Summary
Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.
Abstract
Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.
Introduction
Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil 1-3, Entwicklungs 4,5, Evolutions 6 bis 8 und 9 bis 11 ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien 12 verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen 13 befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlaubt eine einfache Beobachtung; entwickeln sie synchron und erfordern nur Meerwasser für die Entwicklung. Gesamte Genom Montage und mehrere Transkriptomen sind auch für P. verfügbar miniata ( Echinobase.org ). Solche Vorteile machen sie ideal für eine Reihe von Forschungsund Lehrzwecke.
In den letzten Jahren P. miniata hat sich zu einem Modellsystem für die Entwicklungs genregulatorischen Netzwerkanalysen 14-16. Ziel solcher Untersuchungen ist die gesamte Komplement regulatorischen Gene zu identifizieren und zu bestimmen, die das Netz ihre Wechselwirkungen. Ein großer Teil dieser Arbeit bringt störenden Genexpression durch Einführung von Antisense-Oligonukleotide oder in vitro synthetisierten mRNA. Zusätzlich sind cis-regulatorischen Analysen verwendet werden, um die Funktion von regulatorischen DNA 15 charakterisieren. Diese Analysen erfordern Einführung Störungs Reagenzien und / oder DNA-Reporterkonstrukte in Embryonen. Ferner sind die nachgeschalteten Effekte dieser Störungen zu charakterisieren, muß man viele Embryonen zu Veränderungen in der Genexpression potentieller Ziele zu untersuchen. Verfahren zur Mikroinjektion von vielen Hunderten von Zygoten sind von zentraler Bedeutung für diese Arbeit.
Stachelhäuter, darunter P. miniata de novo durch Mikroinjektion. Mikroinjektion bietet die Möglichkeit, Embryonen mit Reagenzien, die nicht zellgängig sind zu ändern. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um DNA, mRNA, Zell Tracer und Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden in Hunderten von befruchteten Eiern in einer 2-3 h durch Mikroinjektion sitzt einzuführen. Dies erzeugt genügend Material für eine Vielzahl von stromabwärts Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, qPCR beschränkt, in-situ-Hybridisierung, RNA-Seq und Western Blotting.
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Protocol
Bewahren Sie alle Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (SW), erwachsenen Tieren und Kulturen bei 15 ° C, so viel wie praktisch. Stellen Sie sicher, Eier und Zygoten sind in SW eingetaucht gehalten.
Kommerziell hergestellte Meersalz mit destilliertem oder Umkehrosmose Wasser wiederhergestellt dient auch als Quelle der SW. Überprüfen Sie den Salzgehalt mit einem Hydrometer und stellen Salze oder Wasser, um ein optimales Niveau zu erreichen. Halten spezifische Gewicht Niveaus zwischen 1,020 bis 1,025. Bewahren Sie alle Glas-und Kunststoffprodukte getrennt von dem übrigen Laborgeräte, um eine Kontamination mit Chemikalien zu vermeiden. Embryo Grade Laborgeräte sauber durch Spülen mit VE-Wasser oder gelegentliche Einweichen in verdünnter Natriumhypochlorit gefolgt von Spülen mehrmals in Wasser.
1. Gewinnung und Reifung Gameten aus Patiria miniata Erwachsene
- Wählen Sie ein Tier Gonaden herauszuschneiden. Bestimmen Sex nach der Exzision durch die Suche nach der Gegenwart der Eierstöcke oder Hoden, weil P. miniata sind nicht an sichxually dimorphic.
- Schneiden eine kleine Öffnung, die nicht größer als 1 cm, entlang der Seite von einem Seestern Arm mit einer Skalpellklinge (1A). Mit Hilfe von kleinen stumpfen Enden Zange das Zurückziehen der Schnittkanten der Gonaden Gewebe für den Zugriff auf und ziehen Gonaden Gewebe durch den Einschnitt.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, aus Darmgewebe, die eine lose grau oder braun Gewebe (Abbildung 1B) ist. Eierstöcke sind in der Regel orange, gelb oder hellbraun (1C), während die Hoden sind weiß oder beige und wenn gestört wird dazu führen, Meerwasser milchig oder trüb, im Aussehen (Abbildung 1D) zu werden. - Zurück zu den Frauen Aquarien. Isolieren Männchen um ein oder zwei Stunden in einen Behälter mit SW seit dem Stress aus Laich Handhabung kann zu induzieren. Tiere heilen entlang der Einschnittstelle und weiter zu Gameten für mehrere Monate zur Verfügung stellen.
