Summary
Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.
Abstract
Stekelhuidigen zijn al lang een favoriet model voor studies van voortplanting en ontwikkeling, en meer recent voor de studie van genregulatie en evolutie van ontwikkelingsprocessen. De zee ster, Patiria miniata, is het verkrijgen van de prevalentie als een modelsysteem voor dit soort studies die vroeger bijna uitsluitend werden uitgevoerd in de zee-egels, Strongylocentrotus purpuratus en Lytechinus variegatus. Een voordeel van deze modelsystemen is het gemak van productie gemodificeerde embryo waarin een bepaald gen omhoog of omlaag gereguleerd gegevens voor een groep cellen, of het introduceren van een reportergen. Een enkele microinjectie werkwijze in staat is om een grote verscheidenheid van dergelijke gemodificeerde embryo. Hier presenteren we een werkwijze voor het verkrijgen van gameten P. miniata, produceren zygotes, en de invoering van storende reagentia via micro-injectie. Gezonde morphant embryo's worden vervolgens geïsoleerd voor kwantitatieve en kwalitatieve studies van gene functie. De beschikbaarheid van genoom en transcriptome gegevens voor dit organisme heeft de soorten onderzoeken die zijn uitgevoerd en het gemak van de uitvoering ervan verhoogd.
Introduction
De zee ster, Patiria miniata, (algemeen bekend als de bat-sterren) is in opkomst als een interessant en veelzijdig model voor een verscheidenheid van cellulaire 1 tot 3, ontwikkelingsstoornissen 4,5, evolutionaire 6-8, en ecologisch onderzoek 9- 11. Volwassen P. miniata zijn verdeeld langs de Pacifische kust van Sitka, Alaska naar Baja, Californië 12 en worden gemakkelijk gehandhaafd in zeewateraquaria. Eicellen zijn verkrijgbaar het hele jaar door en elk vrouwtje kan werpen tienduizenden eieren. Eicellen zijn gemakkelijk gerijpt en extern 13 bevrucht. De resulterende embryo's zijn transparant waardoor u gemakkelijk observatie; zij ontwikkelen synchroon en vereisen slechts zeewater voor ontwikkeling. Gehele genoom assemblage en meerdere transcriptomes zijn ook beschikbaar voor P. miniata ( Echinobase.org ). Dergelijke voordelen maken ze ideaal voor een scala van onderzoeken onderwijsdoeleinden.
In de afgelopen jaren, P. miniata is uitgegroeid tot een model voor de ontwikkelingsbiologie genregulerend netwerkanalyses 14-16. Het doel van deze studies is de volledige compliment van regulerende genen en het netwerkadres bepalen van hun interacties. Veel van dit werk betekent storende genexpressie door invoering van antisense oligonucleotiden of in vitro gesynthetiseerd mRNA. Daarnaast zijn cis regulerende analyses gebruikt om de functie van regulatoire DNA 15 karakteriseren. Deze analyses vereisen invoering van verstoring reagentia en / of DNA reporter constructen in embryo. Teneinde voorts de stroomafwaartse effecten van deze verstoringen karakteriseren, moet men vele embryo testen op veranderingen in genexpressie van potentiële doelwitten. Technieken voor micro-injectie van zygoten honderden centraal voor dit werk.
Stekelhuidigen, waaronder P. miniata de novo door micro-injectie. Micro-injectie biedt de mogelijkheid om embryo's te wijzigen met reagentia die niet cell-permeabel. Het volgende protocol beschrijft een methode om DNA, mRNA, cel tracers en morfolino antisense oligonucleotiden introduceren in honderden bevruchte eieren in een 2-3 uur zitten door middel van micro-injectie. Dit levert voldoende materiaal voor verschillende stroomafwaartse experimenten waaronder, maar niet beperkt tot, qPCR, in situ hybridisatie, RNA-Seq en western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Houd alle zeewater of kunstmatig zeewater (SW), volwassen dieren, en culturen bij 15 ° C zo veel als praktisch is. Zorgen voor eieren en Zygoten worden gehouden ondergedompeld in SW.
