Summary
Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L'étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d'embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce.
Abstract
Échinodermes ont longtemps été un système de modèle de prédilection pour les études de reproduction et le développement, et plus récemment pour l'étude de la régulation des gènes et de l'évolution des processus de développement. L'étoile de mer, Patiria miniata, gagne prévalence comme un système modèle pour ces types d'études qui ont déjà été effectuées presque exclusivement dans les oursins, Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus. Un avantage de ces systèmes de modèles est la facilité de produire des embryons modifiés dans laquelle un gène donné est vers le haut ou régulée à la baisse, le marquage d'un groupe de cellules, ou l'introduction d'un gène rapporteur. Procédé de micro-injection unique est capable de créer une grande variété de ces embryons modifiés. Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des gamètes à partir de P. miniata, la production de zygotes, et l'introduction de réactifs perturbateurs par micro-injection. Embryons sains morphant sont ensuite isolés pour des études quantitatives et qualitatives de gefonction ne. La disponibilité de données sur le génome et du transcriptome pour cet organisme a augmenté les types d'études qui sont effectuées et la facilité de leur exécution.
Introduction
L'étoile de mer, Patiria miniata, (communément appelé l'étoile de chauve-souris) est en train de devenir un système de modèle intéressant et polyvalent pour une variété de cellules 1 à 3, de développement de 4,5, l'évolution de 6 à 8, et des études écologiques 9- 11. Adulte P. miniata sont répartis le long de la côte pacifique de Sitka, en Alaska à Baja, en Californie et 12 sont facilement maintenu dans les aquariums marins. Les ovocytes sont ronds obtenus l'année et chaque femelle peut perdre des dizaines de milliers d'œufs. Les ovocytes sont facilement maturation et fécondés à l'extérieur 13. Les embryons obtenus sont transparents permettant une observation facile; ils se développent de façon synchrone, et n'ont besoin que d'eau de mer pour le développement. Assemblage du génome entier et plusieurs transcriptomes sont également disponibles pour P. miniata ( Echinobase.org ). Ces avantages font la solution idéale pour un éventail de rechercheset à des fins d'enseignement.
Au cours des dernières années, P. miniata est devenu un système de modèle pour le réseau de régulation de gènes du développement des analyses du 14 au 16. Le but de ces études est d'identifier l'ensemble compliment de gènes régulateurs et de déterminer le réseau de leurs interactions. Une grande partie de ce travail implique l'expression des gènes perturbation par l'introduction d'oligonucléotides antisens ou en ARNm synthétisé in vitro. En outre, les analyses réglementaires cis sont utilisés pour caractériser la fonction de l'ADN réglementaire 15. Ces analyses nécessitent l'introduction de réactifs de perturbation et / ou de l'ADN reporter construit dans des embryons. En outre, afin de caractériser les effets en aval de ces perturbations, il faut doser de nombreux embryons pour les changements dans l'expression du gène de cibles potentielles. Les techniques de micro-injection de plusieurs centaines de zygotes sont au centre de ce travail.
Échinodermes, y compris P. miniata de novo à travers la micro-injection. Microinjection offre la possibilité de modifier les embryons avec des réactifs qui ne sont pas des cellules perméables. Le protocole suivant décrit un procédé pour introduire de l'ADN, de l'ARNm, des traceurs de cellules, et des oligonucleotides morpholino antisens dans des centaines d'oeufs fécondés dans une séance 2-3 h à travers la micro-injection. Ce produit suffisamment de matériau pour une série d'expériences en aval, y compris, mais sans s'y limiter, qPCR, hybridation in situ, l'ARN-Seq, et un transfert de Western en.
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Protocol
Gardez toute l'eau de mer ou eau de mer artificielle (SW), les animaux adultes, et les cultures à 15 ° C autant que possible. Veiller à ce que les œufs et les zygotes sont maintenus immergés dans le sud ouest.
Sels de mer préparés commercialement reconstituées avec de l'eau distillée ou d'osmose inverse sert bien comme une source de SW. Vérifiez la salinité aide d'un densimètre et ajuster sels ou d'eau pour obtenir un niveau optimal. Maintenir le niveau de densité entre 1,020 à 1,025. Gardez tout verre et en plastique distinct de tous les autres appareils de laboratoire pour éviter toute contamination par des produits chimiques. Clean embryon qualité du matériel de laboratoire d'un rinçage à l'eau désionisée ou de temps en temps de trempage dans de l'hypochlorite de sodium dilué suivi d'un rinçage à l'eau plusieurs fois.