- Sammeln Hoden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit so wenig wie möglich und SW Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. Bewahren Sie die Hoden nicht wired am Tag der Entnahme bei 4 ° C für bis zu einer Woche.
- Sammeln Eierstöcke in einem kleinen Glas Kulturschale in einem mehrere Milliliter SW. Um die Eizellen aus dem Eierstock Gewebe freizugeben, necken neben das Gewebe mit zwei Pinzetten, bis keine großen Stücke bleiben.
HINWEIS: Optimal ist die Mehrheit der Oozyten voll entwickelt. Solche Eizellen sind groß, rund und klar, gelb oder hellbraun mit einem deutlichen Keimbläschen in der Eizelle (2A), im Vergleich zu der Untergruppe der nicht entwickelten Eizellen, die kleiner, braun, körnig und opak (2B) sind. Wenn mehr als rund 25% der Eizellen sind von unentwickelten Vielfalt, wählen Sie eine andere weibliche Eizellen zu erhalten. - Gießen Sie die Eizellen und verbleibende Gewebe durch ein Sieb mit einer Filtertasse 200 um Porengröße und sammeln durch fließen. Dadurch werden alle Sorten von Eizellen enthalten, aber Eierstockgewebe zu entfernen. Verdrängen verbleibenden Oozyten aus dem Gewebe durch das Filter gefangen durch Sprühen wit SW aus einer Spritzflasche. Filtertassen werden mit einem 50 ml konischen Röhrchen (3A-A ') hergestellt.
- Gießen Sie die Strömung durch aus Schritt 1.6 durch ein 100 um Maschenfiltertasse. Verwerfen kleinen Eizellen bei der Durchströmung. Große voll entwickelten Eizellen, die bereit für die Reifung wird auf dem Filter zu bleiben. Spülen Sie die Oozyten in einen sauberen 200-ml-Becher.
- Fügen Sie 95 ml SW auf den 200 ml-Becherglas von Eizellen. 5 ml von 200 uM 1-Methyladenin zu einer Endkonzentration von 10 uM.
- Übertragen Sie die Eizellen zu einem großen flachen Kulturschale und Ort bei 15 ° C. Eine hohe Oberfläche zu Volumen Kulturschale ermöglicht den Sauerstoffaustausch. Die Eizellen reifen nicht oder nicht gut entwickeln, wenn sie in dieser Reifephase überfüllt sind. Aufgeteilt in mehrere Gerichte der SW plus 10 uM 1-methlyadenine bis Kultur ist weniger als 200 Eizellen / ml.
- Lassen Sie die Oozyten für 45-90 min reifen, aber nicht mehr, da dies die Eizellen nicht in der Lage zu sein, machen fertilized. Um festzustellen, ob die Reifung abgeschlossen ist, bei der Eizellen schauen unter einem Binokular. Die Keimbläschen bewegt sich auf und verschmilzt mit der Zellmembran während der Reifung. Es bricht dann nach unten und ist nicht mehr in reifen Oozyten (Abbildung 2C) sichtbar daher.
2. Die Befruchtung der Eizellen Ältere
- Wählte eine kleine Gruppe von Hodengewebe, etwa erbsengroße und Hackfleisch in einem kleinen Glas Kulturschale mit etwa 1 ml SW.
- Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette auf 2-3 Tropfen der resultierende milchige Meerwasser auf etwa 100 ml der reifen Eizellen übertragen und wirbeln die Kulturschale zu mischen. Vermeiden Sie die Übertragung Stücke von Hodengewebe. Vermeiden Sie es größere Mengen an Spermien, da dies zu Polyspermie und anschließende schlechten Entwicklung führen.
- Nach einigen Minuten beobachten die Eizellen unter einem Binokular. Befruchtete Eier oder Zygoten, eine Befruchtung Umschlag, der eine klare Blase, die aus dem cel erhebt, istl Membran (2D).
HINWEIS: Nicht mit der Kultur vor, wenn weniger als etwa 90% der Eier zu befruchten, da schlechte Befruchtungsraten sind ein Hinweis auf eine ungesunde Kultur, die auch nicht gut entwickeln kann. - Nach der vollständigen Befruchtung ist, ändern Sie die SW auf den Zygoten von Gießen durch einen 100 um Sieb-Filter und Spülen in eine Kulturschale mit frischem SW. Es ist wichtig, die überschüssige Spermien Sauerstoffmangel zu verhindern entfernen. Legen Sie die Kulturschale bei 15 ° C für 15-30 min.
