Summary
morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.
Abstract
극피 동물은 긴 유전자 조절 및 개발 프로세스의 진화의 연구를 위해 최근 재생 및 개발 연구에 좋아하는 모델 시스템되어하고있다. 바다 스타, Patiria miniata는 이전에 성게, Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus에 거의 독점적으로 수행 된 이러한 유형의 연구를위한 모델 시스템으로 유행을 얻고있다. 이러한 모델 시스템의 장점은 어떤 특정 유전자, 또는 하향 조절 최대 인 셀 그룹 라벨링, 또는 리포터 유전자 도입 배아 변경됨 제조 용이성이다. 단일 마이크로 인젝션 법은 변형 된 배아의 다양한을 생성 할 수있다. 여기서는 P.에서 생식 세포를 얻기위한 방법을 제시 miniata,이 배아를 생산하고, 미세 주입을 통해가 혼란 시약을 도입. 건강 morphant 배아는 이후 GE의 양적 및 질적 연구에 고립 아르네브라스카 기능. 이 유기체의 게놈 및 사체 데이터의 가용성을 수행하고이를 실행의 용이성되는 연구의 종류가 증가하고있다.
Introduction
(일반적으로 박쥐 스타로 알려진) 바다 스타, Patiria miniata는 6-8 진화 4,5 발달 세포 1 세의 다양한, 그리고 생태 학적 연구 9 11에 대한 재미 있고 다양한 모델 시스템으로 부상하고있다. 성인 P. miniata 바하 캘리포니아 12 싯카, 알래스카의 태평양 해안을 따라 분포하고 쉽게 해양 수족관에서 유지됩니다. 난 모세포를 얻을 연중 각 여성 수십 계란의 수천을 흘리다 수 있습니다. 난 모세포 쉽게 성숙 외부 13 기름지게한다. 생성 된 배아는 쉽게 관찰을 가능하게 투명; 그들은 기적으로 개발하고, 개발을 위해 만들어진 프로그램 만 바다 물을 필요로합니다. 전체 게놈 조립 및 여러 transcriptomes도 P. 사용할 수 있습니다 miniata ( Echinobase.org ). 이러한 장점은 연구의 범위에 이상적및 교육 목적.
최근, P. miniata 발달 유전자 규제 네트워크에 대한 모델 시스템은 14 - 16를 분석되고있다. 이러한 연구의 목표는 조절 유전자의 전체 칭찬을 식별하고 그들의 상호 작용 네트워크를 결정하는 것이다. 이 작업의 대부분은 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 체외 합성의 mRNA의 도입을 통해 섭동 유전자 발현을 수반한다. 또한, 규제 시스 분석 규제 DNA (15)의 기능을 특성화하는 데 사용된다. 이러한 분석은 교란 시약 및 / 또는 DNA 기자 배아에 구축의 도입이 필요합니다. 또한, 이들 섭동의 하류 효과를 특성화하기 위해, 하나의 잠재적 인 표적 유전자 발현의 변화를 위해 많은 배아 세이한다. 접합자의 수백의 미세 주입하는 기술이 작업 중심입니다.
P. 포함 극피 동물, miniata 새로이 발생해야합니다. 미세 주입 세포 투과하지 않은 약으로 배아를 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 다음 프로토콜은 한 2 ~ 3 시간이 미세 주입을 통해 앉아 수정란의 수백 DNA, mRNA의 세포 추적자, 및 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 소개하는 방법을 설명합니다. 이 포함 하류 다양한 실험에 충분한 재료를 생산하고 있지만, 현장 하이브리드, RNA-SEQ, 서부 모래 바닥에, qPCR에 바, 이에 한정되지는 않는다.
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Protocol
수있는 한 15 ° C에서 모든 바다 물 또는 인공 해수 (SW), 성인 동물, 그리고 문화를 유지합니다. 확인 계란 접합자는 SW에 몰입 보관됩니다.
증류수 또는 역삼 투 물로 재구성 상업적으로 제조 된 바다 소금 SW의 소스로도 제공합니다. 비중계를 사용하여 염분을 확인하고 최적의 수준을 달성하기 위해 염 또는 물을 조정합니다. 1.020-1.025 사이의 비중 수준을 유지합니다. 모든 유리를 유지하고 plasticware에 화학 물질과 모든 오염을 방지하기 위해 모든 다른 실험 실용에서 분리합니다. 탈 물이나 물에 여러 번 세척 한 다음 묽은 차아 염소산 나트륨에 가끔 몸을 담근 채 수세에 의해 청소 배아 학년 실험 실용.