1 Obtention et de maturation des gamètes de Patiria miniata adultes
- Sélectionner un animal pour exciser les gonades. Déterminer le sexe après l'excision par la recherche de la présence d'ovaires ou testicules car P. miniata ne sont pas en soixually dimorphisme.
- Couper une petite ouverture, ne dépassant pas 1 cm, le long du côté d'un bras de l'étoile de mer avec une lame de scalpel (Figure 1A). En utilisant de petites pinces à bouts ronds Tirez bords de l'incision pour accéder au tissu des gonades et tirez tissus des gonades à travers l'incision.
REMARQUE: Évitez de tirer sur le tissu intestinal, qui est un tissu gris ou brun lâche (figure 1B). Les ovaires sont généralement orange, jaune ou brun clair (figure 1C), tandis que les testicules sont de couleur blanche ou beige et quand perturbés provoquera l'eau de mer devienne laiteuse ou trouble en apparence (figure 1D). - Femelles Retour aux aquariums. Isoler les hommes pour une heure ou deux dans un conteneur de SW depuis le stress de manipulation peut provoquer la ponte. Animaux guérissent le long du site de l'incision et continuent de fournir des gamètes pendant plusieurs mois.
- Recueillir les testicules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec aussi peu que possible SW et stocker sur la glace jusqu'à utilisation. Magasin des testicules ne noused sur le jour du prélèvement à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.
- Recueillir des ovaires dans une petite boîte de culture de verre dans un plusieurs millilitres de SW. Pour libérer les ovocytes à partir du tissu des ovaires, démêler le tissu avec deux paires de pinces jusqu'à ce qu'il ne reste de gros morceaux.
REMARQUE: Dans l'idéal, la majorité des ovocytes sont pleinement développé. Ces ovocytes sont grands, ronds, et clair jaune ou brun clair avec une vésicule germinative distincte dans l'ovocyte (figure 2A), par rapport au sous-ensemble d'ovocytes sous-développés qui sont plus petits, brun, granuleux et opaque (figure 2B). Si plus de 25% des ovocytes sont de la variété développée, sélectionnez une femme différente pour obtenir des ovocytes. - Verser les ovocytes et le reste du tissu au moyen d'une cuvette de filtre à mailles avec une taille de pores de 200 um et recueillir s'écouler à travers. Celui-ci contiendra toutes les variétés d'ovocytes mais enlever le tissu ovarien. Déloger ovocytes restants du tissu pris par le filtre par pulvérisation wvec SW à partir d'un vaporisateur. Filtrer les coupes sont faites au moyen d'un tube conique de 50 ml (figure 3A-A ').
- Verser le débit à travers l'étape 1.6 par 100 um filtre à tamis tasse. Jetez les ovocytes dans l'écoulement à travers. Ovocytes grandes pleinement développés qui sont prêts pour la maturation va rester sur le filtre. Rincer les ovocytes dans un récipient propre bécher de 200 ml.
- Ajouter 95 ml de SW à 200 ml verre bécher d'ovocytes. Ajouter 5 ml de 200 uM de 1-méthyladénine pour une concentration finale de 10 uM.
- Transférer les ovocytes à un grand plat peu profond de la culture et le lieu à 15 ° C. Une grande aire de surface au volume boîte de culture permettant l'échange d'oxygène. Les ovocytes ne mûrissent pas ou ne peuvent pas bien se développer si elles sont surpeuplées pendant cette phase de maturation. Partagé en plusieurs plats du Sud-Ouest, plus de 10 uM 1-methlyadenine jusqu'à la culture est à moins de 200 ovocytes / ml.
- Autoriser les ovocytes de mûrir pour 45-90 min, mais pas plus que cela rendra les ovocytes sont incapables d'être fertilized. Pour déterminer si la maturation est terminée, regardez les ovocytes sous un microscope à dissection. Les mouvements de vésicules germinales vers et fusionne avec la membrane cellulaire pendant la maturation. Il se décompose alors et n'est plus visible dans les ovocytes matures (figure 2C) donc.