3. De-Geliermittel und Rudern befruchteten Eier
- Vorbereitung Injektion Gerichte, indem Sie den Deckel von einem 60 x 15 mm Petrischale aus Polystyrol.
- Zeichnen Sie einen Permanent-Marker Stiftlinie auf der Rückseite der Schale, um den Bereich, den Bereich der Blick auf die Mikroinjektion Mikroskop passt. Dies stellt sicher, dass alle gerudert Embryonen im Mikroskop Feld.
- Verwenden Sie ein Glas Pasteur-Pipette, um eine Linie durch den Kreis, S. punktenreferably zu einer Seite des Kreises (3B). Verwenden Sie diese Linie später Injektionsnadeln (Schritt 4.5) zu brechen.
HINWEIS: Reagenzien häufig verwendet, um Seeigel-Embryonen, zB Protaminsulfat oder Poly-L Lysin, sind unnötig halten. De-Sülze P. miniata Zygoten haften sehr gut auf unbeschichteten Kunststoff. Beachten Sie, dass sie nicht gut zu Glasschalen bleiben.
- Fügen etwa 10 ml SW zu jeder Schale, so daß die Oberfläche bedeckt, aber das Wasser wird nicht zu spritzen in die Schale, da dies reihig Embryonen stören.
- Entfernen Sie die P. miniata Zygote Gallerthülle mit Säure SW vor Rudern. Diese Gallerthülle ist umfangreicher als die für Modell Seeigel-Arten beobachtet.
- Bereiten Säure SW im Bereich von pH 4,0 bis 4,2. Der pH-Wert ist entscheidend für die effiziente Entfernung von Gallerthülle, gestattet jedoch eine normale Entwicklung.
- Fügen Sie einzelne Tropfen von 1 N (1 M) HCl in SW zu einem 1 L Lager von SW. Lassen Sie jeder Tropfen vollständig mischenund zu überwachen, bevor Sie mehr pH-HCl.
HINWEIS: Ein bis mehr ml HCl ergibt die entsprechenden pH-Wert, aber nicht das gesamte Volumen auf einmal hinzuzufügen.
HINWEIS: Bereiten 1 N HCl in Abzug mit SW-und 12 N (12 M) HCl. - Entfernen SW auf Zygoten durch Gießen Sie sie auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie in einen 200-ml-Becher in die kleinste Menge von SW möglich (ca. 10 ml). Das Becherglas wird bis zu 150 ml mit Säure SW (pH 4,0) und damit die Zygoten in die Säure SW 3 min stehen.
- Streifen Gallerthülle von den Zygoten von ihnen Gießen hin und her zwischen zwei 200 ml-Becher, jedes Mal vorbei an den Zygoten durch ein 200 um Sieb-Filter. Gießen Sie die Zygoten durch den Filter um 5-10x über ca. 2 min Zeitfenster.
- Säure zu entfernen, indem die SW Zygoten auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie die Zygoten in eine kleine Glasschale mit Kultur SW. De-Sülze Zygoten können Kunststoffschalen bleiben. Reihe Embryonen sofort; sie beginnen, mehr zu produzieren jElly Mantel, die schlechte Haftung der Zeit führt zu Kunststoffschalen.
- Verwenden Sie einen Mund Pipette (3C-C ') von der Kulturschale Glas abholen Zygoten und legen Sie sie in geraden Linien auf den Einspritz Gerichte. Schmelzen Sie die Mitte der dünnen Seite einer Pasteur-Pipette über einer Flamme, bis das Glas weich ist. Schnell ziehen Sie die Enden der Glas auseinander, um eine sehr dünne Strecke von Glas zu produzieren. Sobald das Glas abgekühlt ist, brechen Sie das kleine Ende des Pasteur-Pipette (für weitere Informationen auf die Vorbereitung ein Mund Pipette sehen Wessel et al., 2004 17 oder Süß et al., 2004 18).
