-90 neden olur. Yaralı balık havuzu ve daha sonra istenirse farklı tedavi grupları bölebilirsiniz.
Kurtarma Balık 4. Bakım
- Temiz su ve uncrowded ortamda balık tutmak. Kirli su ve kalabalık enfeksiyonları ve istenmeyen ölüme yol açacaktır. Mümkünse günlük su en fazla 6 balık / balık suyu 500 ml tutmak ve değiştirmeye çalışın.
NOT: Bu alan korunması için ya da araştırmacı pahalı ilaç tedavileri kullanarak deneyler yapmak isterse asgari birimdir. - 3 gün yaralanma sonrası kadar balık yem etmeyin. Kurtarma balıklar ilk yemek olmaz ve tank içinde herhangi bir gıda ayrıştırmak ve bakteri gr teşvik edeceğizowth. 3 gün sonra, hasardan başlayarak, günde bir kez az miktarda beslenir.
Yaralı Böbrekler 5. Analizi
- Lhx1a mRNA ifadesi için in situ hibridizasyon için, böbrekler istenilen zaman noktalarında balık hasat edilebilir. Gill hareketi duruncaya kadar buz üzerinde tricaine su içinde en az 10 dakika balık Euthanize, daha sonra, bir tıraş bıçağı ile baş kaldırmak ve vücut boşluğu açmak ve forseps ile iç organları çıkarın.
- Yer (dorsal vücut duvara bağlı pigmentli organı) olarak böbrek bırakın ve geceleme PBS içinde% 4 paraformaldehid balık düzeltin. Böbrek 15 inceleyin ve in situ hibridizasyon standart devam edin.
- Kısaca, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile PBST içinde proteinaz K (10 ug / ml) ile geçirgen PBST (Fosfat tamponlu tuzlu su,% 0.5 Tween 20) ile, böbrekler yıkayın. % 4 paraformaldehid ile Post-düzeltmek ve PBST ile tekrar yıkanır.
- Sonra 68 gece boyunca böbrekleri öncesi melezleşmeHibridizasyon tamponu (% 50 formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml tRNA,% 0.1 Tween20, pH 6.0) ° C'dir.
- Hibridizasyon tamponu içinde digoksigenin işaretli prob ile inkübe edin, daha sonra 68 ° C'de,% 100,% 75,% 50,% 25 hibritleme tamponu ile 5-10 dakika süreyle, her yıkama, daha sonra oda sıcaklığına kadar taşınır ve 30 dakika ile iki kez yıkayın 2x% 0.1 Tween20 ile SSC ve% 0.1 Tween20 ile 0.2X SSC ile 30 dakika boyunca iki kez yıkanır.
- MAB örnek 3x 5 dk (0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) ve% 10 keçi serumu ile MAB 4 ° C'de gece boyunca bloke dengelenmesi. Sonra, anti-digoksijenin-AP Fab 1 gecede örnekleri inkübe: 5,000 MAB.
- MAB 1 saat boyunca Örnek 5x yıkayın ve NTMT 15 dakika boyunca (0.1 M Tris pH 9.5, 0.05 M MgCI2, 0.01 M NaCI, 50 ul Tween 20) için 3 kez dengelenmesi.
- Ardından sinyali tespit etmek NBT / BCIP ile böbreklerin davranın. % 4 paraformaldehit ile böbrekler düzeltmek ve remo dimetilformamid kuluçkalanmıştıriyonu giderilmiş su içinde gece boyunca ağartılmış NBT / BCIP, fazla ve. Böbrekler yıkanır ve daha sonra bir lamel altında% 50 gliserol ile PBST içinde fotoğraf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gentamisin yaralanma suda böbrek epitel atmalarını gözlem (Şekil 1) ile görsel teyit edilebilir. Gentamisin farklı dozajlar rejenere böbrekte lhx1a + hücre agregatları (- D Şekil 1 A) artan sayıları ıle elde edilen yetişkin vahşi tipli TuAB zebrafish zarar için kullanılmıştır. Beyaz yayınları kolayca yaralanma sonrası su 1 gün (- H Şekil 1E) görülebilir. Yüksek dozlarda balık olan atmalarını (Şekil 1I)% 75 üzerinde sonuçlandı ise gentamisin düşük doz, hiçbir yayınları olan çoğu balık sonuçlandı. Tüm gruplarda, atmalarını ile balık seçerken daha yüksek bir ortalama yaralanma seviyesinin (Şekil 1J) sonuçlandı.