2. fécondation des ovocytes matures
- Choisissez un petit groupe de tissu testiculaire, à peu près la taille de pois, et la viande hachée dans une petite boîte de culture en verre avec environ 1 ml de SW.
- Utiliser une pipette Pasteur pour transférer 2-3 gouttes de l'eau de mer laiteuse résultante à environ 100 ml des ovocytes matures et agiter la boîte de culture à mélanger. Éviter de transférer des morceaux de tissu testiculaire. Évitez d'ajouter une plus grande quantité de sperme, car cela pourrait entraîner des Polyspermie du faible développement ultérieur.
- Après plusieurs minutes d'observer les ovocytes sous un microscope à dissection. Les œufs fécondés, ou zygotes, ont une enveloppe de fertilisation, qui est une bulle transparente qui se lève au large de la cell membrane (figure 2D).
REMARQUE: Ne pas procéder à la culture si moins de 90% des œufs féconder puisque les taux de fécondation pauvres sont une indication d'une culture malsaine qui peut aussi ne pas bien se développer. - Après la fécondation est terminée, modifiez le SW sur les zygotes en versant à travers un filtre de maille de 100 um et de rinçage dans une boîte de culture avec SW frais. Il est important d'enlever l'excès de sperme pour éviter la privation d'oxygène. Placer la boîte de culture à 15 ° C pendant 15 à 30 min.
3.-De gélifiant et d'aviron des ovocytes fécondés
- Préparer des plats d'injection en prenant le couvercle d'une boîte de Pétri de 60 x 15 mm de polystyrène.
- Tracez une ligne permanente de marqueur sur le dos de la boîte, autour de la zone qui correspond au champ de vue sur le microscope de la micro-injection. Cela garantit que tous les embryons sont ramé dans le champ de vision du microscope.
- Utiliser une pipette Pasteur en verre pour marquer une ligne à travers le cercle, preferably sur un côté du cercle (figure 3B). Utilisez cette ligne plus tard à casser les aiguilles d'injection (étape 4.5).
NOTE: Les réactifs couramment utilisés pour respecter les embryons d'oursins, par exemple, le sulfate de protamine ou poly-L lysine, sont inutiles. De-gelée P. zygotes miniata collent très bien au plastique non. Notez qu'ils ne collent pas bien à plats en verre.
- Ajouter environ 10 ml SW à chaque plat de sorte que la surface est couverte, mais l'eau ne sera pas éclabousser de façon excessive dans le plat, car cela pourrait perturber embryons Rama.
- Retirez le P. manteau zygote miniata de gelée avec SW acide avant l'aviron. Cette couche de gelée est plus étendu que celui observé pour les espèces d'oursins de mer modèle.
- Préparer l'acide SW dans la gamme de pH 4,0-4,2. Le pH est essentielle pour permettre l'élimination efficace de la couche de gelée tout en permettant un développement normal.
- Ajouter quelques gouttes uniques de 1 N (1 M) HCl dans SW à 1 L stocks de SW. Permettre à chaque goutte de mélanger complètementet contrôler le pH avant d'ajouter plus d'HCl.
REMARQUE: Une à plusieurs ml de résultats HCl de pH approprié, mais ne pas ajouter la totalité du volume à la fois.
NOTE: Préparer HCl 1 N dans une hotte avec SW et 12 N (12 M) HCl. - Retirer SW sur zygotes en les versant sur un filtre de maille de 100 um. Rincer dans un bécher de 200 ml dans la plus petite quantité de SW possible (environ 10 ml). Remplir le bécher de 150 ml avec SW acide (pH 4,0) et permettent les zygotes de s'asseoir dans le sud-ouest de l'acide pendant 3 min.
- Bande de revêtement de gelée des zygotes en versant, dans les deux sens entre deux béchers de 200 ml, à chaque fois le passage des zygotes à travers un filtre de maille de 200 um. Verser les zygotes à travers le filtre autour 5-10x plus sur une fenêtre de temps de 2 min.