- Machen Sie ein Ruder Pipette so dass der Durchmesser ist nur größer als der Durchmesser der Embryonen, so dass nur eine einzige Zygote wird betreten und verlassen die Pipette zu einer Zeit. Dies ermöglicht eine einzige Reihe zu bilden. Kleineren Durchmesser Pipetten können die Befruchtung Hülle abstreifen und stören die Zygoten als P. miniata Zygoten nicht über eine hyaline Membran einnd sind recht weich.
- Wenn die Zygoten nicht auf die Kunststoffschale kleben, halten sie nicht für zusätzliche Zeit in Säure SW (bis zu mehreren Minuten). Alternativ kann ein kleiner Durchmesser Pipette kann bei der Beseitigung von Gallerthülle, damit die Zygoten, um effektiver halten zu helfen.
- Die Zygoten sind leicht positiven Auftrieb und neigen dazu, zu schwimmen oder schweben knapp über dem Boden der Schale. In diesem Fall, positionieren Sie den Ruder Pipette, so dass die Zygoten werden sanft auf die Oberfläche der Schale wie sie aus der Pipette (3D) gedrückt.
HINWEIS:. Es ist zulässig, viele Zeilen auf diesen Gerichten passen P. miniata embryonalen Membranen werden erst schwieriger, im Laufe der Zeit durchdringen und daher kann man Hunderte von Zygoten auf einem einzigen Gericht zu injizieren.
4. Die Injektion von Zygotes
- Bereiten Injektionslösungen mit geeigneten Konzentrationen von Morpholino Antisense-Oligonukleotide (MASO), mRNA oder DNA in einer Endkonzentrationentration von 200 mM KCl. 400-800 uM MASO und 2,5 ng / ul DNA neigen dazu, morphanten Phänotypen bei gleichzeitiger Verringerung Toxizität. Die Endkonzentration in dem Ei 1/125 ten Ausgangskonzentration 14 sein. Injektionslösungen, die masos, Hitze auf 65 ° C für 5 min unmittelbar vor der Verwendung und bei Raumtemperatur lagern.
- Zur Vereinfachung der Sortier injizierten Embryonen, fügen Rhodamin Dextran Tracer zu der Injektionslösung in einer Konzentration von 0,1% zu erhalten.
- Bereiten Injektionsnadeln durch Ziehen Glaskapillarröhren (1,0 mm AD x 0,75 mm ID, 100 mm Länge) in einer Nadel ziehen Instrument folgenden Anweisungen des Herstellers. Geeignet für Injektionsnadeln in Seeigel auch gut für Seesterne, so verwenden ähnliche Parameter 19.
- Legen Sie etwa 2 ul Injektionslösung in einer Injektionsnadel mit einem Microloader Pipettenspitze.
- Legen Sie die stumpfe Ende der Nadel in den manipulator. Stellen Picospritzer zu 100 ms Puls und einen Luftdruck von 40 PSI.
- Legen Sie ein Gericht aus Embryonen ruderte auf den Mikroskoptisch und haben alle Embryonen in Feld. Orientierung der Schale, so dass die Ritzlinie auf der Seite am nächsten zu der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in einem ca. 60 ° Winkel, so ist die Spitze in der Nähe der Mitte der Linie und knapp über der Oberfläche des Wassers.
- Konzentrieren Sie sich auf der eingekerbten Linie und Senken der Nadel, bis die Spitze in den Fokus kommt. Senken Sie die Spitze ein wenig mehr und brechen sie, indem Sie sie sanft in die Rippen der Ritzlinie geöffnet. Heben Sie die Spitze von der Oberfläche der Schale und wird es an der Spitze der ersten Reihe der Zygoten und konzentrieren sich auf die Zygoten.
- Senken Sie die Spitze, so dass es das Zentrum der Zygote kam und in um einen Winkel von 60 ° aufspießen. Die Nadel dringt leicht P. miniata Zygoten. Schritt auf das Fußpedal (oder andere Mittel aus der Injektionsnadel zu zwingen Material), einen Bolus von inje einführenction Lösung in den Embryo.
- Ziel für einen Bolus, die 20-30% ist der Durchmesser des Embryos oder zwischen 25 und 80 pl. Wenn der Bolus größer oder kleiner ist als diese, Einstellen der Einspritzzeit auf der Picospritzer und injizieren das nächste Embryo. Weiter, um die Dauer einzustellen, um die gewünschte Bolus Größe zu erhalten. Beginnen bei 100 ms Dauer. Re-Break die Nadel, wenn mehr als etwa 200 ms benötigt wird, um die entsprechende Bolus einzuführen. Entsorgen Sie die Nadel und bereiten eine neue, wenn weniger als 15-20 ms benötigt wird, um diese Größe zu erhalten Bolus, wenn die Nadel ist zu groß und kann die normale Entwicklung stören.