Patiria의 miniata 성인에서 1 얻기 및 성숙 배우자
- 생식선을 절제하는 동물을 선택합니다. 난소 또는 고환의 존재를보고 절제 후 섹스를 결정 P. 때문에 miniata는 자체 아니다xually 동종 이형.
- 메스 블레이드 (그림 1A)와 바다 별 암의 측면을 따라 1cm보다 크지 않은 작은 구멍을, 잘라. 작은 무딘 종단 집게 다시 절개의 가장자리를 당겨 사용하면 생식선 조직에 액세스하여 절개를 통해 생식소 조직을 당겨.
참고 : 느슨한 회색 또는 갈색 조직 (그림 1B)는 장 조직을 철수하지 마십시오. 고환은 흰색 또는 베이지 색 동안과 모양 (그림 1D)에 우유 또는 흐린되기 위해 해수의 원인이됩니다 중단 할 때 난소, 일반적으로, 오렌지, 노란색, 또는 밝은 갈색 (그림 1C)입니다. - 수족관에 여성을 반환합니다. 산란을 유도 할 수 있습니다 처리에서 스트레스 때문에 SW의 용기에 한 두 시간에 대한 남성을 분리합니다. 동물 절개 사이트 함께 치유하고 몇 달 동안 배우자를 제공하기 위해 계속합니다.
- 가능한 한 적은 SW와 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 고환을 수집하고 사용할 때까지 얼음에 저장합니다. 우리는 고환을 저장하지주까지 4 ° C에서 컬렉션의 날 에디션.
- SW의 몇 밀리리터 작은 유리 배양 접시에서 난소를 수집합니다. 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 집게 이쌍과 조직을 떨어져 애타게, 난소 조직에서 난자를 해제합니다.
참고 : 최적, 난자의 대부분이 완전히 개발된다. 이러한 난자 (그림 2B), 갈색, 작은 낟알, 그리고 불투명 한 미개발 난자의 부분 집합에 비해, 큰 라운드와 난자 (그림 2A)에 뚜렷한 싹 소포 노란색 또는 밝은 갈색 분명하다. 난자보다 약 25 % 이상이 개발되지 않은 다양한 경우 난자를 얻기 위해 다른 여성을 선택합니다. - 200 μm의 기공 크기의 메쉬 필터 컵을 통해 난자와 나머지 조직을 붓고 흐름을 통해 수집합니다. 이 난자의 모든 종류를 포함하지만, 난소 조직을 제거합니다. w 분사하여 필터에 의해 잡힌 조직에서 남은 난자을 제거물총 병에서 i 번째 SW. 필터 컵은 50 ML 원뿔 튜브 (그림 3A-A ')를 사용하여 만들어집니다.
- 100 μm의 메쉬 필터 컵을 통해 단계 1.6을 통해 흐름을 따르십시오. 을 통해 흐름 작은 난자를 폐기하십시오. 필터에 남아있을 것입니다 성숙을위한 준비가 큰 완전히 개발 된 난자. 깨끗한 200 ㎖의 비이커에 난자를 씻어.
- 난자의 200 ㎖의 유리 비커에 SW의 95 ML을 추가합니다. 10 μM의 최종 농도 200 μM 일 - methyladenine의 5 ML을 추가합니다.
- 15 ° C에서 큰 얕은 배양 접시와 장소에 난자를 전송합니다. 대량 배양 접시에 고 표면적 산소 교환을 허용한다. 난자는 성숙하지 않거나 그들이이 성숙 단계에서 과밀 경우 잘 개발하지 않을 수 있습니다. 문화 미만 200 난자 / ㎖가 될 때까지 여러 SW의 요리 플러스 10 μM 일 - methlyadenine로 분할합니다.
- F 난자이 될 수없는 난자를 렌더링으로 더 이상 45 ~ 90 분 동안 성숙하지만, 허용되지ertilized. 성숙이 완료되었는지 확인하려면 해부 범위에 난자를 봐주세요. 성숙 동안 세포막와 새싹 소포 향해 이동하고 퓨즈. 그런 다음 고장 때문에 더 이상 성숙 난자 (그림 2C)에서 볼 수 없습니다.