- Retirer SW acide en versant les zygotes sur un filtre de maille de 100 um. Rincer les zygotes dans une petite boîte de culture en verre avec SW. Zygotes de-gelée peuvent s'en tenir à des plats en plastique. embryons de rang immédiatement; ils commencent à produire plus jmanteau elly qui conduit à une mauvaise adhérence à des plats en plastique dans le temps.
- Utilisez une bouche pipette (figure 3C-C ') pour ramasser les zygotes de la boîte de culture de verre et les placer dans les lignes droites sur les plats d'injection. Faire fondre le centre du côté mince d'une pipette Pasteur à la flamme jusqu'à ce que le verre est mou. Rapidement tirer les extrémités du verre en dehors de produire une très fine bande de verre. Une fois le verre est cool, rompre le petit bout de la pipette Pasteur (pour plus d'informations sur la préparation d'une pipette de bouche voir Wessel et al., 2004 17 ou Sweet et al., 2004 18).
- Faire une pipette à rames tel que le diamètre est juste plus grand que le diamètre des embryons de sorte que seulement un seul zygote va entrer et sortir de la pipette à la fois. Cela permettra à une seule ligne à la forme. Pipettes de plus petit diamètre peuvent dépouiller l'enveloppe de fertilisation et de perturber les zygotes que P. zygotes miniata n'ont pas de membrane hyaline une sont assez doux.
- Si les zygotes ne collent pas à la boîte de plastique, gardez-les pour plus de temps dans le sud ouest de l'acide (jusqu'à plusieurs minutes). Alternativement, une pipette de plus petit diamètre peut aider à enlever couche de gelée pour permettre les zygotes de coller plus efficacement.
- Les zygotes sont légèrement flottabilité positive et ont tendance à flotter ou planer juste au-dessus du fond du plat. Dans ce cas, la position de la pipette de telle sorte que les rames zygotes sont pressées en douceur sur la surface du plat à leur sortie de la pipette (figure 3D).
REMARQUE:. C'est permis de monter le nombre de lignes sur ces plats P. membranes embryonnaires miniata ne deviennent pas plus difficile à pénétrer au fil du temps et par conséquent on peut injecter des centaines de zygotes sur un plat unique.
4. injection de zygotes
- Préparer des solutions d'injection avec des concentrations appropriées d'oligonucléotides antisens morpholino (MASO), ARNm, ou ADN dans une concentration finalentration de KCl 200 mM. 400-800 uM MASO et 2,5 ng / pl d'ADN ont tendance à produire des phénotypes morphant tout en minimisant la toxicité. La concentration finale dans l'oeuf 1/125 ème sera la concentration de départ 14. Pour les solutions injectables contenant Masos, de la chaleur à 65 ° C pendant 5 min immédiatement avant d'utiliser et de stocker à la température ambiante.
- Pour la facilité de tri embryons injectés, ajouter rhodamine dextrane traceur à la solution d'injection pour obtenir une concentration de 0,1%.
- Préparer des aiguilles d'injection en tirant un tube capillaire en verre (1,0 mm de diamètre extérieur x 0,75 mm ID, longueur de 100 mm) à une aiguille de traction instrument selon les instructions du fabricant. Aiguilles convenant à l'injection dans les oursins travaillent aussi bien pour les étoiles de mer, afin d'utiliser les mêmes paramètres 19.
- Veuillez environ 2 ul de solution d'injection dans une aiguille d'injection à l'aide d'une pointe de pipette microloader.
- Insérez le bout de l'aiguille dans la manipulator. Réglez Picospritzer à 100 ms impulsion et une pression d'air de 40 psi.
- Placer un plat d'embryons ramé sur la platine du microscope et ont tous les embryons dans le champ de vue. Orienter l'antenne de telle sorte que la ligne de prédécoupe se trouve du côté le plus proche de l'aiguille. Positionner l'aiguille à un angle d'environ 60 ° de sorte que la pointe se trouve à proximité du centre de la ligne et juste au-dessus de la surface de l'eau.
- Concentrez-vous sur la ligne pointillée et abaisser l'aiguille jusqu'à ce que la pointe est au point. Abaissez la pointe un peu plus et de le briser ouvert en exécutant doucement dans les crêtes de la ligne pointillée. Soulever le nez hors de la surface du plat et le placer au sommet de la première rangée de zygotes et se concentrer sur les zygotes.