- Gehen Sie, um die restlichen Zygoten an der Einspritz Gericht zu injizieren. Embryonen kann leicht bis Spaltung beginnt und in einzelne Blastomeren nach der ersten Spaltung injiziert werden. Regelmäßig heben Sie die Nadel über der Oberfläche des Wassers zu Zygoten, die auf die Nadel stecken zu entfernen. Falls erforderlich, erneut brechen die Spitze der Nadel oder laden Sie eine neue Nadel, wenn eine Blockade auftritt.
- Lassen Sie die Embryonen bei 15 ° C in SW zu entwickeln. Aufrechterhaltung einer hohen Oberfläche zu Volumen in den Kulturen um den Sauerstoffaustausch ermöglichen. Stellen Sie sicher, Embryonen sind nicht überfüllt; Kulturen halten bei oder unter 200 Embryonen / ml. Je nach dem gewünschten Stadium der Embryo, planen injizierten Embryonen bei etwa 20-24 Stunden nach der Befruchtung zu sammeln.
HINWEIS: Dies ist oft eine ideale Zeit, zu sortieren und zu sammeln, und weil in der Regel entwickelnden Embryonen leicht morphologisch unterscheiden, sind aber noch nicht schwimmen. - Wenn Embryonen geschlüpft, vorsichtig salzen Schock für Schwimmen verhindern. Geben Sie 200 ul 5 M NaCl auf 10 ml SW in der Einspritz Gericht unter leichtem Schwenken der SW. Nach ein paar Minuten werden die Embryonen auf den Boden der Schale fallen. Sammeln diese und verschieben Sie sie in den normalen Salzgehalt SW.
- Sammeln injizierten Embryonen unter einem geeigneten Fluoreszenzlichtquelle mit dem Tracer im INJEKTIERT kompatibelon-Lösung. Wenn kein Tracer verwendet wurde, sortieren Embryonen für normale Morphologie zu wählen.
- Mit dem Mund ansaugen, ziehen fluoreszierende Embryonen mit einer minimalen Menge von SW und blasen sie in eine kleine Kulturschale mit SW gefüllt. Ideal Mund Pipetten haben eine ausreichend große Öffnung für Embryonen und herausgezogen werden, ohne diese zu beschädigen, aber nicht so groß, dass unerwünschte Fremd Embryonen und SW sind ebenfalls nach oben gezogen wird.
- Sobald alle gewünschten Embryonen wurden in die neue Schale gesammelt, beobachten die Embryonen unter Fluoreszenzlicht und entfernen Sie alle un-injizierten Embryonen oder schlecht entwickelte Embryonen.
- Kultur sortiert Embryonen, um die gewünschten Stufen in einem Inkubator und fahren Sie mit Bildgebung oder anderen gewünschten Protokolle.
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Representative Results
Das Ziel dieses Protokolls ist es, Reagenzien in Embryonen vor. Wir zeigen die Wirksamkeit des Protokolls durch die Injektion eines DNA-Reporterkonstrukt, das die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) antreibt. Injizierten Embryonen exprimieren GFP in klonalen Patches (4A-B), da die DNA enthält im frühen Spaltung. Viele Reagenzien, die wünschenswert, in Embryonen einzuführen sind, sind in hohen Mengen und zu suboptimalen Chargen von Embryonen toxisch. Toxizität manifestiert durch Verzögerung der Entwicklung, verhaften Entwicklung in der frühen Spaltung oder bei der befruchteten Eizelle Bühne oder von imposanten abweichende Entwicklung (5A-C).
Abbildung 1. Gewinnung Gameten aus P. miniata Erwachsene. A) verbrauch Gonaden einen Einschnitt an der Seite eines Armes proximalenbis zur Mitte des Tieres. B) Die dunkelbraune Material von dieser Einschnitt gezogen wird Darmgewebe. Vermeiden Sie es, Darmgewebe, wie es das Tier. C verletzen) Eierstockgewebe ist in der Regel in der Farbe Orange als hier dargestellt, kann aber auch gelb oder hellbraun sein. D) Testes sind weiß oder beige in der Farbe, wie dargestellt. Alle Maßstabsbalken bezeichnen 1 cm.