Commercieel bereid zee zouten opgelost in gedestilleerd water of osmosewater fungeert zowel als een bron van SW. Controleer het zoutgehalte met een hydrometer en zouten of water aan te passen aan een optimaal niveau te bereiken. Blijf dichtheid niveaus tussen 1,020-1,025. Houd alle uit glas en plastic te scheiden van alle andere laboratorium om besmetting met chemicaliën te voorkomen. Schoon embryo rang laboratorium door spoelen met gedeïoniseerd water of incidentele onderdompelen in verdunde natriumhypochloriet, gevolgd door verscheidene malen spoelen met water.
1 Het verkrijgen en rijping van gameten Patiria miniata Volwassenen
- Selecteer een dier geslachtsklieren accijnzen. Bepaal sex na excisie door te kijken naar de aanwezigheid van eierstokken en testes omdat P. miniata zijn niet sexually dimorphic.
- Snijd een kleine opening, niet groter dan 1 cm, langs de kant van een zee ster arm met een scalpel (Figuur 1A). Met behulp van kleine-stomp pincet terugtrekken randen van de incisie om de gonaden weefsel en trek gonad weefsel via de incisie.
OPMERKING: Vermijd trekken darmweefsel, dat een losse grijs of bruin weefsel (Figuur 1B). Eierstokken zijn meestal oranje, geel of licht bruin (figuur 1C), terwijl de testes zijn wit of beige en wanneer verstoord zal veroorzaken zeewater te melkachtig of troebel is (figuur 1D) geworden. - Terug vrouwtjes naar de aquaria. Isoleer mannen voor een uur of twee in een container van SW, omdat de stress van behandeling kan paaien veroorzaken. Dieren genezen langs de incisie en blijven gameten voor verscheidene maanden.
- Verzamel testes in een 1,5 ml Eppendorf buis met zo weinig mogelijk SW en opgeslagen op ijs tot gebruik. Bewaren alle testes niet onsed op de dag van inzameling bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
- Verzamel eierstokken in een kleine glazen cultuur schotel in een enkele milliliters SW. De eicellen vrij uit de eierstok weefsel plagen elkaar het weefsel met twee paar pincetten tot er geen grote stukken blijven.
OPMERKING: Optimaal is de meerderheid van de oöcyten volledig ontwikkeld. Dergelijke eicellen zijn groot, rond en helder geel of lichtbruin met een duidelijke kiemblaasje in de eicel (Figuur 2A), tegenover de subset van onontwikkelde eicellen die kleiner, bruin, korrelig en ondoorzichtige (Figuur 2B). Indien groter dan ongeveer 25% van de eicellen van de onontwikkelde variëteit, selecteer een ander vrouwtje om eicellen te verkrijgen. - Giet de eicellen en het resterende weefsel door een zeef beker met een 200 micrometer poriegrootte en verzamel doorstromen. Hierdoor worden alle varianten van eicellen bevatten, maar verwijder eierstokweefsel. Verjagen overgebleven eicellen uit het weefsel gevangen door het filter door middel van spuiten wet SW van een spuit fles. Filter cups zijn gemaakt met een 50 ml conische buis (figuur 3A-A ').
- Giet de doorstroming van stap 1.6 door middel van een 100 um zeef cup. Gooi kleine eicellen in doorstroming. Grote volledig ontwikkelde eicellen die klaar zijn voor de rijping blijft op het filter zijn. Spoel de eicellen in een schone beker van 200 ml.
- Voeg 95 ml van de SW aan de 200 ml bekerglas van eicellen. Voeg 5 ml van 200 uM 1-methyladenine een eindconcentratie van 10 uM.
- Breng de eicellen een grote ondiepe kweekschaal en plaats bij 15 ° C. Een hoge oppervlak tot volume kweekschaal maakt zuurstofuitwisseling. De eicellen niet rijpen dan niet goed ontwikkelen als ze overvol tijdens deze rijping fase. Opgesplitst in verschillende gerechten van SW plus 10 uM 1-methlyadenine tot cultuur is minder dan 200 eicellen / ml.