Yaralanma görsel onaydan sonra, balıklar havuza edilebilir ve daha sonra deneyler (Şekil 2) için kontrol ve tedavi gruplarına ayrıldı. Vahşitip TuAB yetişkin zebrabalıkları bir 80 ile yaralandımg / gentamisin kg doz. Yaralanma bir gün sonra, alçı balık, seçilen bir araya toplanmış ve daha sonra, ısı şoku ve bir ısı şoku gruba ayrılmıştır. Isı şok balık 16 gecede saat ve 28.5 ° C, her gün bir 8 saatlik dinlenme süresi boyunca 37 ° C'de maruz bırakıldı. 4 gün ve 7 gün sonrası yaralanma balıklara in situ hibridizasyon bütün montaj için tespit edildi ve yaralanma seviyesi lhx1a + agrega yoğunluğu ile değerlendirildi. Isı şoku yalnız bir yaralanma yanıt (Şekil 2A, D) üretmek değil, ama ısı şoku hiçbir ısı şoku kontrolleri (Şekil 2B, C, G) ile karşılaştırıldığında yaralı balıklarda yanıtı hızlandırır. 7 gün yaralanma sonrası yaralı gruplar (Şekil E, F, H) arasında anlamlı bir fark artık yoktu.
<strong> Şekil 1: gentamisin ile akut böbrek hasarına yanıt olarak Rejenerasyon doza bağlı (A - D) LHX 1 mRNA ifadesi yeni nefron atalarıdır hücresel agrega, işaretler.. (A) Kontrol ip enjeksiyonu, vahşi tipli TuAB yetişkin zebrabalıkları 7 gün sonra, normal olarak 0-2 LHX 1a + bütün böbrek hücre agregatları sahiptir. (B - D) 7 gün gentamisin enjeksiyon balık ekran birçok LHX 1a + hücresel agrega sonra, sağlam neonephrogenesis.This yanıtı gösteren daha LHX 1 + kümeler halinde ortaya çıkan gentamisin yüksek konsantrasyonlu, doza bağlı. (E - H) gentamisin enjeksiyonundan sonra 1 gün, balık böbrekler ölü epitel dokudan oluşan beyaz atmalarını salgılamak. (E) çeşitli gösteren 12 balık toplam atmalarını koleksiyonuşekil ve boyutlarda. Kırmızımsı-turuncu sindirilmiş tuzlu su karidesi kıyasla yaralanma gösteren beyaz atmalarını arasındaki farka dikkat edin. (F - H), yerleşmek için tanktaki su sağlayan çökeltileri dışarı pipetle ve mikroskop altında gözlemleyerek 1 gün yaralanma sonrası bireysel balık toplanan atmalarını örnekleri. 40 mg / kg dozu ile muamele edilmiş bir balıktan bir yaralanma gösteren bir kalıba (F) dışkı. (G) Orta 60 mg / kg dozu ile muamele edilmiş bir balıktan yaralanma gösteren döküntülerinin boyuttadır. (H) ek sloughed doku 80 mg / kg dozu ile tedavi edilen bir balık yaralanma belirtilerek Büyük kalıplar. (I) çarpıtmalarını yaralandı balık oranı 60 mg / kg ile 80 mg / kg artar. 7 gün sonra (J), balık yaralanma değerlendirmek için in situ hibridizasyon bütün montaj için işlendi enjekte etti. Lhx1a + agrega geniş po alınan tek 5x resimde sayıldıHer böbrek ve böbrek alanının int ImageJ kullanılarak ölçüldü. Agregaların ortalama sayısı / mm 2 ', her bir doz için gösterilmiştir. Her iki durumda da, alçı balık Her bir doz toplam grubundan daha yüksek bir ortalama vardı. 80 mg / kg ile karşılaştırıldığında p <0.5 40 mg / kg'dır. AD = 0.2 mm Ölçek çubuğu, E = 1 mm, FH = 2mm.