- Abaissez la pointe de telle sorte qu'il empaler le centre de zygote provenant de partout dans un angle de 60 °. L'aiguille pénètre facilement P. zygotes miniata. Appuyez sur la pédale au pied (ou d'autres moyens de forçage de la matière de l'aiguille d'injection) pour introduire un bolus d'injesolution ction dans l'embryon.
- Objectif pour un bolus qui est de 20 à 30% du diamètre de l'embryon, ou entre 25 et 80 pl. Si le bolus est plus grande ou plus petite que cela, ajuster la durée de l'injection sur la Picospritzer et injecter la prochaine embryon. Continuer à ajuster la durée pour obtenir la taille souhaitée de bolus. Commencez à 100 msec. Re-casser l'aiguille si elle est supérieure à 200 ms est nécessaire d'introduire le bol approprié. Jetez l'aiguille et de préparer un nouveau si moins de 15-20 ms est nécessaire pour obtenir cette taille de bolus que la taille de l'aiguille est trop grande et peut perturber le développement normal.
- Passez à injecter les zygotes restants sur le plat d'injection. Les embryons peuvent être facilement injecté jusqu'à ce clivage commence et en blastomères simples après la première division. Soulever périodiquement l'aiguille au-dessus de la surface de l'eau pour éliminer les zygotes qui se collent sur l'aiguille. Si nécessaire ré-briser la pointe de l'aiguille ou de charger une nouvelle aiguille si un blocage se produit.
- Autoriser les embryons de se développer à 15 ° C dans le sud ouest. Maintenir une surface spécifique élevée de volume dans les cultures de permettre l'échange d'oxygène. Assurez embryons ne sont pas bondé; garder cultures égal ou inférieur à 200 embryons / ml. Selon le stade souhaité de l'embryon, prévoir de recueillir les embryons injectés aux alentours de 20-24 heures après la fécondation.
NOTE: C'est souvent le moment idéal pour trier et collecter et parce que les embryons se développent normalement se distinguent facilement morphologiquement, mais ne sont pas encore nager. - Si les embryons sont éclos, saler légèrement choc pour empêcher la natation. Ajouter 200 ul de 5 M de NaCl à 10 ml de SW dans le plat d'injection tout en remuant doucement la SW. Après quelques minutes, les embryons tomberont au fond de la boîte. Ces informations et de les déplacer à la salinité SW normale.
- Recueillir embryons injectés sous une source de lumière fluorescente approprié compatible avec le traceur utilisé dans le INJECTIsur la solution. Si aucun traceur a été utilisé, sorte d'embryons de sélectionner pour une morphologie normale.
- Avec une pipette bouche, tirer fluorescent embryons avec une quantité minimale de SW et de faire sauter les dans une petite boîte de culture rempli de SW. Pipettes de bouche idéales ont une ouverture suffisamment grande pour les embryons d'être tiré et sortir sans les endommager, mais pas si grand que les embryons non désirés et SW étrangère sont également tirés vers le haut.
- Une fois que tous les embryons désirés ont été recueillies dans le nouveau plat, observer les embryons sous la lumière fluorescente et supprimer tous les embryons de l'ONU à injection ou des embryons peu développés.
- Culture triée embryons à étapes désirées dans un incubateur et procéder à l'imagerie ou d'autres protocoles souhaités.
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Representative Results
L'objectif de ce protocole est d'introduire les réactifs dans des embryons. Nous démontrons l'efficacité du protocole en injectant un journaliste construction d'ADN qui entraîne l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP). Embryons injectés expriment la GFP dans des parcelles de clones (figure 4A-B) que l'ADN incorpore lors du clivage précoce. Beaucoup de réactifs qui sont souhaitable d'introduire dans les embryons sont toxiques en grande quantité et à des lots sous-optimales d'embryons. Toxicité se manifeste en retardant le développement, en arrêtant le développement de clivage précoce ou au stade de l'oeuf fécondé, ou en imposant le développement aberrant (figure 5A-C).