- Laat de eicellen rijpen 45-90 minuten, maar niet meer als deze de oöcyten niet zijn zal maken fertilized. Om te bepalen of rijping voltooid is, op de oöcyten onder ontleden scope. De kiemblaasje beweegt naar en zekeringen met de celmembraan tijdens de rijping. Het Dan bezwijkt en dus niet meer zichtbaar in rijpe oöcyten (figuur 2C).
2 Bemesting van rijpe eicellen
- Koos voor een kleine cluster van testis weefsel, ongeveer grootte van een erwt, en gehakt in een kleine glazen cultuur schotel met ongeveer 1 ml van de SW.
- Met een Pasteur pipet 2-3 druppels van de verkregen melkachtige zeewater dragen aan ongeveer 100 ml van het rijpe oöcyten en zwenk de kweekschaal te mengen. Vermijd overdracht stukjes testis weefsel. Vermijd het toevoegen van grotere hoeveelheden sperma, omdat dit kan leiden tot polyspermie en de daaropvolgende slechte ontwikkeling.
- Na enkele minuten houden aan de eicellen onder een dissectie scope. Bevruchte eieren of zygoten, een bemesting envelop, een doorzichtige koepel die stijgt van de cell membraan (figuur 2D).
OPMERKING: Ga niet verder met de cultuur als minder dan ongeveer 90% van de eieren te bevruchten, omdat slechte bevruchting tarieven zijn een indicatie van een ongezonde cultuur die kan ook niet goed ontwikkelen. - Na de bevruchting is voltooid, verandert de SW op de zygotes door het gieten door een 100 um zeef en spoelen in een cultuur schotel met verse SW. Het is belangrijk om de overmaat sperma zuurstofgebrek voorkomen verwijderen. Plaats de kweekschaal bij 15 ° C gedurende 15-30 minuten.
3 De-jellying en Roeien bevruchte eieren
- Bereid injectie maaltijden door nemen van de deksel van een 60 x 15 mm polystyreen Petri dish.
- Teken een permanent markeerstift lijn op de achterkant van de schaal ter plaatse van het gezichtsveld overeenkomt met de micro-injectie microscoop. Dit zorgt ervoor dat alle geroeid embryo's zijn binnen de microscoop gezichtsveld.
- Gebruik een glazen Pasteur pipet om een lijn te scoren door de cirkel, preferably aan een kant van de cirkel (Figuur 3B). Gebruik deze lijn later injectienaalden (Stap 4.5) te doorbreken.
OPMERKING: Reagentia vaak gebruikt voor zee-egel embryo's, bijvoorbeeld, protamine sulfaat of poly-L Lysine, overbodig houden. De-jellied P. miniata zygotes kleven heel goed op ongecoate plastic. Let op dat ze niet goed vasthouden aan glazen schalen.
- Voeg ongeveer 10 ml SW bij elk gerecht, zodat het oppervlak bedekt is, maar het water zal niet overmatig spatten in het gerecht als dit Geroeide embryo's kunnen verstoren.
- Verwijder de P. miniata zygote gelei jas met zuur SW voorafgaand aan roeien. Deze jelly jas is uitgebreider dan die waargenomen voor model zee-egel soorten.
- Bereid zuur SW in het bereik van pH 4,0-4,2. De pH-waarde is essentieel voor efficiënte verwijdering van jelly jas staan terwijl het toelaten van de normale ontwikkeling.
- Voeg enkele druppels van 1 N (1 M) HCl in SW naar een 1 L voorraad van SW. Laat iedere druppel volledig wordt gemengden bewaken pH vóór toevoegen van meer HCl.
OPMERKING: Een enkele ml HCl resulteert in de geschikte pH, maar niet het gehele volume tegelijk toevoegen.
OPMERKING: Maak 1 N HCl in zuurkast met SW en 12 N (12 M) HCl. - Verwijder SW op zygoten door ze gieten op een 100 um zeef. Spoel in een 200 ml bekerglas in de kleinste hoeveelheid SW mogelijk (ongeveer 10 ml). Vul de beker tot 150 ml met zuur SW (pH 4,0) en laat de zygoten zitten in het zuur SW 3 min.