성숙한 난 모세포의 2 시비
- SW의 약 1 ml의 작은 유리 배양 접시에서 고환 조직, 대략 완두콩 크기, 말하다의 작은 클러스터를 선택했다.
- 성숙한 난자의 약 100 ml의 결과 우유 바다 물 2 ~ 3 방울을 전송하고 섞어 배양 접시를 소용돌이하는 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 고환 조직의 조각을 전송하지 마십시오. polyspermy 이후 가난한 개발에 위험이 있습니다 정자의 큰 수량을 추가하지 마십시오.
- 몇 분 후 해부 범위에 난자를 관찰합니다. 수정란 또는 접합자는 CEL을 상승 명확한 거품이 풍부하게 봉투를 가지고리터 막 (그림 2D).
참고 : 가난한 수정률도 잘 개발하지 않을 수 있습니다 건강에 해로운 문화의 표시이기 때문에 계란의 적은 약 90 % 이상이 비옥 경우 문화를 진행하지 마십시오. - 수정이 완료되면, 100 μm의 메쉬 필터를 통해 쏟아져 신선한 SW와 배양 접시에 세척하여 접합자의 SW를 변경합니다. 이는 산소 고갈을 방지하기 위해 과량의 정자를 제거하는 것이 중요하다. 15 ~ 30 분 동안 15 ° C에서 배양 접시를 놓습니다.
3 디 - jellying 및 노 수정란
- 60 X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시에서 뚜껑을 고려하여 사출 요리를 준비합니다.
- 마이크로 인젝션 현미경 시야 일치 주변 접시의 뒷면에 영구 마커 펜으로 선을 그린다. 이 모든 저었다 배아보기의 현미경 필드 내에 있는지 확인합니다.
- 원 페이지를 통해 선을 점수 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여referably 원 (그림 3B)의 한면을 끕니다. 주사 바늘 (4.5 단계) 휴식 나중에 줄을 사용하십시오.
참고 : 시약은 일반적으로 성게 배아 예는, 프로타민 설페이트, 폴리-L 라이신이 불필요을 준수하는 데 사용됩니다. P. 드 - 젤리 miniata의 접합자는 코팅 플라스틱에 잘 붙어. 그들은 유리 접시에 잘 달라 붙지 않는 것이 있습니다.
- 표면이 포함되도록 각 접시에 약 10 ㎖의 SW를 추가,하지만이 저었다 배아를 교란 될 수 있으므로 물이 접시에 지나치게 튀하지 않습니다.
- P. 제거 앞서 노에 산 SW와 miniata 접합자 젤리 코트. 이 젤리 코트 모델 성게 종에 대한 관찰 된 것보다 더 광범위하다.
- pH가 4.0-4.2의 범위에서 산 SW를 준비합니다. pH는 정상적인 발달을 허용하면서 젤리 코트를 효율적으로 제거 할 수하는 것이 중요합니다.
- SW의 1 L의 재고로 SW에 1 N (1 M) HCl을 한 방울을 추가합니다. 각 드롭이 완전히 혼합 할 수 있도록 허용더 염산을 추가하기 전에 산도를 모니터링 할 수 있습니다.
주 : 해당 pH를 염산 결과 여러 mL에 하나는하지만, 한 번에 전체 볼륨을 추가하지 않습니다.
참고 : SW와 흄 후드에 1 N 염산을 준비하고 12 N (12 M) 염산. - 100 μm의 메쉬 필터에 그들을 부어 접합자에 SW를 제거합니다. (약 10 ㎖) SW의 가능한 가장 작은 양의 200 ㎖의 비이커로 헹군다. 산 SW (산도 4.0) 150 mL에 비커를 위로 채우고 접합자가 3 분 동안 산 SW에 앉아 할 수 있습니다.
- 이 200 ㎖의 비커 사이에 앞뒤로을 부어 접합자에서 젤리 코트를 벗겨, 200 μm의 메쉬 필터를 통해 접합체를 통과 할 때마다. 약 2 분 시간 창을 통해 5-10x 주변의 필터를 통해 접합자를 붓는다.