Figure 1 gamètes Obtention de P. adultes miniata. A) Pour exciser gonades faire une incision sur le côté d'une proximale de brasau milieu de l'animal. B) Le matériau brun foncé tiré de cette incision est le tissu intestinal. Évitez de tirer le tissu intestinal car il blesser l'animal. C) tissu ovarien est généralement de couleur orange, comme indiqué ici, mais peut aussi être jaune ou brun clair. D) Les testicules sont blanches ou de couleur beige, comme indiqué. Toutes les barres d'échelle représentent 1 cm.
Figure 2: La maturation et la fécondation des ovocytes. A) ovocytes sains qui sont prêts pour la maturation sont grandes et claires avec une vésicule germinative visible. B) Les ovocytes qui ne sont pas prêts pour la maturation sont plus petits, brun, et granuleuse en apparence. C) un ovocyte qui a été mûri avec 1-méthyladénine . La vésicule germinative est en panne. D) Un zygote entouré d'un Fertenveloppe de ilization. E) Éviter les cultures avec de grands ovocytes qui ne peuvent pas être arrivés à échéance parce que ces ovocytes ne seront pas éliminés par filtration. Ces ovocytes sont un peu plus petit que celui de A. et sont brun foncé et texture granuleuse. La barre d'échelle dans A représente 50 um et représente l'échelle des images AE.
Figure 3 Appareils pour le montage. AA ') Un filtre à mailles fixée à un tube conique de 50 ml. Le conique en bout du tube et le milieu du couvercle sont découpés pour permettre aux cultures à être versé dans le tube et le filtre. B) un plat d'injection construit à partir du couvercle d'une boîte de culture en polystyrène de 60 x 15 mm. Un cercle tracé autour du centre décrit le champ de vision du microscope d'injection et sert de guide pour les embryons d'aviron. Une ligne a marqué into le plat est utile pour casser les aiguilles d'injection. CC ') Bouche pipette set-up. Placer une embouchure à une extrémité d'un long tube de caoutchouc de plusieurs pieds. Monter l'autre extrémité à une pipette Pasteur, qui a été façonné par fusion brièvement et en tirant l'extrémité étroite du verre. D) Schéma montrant un aviron Pasteur forme de pipette et la largeur idéale de promouvoir coller sans endommager les embryons. Lorsque la rupture de l'extrémité de la pipette tiré, il est utile que l'extrémité est effilée pour empêcher zygotes sortant d'une distance variable de l'antenne. Toutes les barres d'échelle représentent 3 cm.
Figure 4: Réactifs introduit avec succès par microinjection. A) DIC d'un embryon au stade de la blastula injecté avec un plasmide rapporteur GFP. L'embryon a une morphologie normale. B) GFP expression dans l'embryon représenté dans A. C) de l'image DIC de deux embryons au stade de la blastula morphologiquement normales. D) un embryon à partir de C émet une fluorescence rouge à partir de l'introduction du Texas Red dextran. L'autre embryon est non injectée et ne présente pas de fluorescence. Les barres d'échelle représentent 50 um. La barre d'échelle dans A représente l'échelle de A et B. La barre d'échelle dans C représente l'échelle C et D.
Figure 5 surinjection et le résultat de la toxicité de réactif dans arrêtés ou de développement aberrant. Toutes les images sont des embryons de 24 heures après l'injection du même lot d'injection. AA ') Un zygote overinjected arrêté au stade d'une cellule. BB') Un embryon arrêté en début de coupure. Un embryon sain diviser symétriquement, tandis que cet embryon arrêtéen raison de divisions cellulaires anormales. CC ') Un embryon avec le développement sauvagement aberrante en raison de la toxicité. Bien que cet embryon est formé à peu près comme un embryon de blastula (D), il est asymétrique et un épaississement anormal. DD ') Un bon développement injecté un embryon au stade blastula. La barre d'échelle dans A représente 50 um et représente l'échelle de tous les panneaux.