- Strippen gelei jas uit de zygotes door het gieten ze heen en weer tussen twee 200 ml bekers, elke keer passeren van de zygoten door een 200 micrometer zeef. Giet de zygoten door het filter rond 5-10x gedurende ongeveer 2 minuten tijdskader.
- Verwijder zuur SW door overgieten zygoten op een 100 um zeef. Spoel de zygoten in een kleine glazen cultuur schotel met SW. De-jellied zygotes kan vasthouden aan plastic schaaltjes. Rij embryo's onmiddellijk; ze beginnen te meer j producerenelly vacht die leidt tot een slechte hechting aan plastic schaaltjes tijd.
- Gebruik mondpipet (Figuur 3C-C ') op te halen zygotes uit het glas cultuur schotel en leg ze in een rechte lijn op de injectie gerechten. Smelt het midden van de dunne kant van een Pasteur pipet boven een vlam tot het glas zacht. Snel trek de uiteinden van de glazen elkaar om een zeer dunne strook van glas te produceren. Zodra het glas is afgekoeld, breek het smalle uiteinde van het Pasteur pipet (voor aanvullende informatie over het voorbereiden van een mond pipet zie Wessel et al. 2004 17 of Sweet et al. 2004 18).
- Wordt roeien pipet zodanig dat de diameter net groter is dan de diameter van de embryo zodat slechts een enkele zygote zal in en uit de pipet tegelijk. Dit zal toestaan dat een enkele rij te vormen. Kleinere pipetten diameter kan de bevruchting envelop strippen en verstoren de zygoten als P. miniata zygotes hebben geen hyaline membraan eennd zijn vrij zacht.
- Als de zygotes niet houden aan de plastic schotel, bewaar ze voor extra tijd in zuur SW (tot enkele minuten). Als alternatief kan een kleinere diameter pipet kan helpen bij het verwijderen van gelei jas zodat de zygotes om effectiever te plakken.
- De zygoten zijn iets positief drijfvermogen en hebben de neiging te drijven of zweven boven de bodem van de schaal. In dat geval plaatst u het roeien pipet zodat de zygotes voorzichtig worden geperst op het oppervlak van de schotel als ze de pipet (Figuur 3D) af te sluiten.
OPMERKING:. Het is toegestaan om vele rijen passen op deze gerechten P. miniata embryonale membranen niet moeilijker te penetreren tijd en daarom kan men honderden zygoten injecteren van een gerecht.
4 Injectie van Zygotes
- Bereid injectieoplossingen met geschikte concentraties van morfolino antisense oligonucleotiden (MASO), mRNA of DNA in een eindconcentration 200 mM KCl. 400-800 uM MASO en 2,5 ng / ul van DNA hebben de neiging om morphant fenotypes produceren terwijl het minimaliseren van toxiciteit. De eindconcentratie in het ei zal 1/125 ste de beginconcentratie 14. Voor injectieoplossingen die MASOS, warmte 65 ° C gedurende 5 minuten onmiddellijk voor gebruik en bewaar bij kamertemperatuur.
- Voor het gemak sorteren geïnjecteerde embryo, commentaar rhodamine dextran tracer aan de injectieoplossing om een concentratie van 0,1% verkregen.
- Bereid injectienaalden door aan glazen capillaire buis (1,0 mm OD x 0,75 mm ID, 100 mm lengte) in een naald trekken instrument volgens de instructies van de fabrikant. Naalden geschikt voor injectie in zee-egels ook goed werken voor zeesterren, dus gebruik van soortgelijke parameters 19.
- Laad ongeveer 2 ui injectieoplossing in een injectienaald met een microloader pipetpunt.
- Plaats het stompe einde van de naald in de manipulator. Stel picospritzer 100 msec puls en een luchtdruk van 40 psi.
- Plaats een schotel van geroeid embryo's op de microscoop podium en alle embryo's in het gezichtsveld van. Oriënteren de schotel zodanig dat de ingesneden lijn aan de zijde het dichtst bij de naald. Plaats de naald onder een hoek van ongeveer 60 ° zodat de punt in het midden van de lijn en boven het oppervlak van het water.