Abbildung 2. Die Reifung und Befruchtung von Eizellen. A) Gesunde Eizellen, die bereit für die Reifung sind groß und klar, mit einer sichtbaren Keimbläschen. B) Eizellen, die nicht bereit sind für die Reifung sind kleiner, braun und körnig in Erscheinung. C) eine Eizelle, die mit 1-Methyladenin gereift wurde, sind . Das Keimbläschen hat sich eine Zygote mit einem fert umgeben gebrochen. D)lisation envelope. E) Vermeiden Kulturen mit großen Oozyten, die nicht ausgereift ist, weil diese Oozyten nicht durch Filtration entfernt werden kann. Solche Oozyten sind etwas kleiner als die in A. und dunkler braun und körnig texturierten. Der Balken in A bedeutet 50 um und stellt den Maßstab für Bilder AE.
Abbildung 3. Die Apparate für die Montage. AA ') eine Maschenfilter mit einem 50 ml konischen Röhrchen befestigt. Die sich verjüngenden Ende des Rohres und der Mitte des Deckels ausgeschnitten sind, damit Kulturen durch das Rohr und Filter. B) ein Einspritzschale von dem Deckel aus einem 60 x 15 mm Polystyrol-Petrischale gegossen, konstruiert werden. Ein Kreis um die Mitte gezogen beschreibt das Sichtfeld des Einspritz Mikroskop und dient als Leitfaden für die Ruder Embryonen. Eine Linie hat into die Schale ist nützlich für das Brechen Injektionsnadeln. CC ') Mund Pipette Set-up. Passen ein Mundstück in ein Ende eines mehrere Meter langen Gummischlauch. Das andere Ende an einer Pasteur-Pipette, die durch kurzes Schmelzen geformt worden ist und ziehen Sie das schmale Ende des Glases. D) Schematische zeigt eine ideale Ruder Pasteur-Pipette Form und Breite zu fördern kleben ohne Beschädigung Embryonen. Wenn das Ende brechen weg von der Pipette gezogen, ist es hilfreich, wenn das Ende ist verjüngt, um Schwellen Zygoten von floating Weg von der Schale zu verhindern. Alle Maßstabsbalken bezeichnen 3 cm.
Abbildung 4. Reagenzien Erfolgreich durch Mikroinjektion. A) DIC einer Blastula-Stadium Embryos mit einem GFP-Reporter-Plasmid injiziert. Der Embryo hat normale Morphologie. B) GFP expreSpaltung in) in A. C gezeigte Embryo DIC Bild von zwei morphologisch normalen Blastula-Stadium Embryos. d) ein Embryo aus C besteht aus einem roten Fluoreszenz von der Einführung von Texas Red Dextran. Der andere Embryo un-injiziert und zeigt keine Fluoreszenz. Maßstabsbalken bezeichnen 50 um. Balken in A für die Skala für A und B. Maßstabsbalken in C den Maßstab für C und D.
Abbildung 5. Überspritzung und Reagenzien Toxizität Ergebnis festgenommen oder abweichende Entwicklung. Alle Bilder sind von Embryonen 24 Stunden nach der Injektion aus der gleichen Charge Injektion. AA ') Ein overinjected Zygote bei der Ein-Zell-Stadium festgenommen. BB') Ein Embryo festgenommen Anfang Spaltung. Ein gesunder Embryo wird symmetrisch teilen, während dieser Embryo festgenommendurch abnorme Zellteilungen. CC ') ein Embryo mit wild abweichende Entwicklung aufgrund der Toxizität. Während dieser Embryo ist ungefähr wie ein Embryo Blastula (D) geformt, es ist asymmetrisch und abnorm verdickt. DD ') Ein richtig Entwickeln injiziert Blastula-Stadium Embryos. Balken in A bedeutet 50 um und stellt den Maßstab für alle Panels.
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Discussion
Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wichtig, genau an den Oozyten, bevor zu gewährleisten, dass die Mehrheit wie 2A statt 2B sehen aussehen. Es ist zulässig, eine kleine Anzahl von Oozyten, die nicht fällig werden, insbesondere, wenn sie klein genug ist, heraus zu filtern, da die Oozyten verarbeitet werden müssen. Gelegentlich sind fast so groß wie voll entwickelt Eizellen, die bereit sind für die Reifung Eizellen, die unentwickelt sind. Sie unterscheiden sich durch ihre körnig, braun coloring (2E). Verwenden Sie keine Chargen von Eizellen dieser Art, weil Filtration wird nicht voll entwickelt Eizellen von unentwickelten Eizellen isolieren und sie oft in abnorme Embryokulturen, die eher die Mängel in Abbildung 5 zu sehen zeigen, sind Folge haben.