Şekil 2:. Atmalarını ile sıcaklık bağımlı rejenerasyon gentamisin enjeksiyondan sonra 24 saat, yaralı vahşi tip TuAB yetişkin zebrabalıkları toplanmış ve daha sonra bir ısı şoku grubu ve bir ısı şoku gruba ayrıldı. Balık, her gün boyunca 28.5 ° C'de 16 saatlik bir gece boyunca 37 ° C'de daha sonra 8 saat dinlenme periyodu ile her gece tutuldu. (A, D) Kontrol ısı şokundan sonra lhx1a ifade vermedi balık yara almadan kurtuldu. (B, C) ısı SHock fazla kümeler zaten yaralı ısı şoku olmadan balık (p <0.5, Student t-testi) ile karşılaştırıldığında yaralanma sonrası 4 gün görünen ile rejenerasyon yanıtı, hızlandırır. 7 gün sonra (E, F), ısı şoku ve ısı şoku ile tedavi yaralı balıklar arasında önemli bir fark yoktur. Mm2 başına lhx1a + agrega sayılarak yaralanma (G, H) belirlenmesi. Her nokta tek bir balık temsil eder. Balık ve ortalama cevap sayısı, her grup, yukarıda belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 0.2 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
zebra balığı yetişkin mezonefrik böbrek 6 dahil olmak üzere yetişkinlerdeki organların rejenerasyonu çalışmak için idealdir. Son çalışmalar daha nefron rejenerasyon sırasında meydana gelen adımları tanımlamak için moleküler belirteçlerin ve yeni transgenik muhabiri hatları avantaj almış ve 7,12 sorumlu neler hücreler olabilir. Idrar atmalarını Gözlem insanlarda 16 böbrek hastalığı teşhis etmek için bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Burada gentamisin enjeksiyondan sonra akut böbrek hasarının ölçüde bir, kolay invaziv olmayan ve erken göstergesi olarak atmalarını varlığı kullanın. Biz yayınları ya sadece hafif yaralanan üretemezler (ve yeni nefron oluşturmayan) kurtarmak için ya da çok yaralı ve genellikle ilk 3 gün içinde öldüğünü balık gözlemlemek. Bu nedenle, protokolün içinde kritik bir adımdır yaralanma sonrası balık bireysel gözlem ve üriner varlığı doğru yaralanma seviyeleri bir göstergesi olarak atmalarını. Biz de lhx1a ifadesini bakınızagrega yaralanma sonrası 4 gün başlayan. Bu yaralanmadan sonra ilk 3 gün kurtarma için çok önemli bir dönem olduğunu göstermektedir.
Balık çok sayıda yaralanmamış olan ya da çok fazla balık deney sırasında ölen varsa, periton enjeksiyonlar düzgün yapılıyor emin olmak için kontrol edin. Enjeksiyon sırasında herhangi bir sızıntıyı görselleştirmek için gentamisin çözeltisine fenol kırmızı gibi, toksik olmayan bir boya eklemek için yardımcı olabilir. Kalıcı bir işaretleyici veya ucundan bant 2 mm bir parça ile iğne İşaretleme balık içine çok iğne iterek önlemek için bir rehber olarak hizmet verebilir. Buna ek olarak, gentamisin dozaj ayarlanması gerekebilir. Gentamisin dozlar aralığı ile balık enjekte edilir ve in situ hibridizasyon veya nicel RT-PCR ya göre lhx1a mRNA ekspresyonu için böbrekler test edin.