- 100 μm의 메쉬 필터에 접합자를 부어 산 SW를 제거합니다. SW와 작은 유리 배양 접시에 접합자를 씻어. 드 - 젤리 접합자 플라스틱 접시에 충실 수 있습니다. 행 배아 즉시; 그들은 더 J를 생산하기 시작시간이 지남에 플라스틱 접시에 접착 불량에 이르게 엘리 코트.
- 유리 배양 접시에서 접합자를 픽업하여 사출 요리에 직선로를 걸 입 피펫 (그림 3C-C ')를 사용합니다. 유리 소프트 될 때까지 불꽃 위에 파스퇴르 피펫의 얇은 쪽의 중심 용융. 신속 유리의 매우 얇은 신축성을 생성 떨어져 유리의 단부를 당긴다. 유리가 냉각되면, (입 피펫 선박 등을 볼 준비에 대한 추가 정보가 들어 있습니다. 2,004 17 달콤한 등. 2,004 18) 파스퇴르 피펫의 작은 끝을 끊다.
- 오직 하나의 접합자는 입력 시간에 피펫을 종료되도록 직경이 배아의 직경보다 큰 것이 바로 잉 피펫 같은 확인. 이는 단일 행을 형성 할 수 있습니다. 작은 직경의 피펫은 시비 봉투를 제거하고 P.로 접합체를 방해 할 수 있습니다 miniata의 접합체는 유리 모양의 멤브레인이없는ND는 매우 부드럽고.
- 접합자는 플라스틱 접시에 충실하지 않는 경우, 추가 시간이 산 SW에 (몇 분 이상까지)에 보관하십시오. 대안 적으로 작은 직경의 피펫 접합체보다 효과적으로 부착 할 수 있도록 젤리 코트를 제거하는데 도움을 수있다.
- 접합자는 약간 긍정적 부력 플로트하거나 접시의 바닥 위에 올려 경향이있다. 접합자 부드럽게들이 피펫 (도 3d)를 종료로 접시의 표면에 압착되도록이 경우, 노 피펫 위치.
참고 :. 그것은이 요리에 많은 행에 맞게 허용된다 P. miniata 배아 멤브레인들은 시간이 지남에 따라 더욱 어려워 침투되지 않고, 따라서 하나 하나의 접시에 수백 접합체를 주입 할 수있다.
접합자의 4 사출
- 최종 진한 적절한 모르 폴리 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 농도 (MASO)의 mRNA 또는 DNA를 함께 주사 용액을 준비200 밀리미터의 KCl entration. 400 ~ 800 μM MASO 및 DNA의 2.5 NG / μL 독성을 최소화하면서 morphant 표현형을 생산하는 경향이있다. 계란의 최종 농도가 초기 농도의 14 번째 1/125 것이다. 5 분 동안 65 ° C에 MASOs, 열을 포함하는 주사액의 경우 사용 후 실온에서 보관 직전.
- 주입 된 배아를 정렬하기 쉽게, 0.1 %의 농도를 얻기 위해 주입 용액에 로다 민, 덱스 트란 트레이서를 추가한다.
- 제조업체의 지침에 따라 기기를 당겨 바늘에 유리 모세관 튜브 (1.0 mm (외경) x 0.75 mm의 ID, 100mm 길이)를 잡아 당겨 주사 바늘을 준비합니다. 성게 주입에 적합한 바늘은 바다 별 잘 작동, 그래서 유사한 매개 변수 19을 사용합니다.
- microloader 피펫 팁을 사용하여 주사 바늘로 주입 액의 약 2 μl를로드합니다.
- m에 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입anipulator. 설정은 100msec 펄스 picospritzer 40 PSI의 공기압.
- 현미경 무대에 저었다 배아의 접시를 놓고 시야에있는 모든 배아를 가지고있다. 득점 라인이 바늘에 가까운 측이되도록 배향 접시. 팁 라인의 중간 근처 단지 수면 위가되도록 약 60 ° 각도로 바늘을 배치.
- 득점 라인에 초점을 맞 춥니 및 팁에 초점이 올 때까지 바늘을 낮 춥니 다. 좀 더 팁을 내리고 득점 라인의 능선으로 가볍게 실행하여 열려 휴식. 접시의 표면에서 팁을 올리고 접합체의 첫 번째 행의 상단으로 놓고 접합체에 초점.