- Focus op de ingesneden lijn en laat de naald tot aan de punt komt in beeld. Laat de tip een beetje meer en breek hem open draaien door hem voorzichtig in de randen van de ingesneden lijn. Breng de punt van het oppervlak van de schaal en plaats het bovenaan de eerste rij van zygoten en focus op de zygoten.
- Laat de tip zodanig dat het het centrum van de zygote komen uit rond een hoek van 60 ° zal spietsen. De naald dringt makkelijk P. miniata zygotes. Trap het voetpedaal (of ander materiaal dwingen van de injectienaald) een bolus van Inje introducerenctie oplossing in het embryo.
- Doel een bolus die 20-30% van de diameter van de embryo, of tussen 25 en 80 pl. Indien de bolus groter of kleiner dan dit, passen de duur van injectie in de picospritzer en injecteer de volgende embryo. Blijf de duur op de gewenste bolusgrootte verkrijgen. Beginnen op 100 msec. Opnieuw breken de naald indien groter dan ongeveer 200 msec nodig om de juiste bolus voeren. Gooi de naald en een nieuwe te bereiden als minder dan 15-20 msec is nodig om deze bolusgrootte verkrijgen als de naald is te groot en kan de normale ontwikkeling verstoren.
- Ga verder met de resterende zygotes injecteren op de injectie schotel. Embryo's kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd tot splitsing begint en in enkele blastomeren na de eerste splitsing. Periodiek til de naald boven het wateroppervlak te zygoten die stok op de naald te verwijderen. Indien noodzakelijk opnieuw breken de punt van de naald of plaats een nieuwe naald indien blokkering optreedt.
- Laat de embryo's ontwikkelen bij 15 ° C in SW. Een hoge oppervlak tot volume in de kweken om voor zuurstofuitwisseling. Zorgen embryo's zijn niet overvol; houden kweken op of onder 200 embryo / ml. Afhankelijk van de gewenste fase van embryo, van plan om geïnjecteerde embryo's te verzamelen om ongeveer 20-24 uur na de bevruchting.
OPMERKING: Dit is vaak een ideale tijd om te sorteren en te verzamelen en omdat normaal ontwikkelende embryo's worden snel morfologisch onderscheiden, maar zijn nog niet zwemmen. - Als embryo's uitgekomen, zacht zout schok voor het zwemmen te voorkomen. Voeg 200 ul van 5 M NaCl tot 10 ml van SW in de injectie gerecht terwijl voorzichtig schudden van de SW. Na een paar minuten, zullen de embryo's vallen op de bodem van de schaal. Verzamel deze en verplaats deze naar de normale zoutgehalte SW.
- Verzamel geïnjecteerde embryo's onder een geschikte fluorescerende lichtbron compatibel met de tracer in de injectieon oplossing. Indien geen tracer gebruikt rangschikken embryo te selecteren op normale morfologie.
- Met mondpipet opneming fluorescerende embryo met een minimale hoeveelheid SW en blaas ze uit in een kleine kweekschaal gevuld met SW. Ideaal mond pipetten over een voldoende grote opening voor embryos in en uit te trekken zonder deze te beschadigen, maar niet zo groot dat ongewenste embryo en vreemde SW ook worden opgetrokken.
- Zodra alle gewenste embryo's zijn verzameld in de nieuwe schaal, rekening met de embryo's onder tl-licht en verwijder alle niet-geïnjecteerde embryo of slecht ontwikkelde embryo's.
- Cultuur naargelang embryo's om de gewenste stappen in een incubator en verder te gaan met beeldvorming of andere gewenste protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van dit protocol is om de reagentia te introduceren in embryo's. We tonen de effectiviteit van het protocol door het injecteren van een DNA-reporter-construct dat de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) aandrijft. Geïnjecteerde embryo express GFP in klonale pleisters (Figuur 4A-B) als de DNA bevat tijdens de vroege splitsing. Veel reagentia die wenselijk om in embryo zijn giftig in grote hoeveelheden en suboptimale partijen embryo. Toxiciteit manifesteert door het uitstellen van de ontwikkeling, het arresteren van de ontwikkeling in de vroege splitsing of de bevruchte eicel podium, of door het opleggen van een afwijkende ontwikkeling (figuur 5A-C).