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Discussion
Il ya deux étapes essentielles qui sont difficiles pour les utilisateurs novices de cette technique mais qui sont essentielles pour réussir à créer des embryons morphant. Le premier est la sélection des ovocytes sains qui viendront à échéance et fertiliser correctement. Le pourcentage d'évolution normale dans une culture dépend de la saison, de la santé de l'animal, et le nombre de fois que les ovocytes ont été récoltées à partir d'un seul individu. Les ovocytes ont tendance à être de meilleure qualité à partir de Avril à Octobre. Il est important d'examiner attentivement les ovocytes avant de procéder à veiller à ce que la majorité ressembler à la figure 2A, plutôt que la figure 2B. Il est permis d'avoir un petit nombre d'ovocytes qui ne mûrissent, en particulier si elles sont suffisamment petits pour filtrer les ovocytes sont traitées. Occasionnellement, les ovocytes qui sont sous-développés sont presque aussi grand que les ovocytes entièrement développés qui sont prêts pour la maturation. Ils se distinguent par leur granuleuse, brun Coloring (figure 2E). Ne pas utiliser les lots d'ovocytes de ce type, car la filtration ne sera pas isoler les ovocytes entièrement développés à partir d'ovocytes non développées et qu'ils se traduisent souvent par des cultures d'embryons anormaux qui sont plus susceptibles de présenter des défauts observés dans la Figure 5.
L'autre étape importante est la taille du bolus d'injection. Introduire une quantité de réactif perturbateur qui est suffisamment grande pour exercer un effet, mais pas assez grande pour causer des effets non spécifiques. La première fois, un perturbateur réactif est utilisé, il est utile d'effectuer un titrage dans lequel plusieurs concentrations de réactif sont essayés. Effectuer des micro-injections ultérieures avec la plus forte concentration qui ne cause pas d'anomalies de développement qui ne sont pas liés au phénotype attendu, ou le développement de retard (figure 5A). Éviter d'injecter un bolus qui est supérieure à 30% du diamètre de l'embryon comme cela peut perturber le développement normal. Trop petite taille des bolus, par contrast, sont difficiles à inspecter visuellement pour le dimensionnement cohérent qui peut conduire à une gamme de phénotypes excessive de perturbation à travers répétitions.
Réactifs perturbateurs peuvent provoquer des retards de développement ou des phénotypes non spécifiques à des gammes de concentration efficaces. Il est donc très important, pour injecter des contrôles de la fratrie avec un réactif bénigne comme un contrôle standard MASO, des constructions d'ADN standards, ou la rhodamine traceur. Embryons de morphant essai que si ces contrôles montrent un développement normal. Embryons injectés, y compris les contrôles, présentent parfois un phénotype blastula ridée mais il s'agit souvent de passer par le reste du développement normalement. En outre, si un réactif particulier provoque toujours des retards de développement chez les embryons résultant morphant, comparer ces embryons pour contrôler embryons pour déterminer combien d'heures de retard qu'ils éprouvent.
Il ya quelques caractéristiques de cette méthode qui peut limiter son utilité dans sscénarios expérimentaux SPECIFIQUES. Un tel problème est le fait que l'on ne peut introduire les réactifs à l'ovule fécondé ou étapes de clivage précoce. Cela est particulièrement problématique si le gène ou d'une voie d'intérêt est particulièrement crucial dans le développement précoce et les embryons qui en résultent sont de morphant non viables ou trop de développement anormal pour une étude significative. Parfois, ce problème est résolu en injectant moins de copies du réactif perturbateur, résultant en un effet de choc incomplète doux. Si un médicament sur les cellules-perméable appropriée pour le gène cible ou de voie existe, il est utile de comparer le phénotype des embryons injectés avec des réactifs au stade de l'oeuf fécondé avec des embryons traités avec le médicament à un stade ultérieur, plus approprié. Parce que l'injection de Masos ou ARNm offre une plus grande spécificité, il est plus puissant à utiliser cette méthode en conjonction avec un médicament à l'étude, le traitement par opposition à l'abandon de la micro-injection en faveur d'un traitement médicamenteux.
Enfin, bien que ce microProcédé d'injection va produire une quantité suffisante d'embryons pour une grande variété d'applications en aval, il sera au mieux produire plusieurs centaines à un mille embryons sains injectés avec succès. Certaines expériences souhaitées peuvent nécessiter beaucoup plus de matériel que cela. Autres méthodes utilisées avec succès dans le système de l'oursin de mer peuvent être modifiées pour créer encore plus grand nombre de morphant embryons d'étoiles de mer, tels que les rétrovirus pantropes 20, bien que cette méthode est nouvelle et n'a pas encore gagné une utilisation généralisée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré par les auteurs.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la National Science Foundation IOS 0844948 et 1024811 IOS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
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