- 이 60 ° 각도 주위에서 들어오는 수정란의 중심을 찌르 것 있도록 팁을 낮 춥니 다. 바늘이 쉽게 침투 P. miniata의 접합체. 인제의 볼 루스를 도입 풋 페달 (또는 주사 바늘로부터 물질을 강제로 다른 수단)에 스텝배아에 ction의 솔루션입니다.
- 20 ~ 30 % 태아의 직경, 또는 25 내지 80 PL 러스 조준. 루스이보다 크거나 작은 경우, picospritzer에 분사의 기간을 조정하고 다음 배아를 주입. 원하는 루스 크기를 얻기 위해 시간을 조정하는 것을 계속한다. 100 밀리 초 시간에 시작합니다. 200 밀리 초보다가 해당 러스 소개 필요한지 바늘을 다시 분해. 바늘을 버리고 미만이 15 ~ 20 밀리 바늘의 크기가 너무 큰 볼 루스로서이 크기를 얻기 위해 필요하며 정상적인 발달을 방해 할 수있는 경우 새로 제조.
- 사출 접시에 남아있는 배아에 주입 진행합니다. 배아 쉽게 절단이 시작 될 때까지 첫째 절단 후 단일 Blastomeres을 주입 할 수 있습니다. 주기적 바늘에 붙어 접합체를 제거 물의 표면 위 바늘 리프트. 필요한 바늘의 끝 부분을 다시 - 휴식이나 막힘이 발생하면 새 바늘을로드합니다.
- 배아 SW에 15 ° C에서 개발을 허용합니다. 산소의 교환을 허용하도록 배양 부피에 큰 표면적을 유지한다. 배아 혼잡되지 않도록; 또는 200 배아 / ㎖ 이하 문화를 유지한다. 배아의 원하는 단계에 따라 약 20 ~ 24 시간 포스트 수정에 주입 된 배아를 수집 할 계획입니다.
참고 :이 종종 정렬하고 일반적으로 개발 배아 쉽게 형태 학적으로 구별되지만, 아직 수영하지 않기 때문에 수집 할 수있는 이상적인 시간이다. - 배아가 부화하면 부드럽게 수영을 방지하기 위해 충격을 소금. 부드럽게 SW 소용돌이 치는 동안 주입 접시에 SW 10 ㎖에 5 M의 NaCl 200 μl를 추가합니다. 몇 분 후, 배아 접시의 바닥에 떨어질 것이다. 이러한를 수집하고 정상적인 염분 SW로 이동합니다.
- injecti 사용 트레이서와 호환 적절한 형광 광원 하에서 주입 배아 모아서솔루션에. 더 추적을 사용하지 않은 경우, 정렬 배아 일반적인 형태에 대한 선택합니다.
- 입 피펫을 사용하여, SW 사용하여 최소한의 배아를 형광 그릴 SW 가득 작은 배양 접시에 그들을 날려. 이상적인 입 피펫은 배아를 손상시키지 않고 및 철수하지만, 바람직하지 않은 배아와 관계없는 SW도 뽑아 아르 너무 크지 될 때까지 충분히 큰 구멍을 가지고있다.
- 일단 원하는 배아의 모든 새 접시에 수집 된 형광 조명 아래 배아를 관찰하고 해제 주입 배아 또는 가난하게 개발 된 배아를 제거합니다.
- 문화 인큐베이터에서 원하는 단계까지 배아를 정렬 및 이미징 또는 다른 원하는 프로토콜을 진행합니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 목적은 배아에 시약을 소개하는 것입니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 구동하는 DNA 리포터 구조체를 주입하여 프로토콜의 효과를 보여준다. DNA가 초기 절단시 통합으로 주입 된 배아는 클론 패치 (그림 4A-B)에서 GFP를 표현한다. 배아에 도입하는 것이 바람직하다 많은 시약은 높은 수량 및 배아의 최적 배치에 독성이다. 개발 지연 수정란 단계 초기 절단 또는에서 발전을 체포하여 독성 매니페스트 또는 비정상적인 개발 (그림 5A-C)를 부과하여.
P.에서 그림 1 얻기 배우자 miniata 성인. A) 절제 싶을 때 생식선은 암 기단 측에 절개이 절개에서 가져온 어두운 갈색 물질) 동물. B의 중간에 장 조직이다. 그것은 다음과 같이 난소 조직 색상 일반적으로 오렌지입니다) 동물. C 다칠 것뿐만 아니라, 노란색 또는 밝은 갈색이 될 수 있으므로 창자 조직을 당겨하지 마십시오. 같이 D) 고환, 컬러에 흰색 또는 베이지 색입니다. 모든 스케일 바는 1cm를 나타낸다.