Bu tekniğin bir sınırlama gece boyunca balık yaralı seçilerek önce konut, bireysel balık gerektirirdeney. Balık hatta bireysel gözlem döneminde sürekli deneysel tedavi altına gerekebilir (yaralanma sonrası ilk 24 saat içinde) rejenerasyon çok erken olayları incelemek. ilaç tek tek balık tedavi maliyeti, örneğin, çok yüksek olabilir. Araştırmacı noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak aykırı ortadan kaldırmak için izin verir, çünkü bizim teknik, gentamisin kullanarak akut böbrek hasarı mevcut yöntemine bir gelişmedir. Bu, sağlam üniforma ve tekrarlanabilir yaralanma modeli artık etkili bir yetişkin zebrafish böbrek rejenerasyon ile ilgili hipotezleri test etmek için kullanılabilir.
Biz rejenerasyon (burada gösterilen tüm veri kadın vardır) hem erkek hem de dişi zebrabalıkları gerçekleşmesine rağmen, erkeklerde gentamisin enjeksiyonuna yanıt yenilenmesi çok daha değişken olduğu görülmektedir. Kadın çok daha büyük bir b varken vücutları, uzun, ince ve daha kaslı olduğu için bu, teknik nedenlerden dolayı olabilirkolay enjeksiyon ve sızıntı olmadan enjeksiyon hacimleri karşılamak için daha büyük bir periton boşluğuna izin gevşek, ince deri ile elly. Alternatif bir olasılık erkekler tarafından üretilen androjenler rejenerasyon işlemi 17 bir etkiye sahip olmasıdır. Nachtrab ve ark. Androjenlerin etkisi genetik arka plan androjen düzeylerini modüle olabileceğini belirten, zorlanma bağımlı olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmada kullanılan TuAB balık genetik arka hafif varyasyonlar erkeklerde görülen değişkenliğin açıklayabilir, ancak muhtemelen androjenler yaralanmaya yanıt olarak heterojenlik katkıda bulunabilir varyasyon ve diğer genetik lokus tek bir yöntem değildir. Ayrıca zebrabalıkları farklı transjenik gentamisin yaralanma farklı yanıt bulmuşlardır. Örneğin, Tg (Lhx1a GFP) Elimizdeki 12 hattı hasarının etkili bir indüksiyon için 120 mg / kg gerekir (veri gösterilmemiştir). Bu gözlemler, aynı cinsiyetten SIB kullanmanın önemini vurgulamakling deneysel değişkenliği en aza indirmek için yaralanma çalışmalarında kontrol eder.
Birçok zebrabalıkları transjenik bir transjenin ekspresyonunu başlatmak için bir araç olarak, bir ısı şoku duyarlı bir promoter kullanılır. Zebra balığı poikilothermic ve kendi vücut ısılarını olmadığından, onların çevre sıcaklığında fizyolojik işlevleri gerçekleştirmek zorunda kalıyor. Yenilenmesi yanıtını modüle baskın transgenleri ifade hsp70 promotör kullanılarak deneyler bağlamda, beklenmedik bir şekilde yenilenmesi yanıtı daha yüksek bir sıcaklıkta hızlandırıldı görülmektedir. Bu nedenle, belirli bir sistem içinde yenilenmesi tepkisi üzerine sıcaklığın etkisini belirlemek deneyler zamanlamasını (örneğin yenilenmesi yanıtının tepe yakalama) planlaması için çok önemli hale gelir ve sorunlu, normal sıcaklıklarda rejenerasyonuna karşılaştırma yapar. Transgen indüksiyonu için örnek CreERT kullanılarak ve tamoksifen Diğer uyarılabilir sistemler daha uygun T olabilirYetişkin böbrek rejenerasyon o çalışmaları. Benzer şekilde, olası deneylerin aralığını genişletmek olacaktır bakteriyel nitroredüktaz / metronidazol 18,19 kullanarak bu tür toksik transgenlere veya uyarılabilir yaralanma CreERT aktivasyonu olarak yaralanma indüksiyon yeni genetik yöntemlerin daha iyi neonephrogenesis ve böbrek rejenerasyon anlamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30 G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1x PBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