Der andere kritische Schritt ist die Injektion Bolus Größe. Einführung einer Menge an störenden Reagens, das ausreichend groß ist, um eine Wirkung auszuüben, aber nicht so groß, um nicht-spezifische Effekte verursachen. Das erste Mal, wenn ein störender Reagens verwendet wird, ist es hilfreich, eine Titration in dem mehrere Konzentrationen von Reagenz versucht auszuführen. Ausführen nachfolgender Mikroinjektionen mit der höchsten Konzentration, die keine Entwicklungsstörungen, die nicht mit den erwarteten Phänotyp oder Verzögerung der Entwicklung (Abbildung 5A) verursacht. Injizieren eines Bolus zu vermeiden, die größer als 30% des Durchmessers des Embryos, da dies die normale Entwicklung stören. Mäßig kleinen Bolus Größen, durch Contrast, sind visuell nur schwer für die konsequente Dimensionierung, die zu einer übermäßigen Bereich der Störungs Phänotypen in Wiederholungen führen kann inspizieren.
Störenden Reagenzien können Entwicklungsverzögerungen oder unspezifische Phänotypen bei effektiven Konzentrationsbereichen verursachen. Es ist daher sehr wichtig, um Geschwisterkontrollen mit einem gutartigen Reagens, wie einem Standard-Steuer MASO, Standard-DNA-Konstrukte oder Rhodamin Tracer injizieren. Assay morphanten Embryonen nur dann, wenn diese Kontrollen zeigen eine normale Entwicklung. Injizierten Embryonen, einschließlich der Kontrollen, weisen manchmal eine faltige Blastula Phänotyp, aber sie werden häufig durch den Rest Entwicklung normal fortgesetzt. Außerdem, wenn ein bestimmtes Reagenz konsequent verursacht Entwicklungsverzögerungen in den resultierenden Embryonen morphanten, vergleichen diese Embryonen Embryonen zu kontrollieren, um festzustellen, wie viele Stunden Verspätung, die sie erleben.
Es gibt ein paar Attribute dieser Methode, die ihre Nützlichkeit in s einschränkenPEZIFISCHE experimentellen Szenarien. Ein solches Problem ist die Tatsache, dass man nur die Reagenzien bei befruchteten Eizelle oder frühen Teilungsstadien vorstellen. Dies ist besonders problematisch, wenn das Gen oder Weg von Interesse ist vor allem in der frühen Entwicklung und die daraus resultierenden Embryonen nicht lebensfähig morphanten oder zu entwicklungs abnorme für eine sinnvolle Studie. Manchmal wird diese Frage wird durch die Injektion von weniger Kopien der störenden Reagenz, was zu einer sanfteren, unvollständige Zuschlags gelöst. Wenn eine geeignete Zelle durchlässigen Arzneimittels zur Zielgens oder Weg besteht, ist es hilfreich, den Phänotyp von Embryonen mit Reagenzien bei der befruchteten Eizelle Stufe mit Embryonen mit dem Wirkstoff in einem späteren, geeigneten Zeitpunkt behandelt injiziert vergleichen. Da Injektion von Masos oder mRNAs bietet größere Spezifität, ist es stärker, um diese Methode in Verbindung mit einem Drogentherapiestudie verwenden im Gegensatz zu Mikroinjektion aufzugeben zugunsten der medikamentösen Behandlung.
Schließlich, auch wenn dieser MikroEinspritzverfahren wird eine ausreichende Menge von Embryonen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen zu erzeugen, es wird allenfalls mehrere 100-1000 gesund, erfolgreich injizierten Embryonen zu erzeugen. Einige gewünschten Experimente erheblich mehr Material als dies erfordern. Andere in der Seeigel-System erfolgreich verwendeten Methoden können geändert werden, um noch größere Anzahl von morphanten Seestern Embryonen, wie Retroviren pantropen 20 zu schaffen, obwohl diese Methode ist neu und noch nicht weit verbreitet gewonnen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt von den Autoren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation und IOS IOS 0844948 1024811 unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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