그림 2의 성숙과 난자의 수정. 성숙을위한 준비가) 건강한 난자는 볼 수 생식 소포. B) 성숙을위한 준비가되지 않은 모양. C) 1-methyladenine와 성숙 된 난자에 작은 갈색 및 입자가 거칩니다 난 모세포와 크고 명확하다 . 새싹 소포는) 페르 둘러싸인 수정란을. 세분화 D있다ilization 봉투입니다. E)이 난자를 여과에 의해 제거되지 않기 때문에 성숙 할 수없는 큰 난자와 문화를 피하십시오. 이러한 난자는 A의 일보다 약간 작고 어두운 갈색과 거친 질감입니다. 의 스케일 바는 50 μm의 의미와 이미지의 AE의 규모를 나타냅니다.
조립 3 장치를 그림. AA ') 50 ML 원뿔 관에 고정 메쉬 필터. 튜브와 뚜껑의 중간의 테이퍼 엔드 배양 관과 필터. B) 60 X 15mm 폴리스티렌 배양 접시의 뚜껑으로 구성 사출 요리를 통해 주입 할 수 있도록 잘라. 중앙의 주위에 그려진 원은 주입 현미경의 시야를 설명하고 노 배아위한 가이드 역할을한다. 라인은 INT 득점오 요리는 주사 바늘을 깨는 데 유용합니다. CC ') 입 피펫 설정입니다. 몇 피트 길이의 고무 튜브의 한쪽 끝으로 마우스 피스를 장착한다. 간단히 용해에 의해 형성 된 파스퇴르 피펫, 다른 쪽 끝을 장착하고 회로도가 배아를 손상시키지 않고 고집 촉진 할 수있는 이상적인 노 파스퇴르 피펫의 모양과 폭을 시연) 유리합니다. D의 좁은 끝을 당겨. 뽑아 피펫의 끝을 전원 차단시 단부가 얻어 접시에서 부동 신흥 접합자 않도록 테이퍼 경우 유용하다. 모든 스케일 바는 3cm를 나타낸다.
그림 4 시약 성공적으로 미세 주입에 의해 도입. A) GFP 리포터 플라스미드를 주입 blastula 단계 배아의 DIC. 배아가 정상적인 형태를 가지고있다. B) GFP의 expreA.의 C에 표시된 배아)이 형태 학적으로 정상 blastula 단계의 배아. D) C에서 하나의 배아의 DIC 이미지의 ssion 텍사스 레드 덱스 트란의 도입에서 붉은 형광을 방출한다. 다른 배아 않은 주입하고 형광을 전시합니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 에서 스케일 바는 C에서 A와 B 스케일 바의 규모를 나타내는 C와 D의 규모를 나타냅니다
배아 체포 체포되거나 비정상적인 개발. 모든 이미지는 배아의 동일한 주입 배치에서 24 시간 후 분사이다. AA 그림 5 Overinjection 및 시약 독성 결과 ') 한 세포 단계에서 체포 overinjected 접합자. BB') 초기 절단한다. 이 배아 체포 동안 건강한 배아는 대칭 적으로 나눕니다비정상적인 세포 분열로 인해. CC ')에 의한 독성 격렬 비정상적인 개발 배아. 이 배아가 대략 blastula 배아 (D)와 같은 모양이지만, 그것은 올바르게 blastula 단계 배아를 주입 비대칭 현상 처리 및 비정상적으로 두꺼워. DD ')이다. 에서 스케일 바는 50 μm의 의미와 모든 패널의 크기를 나타냅니다.