Figuur 1 Het verkrijgen van gameten van P. miniata volwassenen. A) Om accijnzen geslachtsklieren maken een incisie aan de zijkant van een arm proximalehet midden van het dier. B) Het donkerbruine materiaal getrokken uit deze incisie darmweefsel. Vermijd trekken darmweefsel omdat het dier. C verwonden) eierstokweefsel typisch oranje kleur zoals hier getoond, maar kan ook geel of lichtbruin zijn. D) testes wit of beige van kleur, zoals weergegeven. Alle schaalbalken duiden 1 cm.
Figuur 2 rijping en bevruchting van eicellen. A) gezonde eicellen die klaar zijn voor maturatie zijn groot en helder met een zichtbare kiemblaasje. B) Eicellen die niet gereed zijn voor rijping kleiner, bruin en korrelig uiterlijk. C) een oöcyt die Na rijping met 1-methyladenine . De kiemblaasje heeft afgebroken. D) Een zygote omgeven door een fertilization envelop. E) Vermijd kweken met grote eicellen te kunnen rijpen omdat deze eicellen niet worden verwijderd door filtratie. Dergelijke eicellen zijn iets kleiner dan in A. en donkerder bruin en korrelig geweven. De schaal bar in A geeft 50 micrometer en vertegenwoordigt de schaal voor de afbeeldingen AE.
Figuur 3 Apparatuur voor de montage. AA ') een zeef bevestigd aan een 50 ml conische buis. Het versmalde uiteinde van de buis en het midden van het deksel zijn uitgesneden om culturen door de buis en filter. B) Een injectie schotel gemaakt van het deksel van een 60 x 15 mm polystyreen kweekschaal te gieten. Een cirkel getrokken rond het centrum schetst het gezichtsveld van de injectie microscoop en dient als leidraad voor het roeien embryo. Een lijn scoorde into de schotel is handig voor het breken van injectienaalden. CC ') Mond pipet set-up. Monteer een mondstuk in een einde van een enkele meter lange rubberen buis. Plaats het andere einde aan een Pasteur pipet, die is gevormd door kort smelten en het trekken van de smalle kant van het glas. D) Schematische demonstreren een ideale roei pasteurpipet vorm en breedte te bevorderen plakken zonder beschadiging van embryo's. Bij het breken van het einde af van de getrokken pipet, het is handig als het einde taps te voorkomen dat opkomende zygotes wegdrijven van de schotel. Alle schaalbalken duiden 3 cm.
Figuur 4 Reagentia succes geïntroduceerd door micro-injectie. A) DIC van een blastula stadium embryo geïnjecteerd met een GFP reporter plasmide. Het embryo heeft een normale morfologie. B) GFP expression in het DIC beeld van twee morfologisch normale blastula stadium embryo's. D) Een embryo van C embryo getoond in A. C) geeft een rode fluorescentie van de invoering van Texas Red dextran. De andere embryo is un-geïnjecteerd en vertoont geen fluorescentie. Schaalbalken duiden 50 urn. Schaalbalk in A de schaal van A en B. Schaalbalk in C de schaal voor C en D.