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Discussion
이 기술의 초보 사용자 어렵지만 성공적으로 morphant 배아를 만들기위한 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 성숙하고 적절하게 비옥 것이다 건강한 난자를 선택하는 것입니다. 배양 정상적인 발달의 비율이 계절에 따라, 동물의 건강과 난자들이 단일 개별에서 수확 된 횟수. 난 모세포 월 ~ 10 년 4 ~ 더 나은 품질의 경향이있다. 그것은 대부분의 그림 2A보다는 그림 2B처럼 수 있도록 진행하기 전에 난자을주의 깊게 보는 것이 중요하다. 그것은 그들이 난자가 처리 될 때 필터링하기에 충분히 작은 경우 특히 성숙되지 모세포의 수가 적은하도록 허용된다. 때때로, 미개발 난자의 성숙을위한 준비가 완벽하게 개발 된 난자만큼이나 크다. 그들은 그들의 거친 갈색 colorin의 구별하여g (그림 2E). 여과 미개발 난자에서 완전히 개발 된 난 모세포를 분리하지 않을 것이며 그들은 종종 그림 5에서 볼 수있는 결함을 나타낼 가능성이 더 높습니다 비정상적인 배아 배양 결과 때문에 이러한 유형의 난자의 일괄 처리를 사용하지 마십시오.
다른 중요한 단계는 볼 루스 주사의 크기이다. 비특이적 효과를 초래할만큼 효과를 발휘하기에 충분히 큰 있지만 그렇게 크지 않은 섭동 시약의 양을 소개한다. 섭동 시약이 사용되는 처음에는 여러 시약 농도가 시도되는 적정을 수행하는 데 도움이된다. 예상되는 표현형, 지연 개발 (그림 5A)와 관련이없는 발달 이상을 일으키지 않는 가장 높은 농도 이후 microinjections을 수행합니다. 이 정상적인 발달을 방해 할 수 있으므로 30 %를 초과 배아의 직경 루스를 주입하지 마십시오. 공동에 의해 지나치게 작은 볼 루스 크기,ntrast, 시각적으로 반복 실험에서 섭동 표현형의 과도한 범위로 이어질 수있는 일관성있는 크기에 대한 검사에 어렵다.
교란 시약은 유효 농도 범위에서 발달 지연 또는 비 특정 표현형의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 표준 제어 MASO, 표준 DNA 구조, 또는 로다 민 트레이서로서 양성 시약 형제 제어를 주입하는 것이 매우 중요하다. 이러한 컨트롤은 정상적인 발달을 표시하는 경우에만 분석 morphant 배아. 컨트롤을 포함하여 주입 된 배아는, 때때로 주름 blastula 표현형을 전시하지만 그들은 자주 일반적으로 개발의 나머지 부분을 통해 진행됩니다. 특정 시약을 지속적으로 결과 morphant 배아 발달 지연이 발생하는 경우 또한, 그들이 경험하고 얼마나 많은 지연 시간을 결정하기 위해 배아를 제어하기 위해 이러한 배아를 비교합니다.
들에서 그 유용성을 제한 할 수있다이 방법의 몇 가지 특성이 있습니다pecific 실험 시나리오. 그러한 문제는 하나는 수정란 또는 초기 분열 단계에서 시약을 도입 할 수 있다는 사실이다. 관심의 유전자 또는 경로가 inviable 초기 개발 및 결과 morphant 배아에서 특히 중요하거나 의미있는 연구가 너무 발달에 이상이 경우에 특히 문제가있다. 때때로이 문제는 완만 불완전 최저의 결과가 혼란 시약의 적은 사본을 주입하여 해결됩니다. 표적 유전자 또는 통로를위한 적절한 세포 투과성 약물이 존재하지 않으면, 그 후, 더 적절한 단계에서 약품 처리 된 배아와 수정란 단계에서 시약 주입, 배아의 표현형과 비교하는 것이 도움이된다. MASOs 또는 mRNA를 주입 큰 특이성을 제공하기 때문에, 약물 치료 대신 마이크로 인젝션 포기 대조적으로 약물 치료 연구와 관련하여이 방법을 사용하는 것이 더 강력하다.
마지막으로,이 마이크로 비록주입 방법은 기껏해야 몇 100-1000 건강한 성공적 주입 배아를 만들어, 하류 다양한 애플리케이션을 위해 배아의 충분한 양을 생산할 것이다. 일부 원하는 실험은 이것보다 훨씬 더 많은 자료를 필요로 할 수있다. 이 방법은 소설 아직 널리 사용되었습니다되지 않았지만 성공적으로 성게 시스템에서 사용되는 다른 방법, 예를 pantropic 레트로 바이러스 20 morphant 바다 별 배아의 더 큰 숫자를 만들기 위해 수정 될 수있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌은 저자에 의해 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IOS 0,844,948 및 1,024,811 IOS에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , UBC Press. (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al.
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A.
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