Figuur 5 overinjectie en reagens toxiciteit resultaat in gearresteerd of afwijkende ontwikkeling. Alle beelden zijn van embryo's 24 uur na de injectie van dezelfde injectie batch. AA ') Een overinjected zygote gearresteerd bij de een-cel stadium. BB') Een embryo gearresteerd begin splitsing. Een gezonde embryo zal symmetrisch verdelen, terwijl deze embryo gearresteerdals gevolg van abnormale celdelingen. CC ') Een embryo met wild afwijkende ontwikkeling als gevolg van toxiciteit. Hoewel deze embryo wordt gevormd ruwweg als een blastula embryo (D) is asymmetrisch en abnormaal verdikt. DD ') een harmonische ontwikkeling geïnjecteerd blastula stadium embryo. Schaal bar in A geeft 50 micrometer en vertegenwoordigt de schaal voor alle panelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen die moeilijk zijn voor beginnende gebruikers van deze techniek zijn, maar zijn essentieel voor het succesvol creëren van morphant embryo. De eerste is het selecteren van gezonde eicellen die rijpen en goed bemesten. Het percentage normale ontwikkeling in een cultuur afhankelijk van het seizoen, de gezondheid van de dieren en het aantal keren dat de eicellen van een enkel individu geoogst. Eicellen meestal van betere kwaliteit van april tot en met oktober te zijn. Het is van belang te letten op de oöcyten alvorens dat de meeste lijken Figuur 2A plaats Figuur 2B. Het is toegestaan om een klein aantal eicellen die niet rijp, vooral als ze klein genoeg om te filteren de oöcyten verwerkt hebben. Af en toe, eicellen die onontwikkeld zijn, zijn bijna net zo groot als volledig ontwikkelde eicellen die klaar zijn voor de rijping zijn. Ze zijn herkenbaar aan hun korrelige, bruine coloring (figuur 2E). Niet batches van eicellen van dit type gebruiken omdat filtratie niet isoleren volle eicellen van onontwikkelde eicellen en vaak resulteren in abnormale embryo culturen die meer kans om de gebreken waargenomen in figuur 5 vertonen.
De andere belangrijke stap is het injecteren bolusgrootte. Breng een hoeveelheid van storende reagens die voldoende groot is om een effect te hebben, maar niet zo groot dat niet-specifieke effecten hebben. De eerste keer dat een storende reagens wordt gebruikt, is het nuttig om een titratie waarin verschillende concentraties reagens geprobeerd voeren. Opeenvolgende micro-injecties met de hoogste concentratie die geen ontwikkelingsstoornissen veroorzaken afwijkingen die verband houden met de verwachte fenotype of vertraging ontwikkeling (figuur 5A) zijn. Vermijd het injecteren van een bolus die groter is dan 30% van de diameter van het embryo als deze normale ontwikkeling verstoren. Overdreven kleine bolus maten, door contrast, zijn moeilijk om visueel te inspecteren voor consistente dimensionering die kan leiden tot een te grote waaier van verstoring fenotypes over replica's.
Storende reagentia kunnen ontwikkelingsstoornissen vertragingen of niet-specifieke fenotypes bij effectieve concentratie ranges veroorzaken. Het is daarom belangrijk om sibling controles injecteren met een goedaardige reagens zoals een standaard control MASO, standaard DNA-constructen of rhodamine tracer. Assay morphant embryo's alleen als deze controles vertonen een normale ontwikkeling. Geïnjecteerde embryo, inclusief controles, kunnen soms een gerimpeld blastula fenotype maar zullen vaak verder door de rest van ontwikkeling normaal. Bovendien, als een bepaald reagens veroorzaakt consequent ontwikkelingsstoornissen vertragingen in de resulterende morphant embryo's, vergelijk deze embryo's om embryo's te controleren om te bepalen hoeveel uren vertraging die zij ervaren.
Er zijn een aantal kenmerken van deze methode zijn nut s kan beperkenijzondere experimentele scenario's. Een dergelijk probleem is dat slechts reagentia aan bevruchte ei of vroege splitsing stadia introduceren. Dit is vooral problematisch als het gen of de route van belang is vooral belangrijk in de vroege ontwikkeling en de daaruit voortvloeiende morphant embryo's worden inviable of te developmentally abnormaal voor een zinvolle studie. Soms wordt dit probleem opgelost door het injecteren minder exemplaren van de storende reagens resulteert in een zachtere, incomplete knockdown. Indien een geschikte cel-permeabele geneesmiddel voor het doelwitgen of plaatsing bestaat, is het nuttig te vergelijken fenotype van de embryo geïnjecteerd met reagentia op bevruchte eicel podium embryo's behandeld met het geneesmiddel in een later meer passend stadium. Door injectie van MASOS of mRNA biedt grotere specificiteit, is krachtiger om deze methode te gebruiken in combinatie met een geneesmiddel-studiepopulatie tegenover microinjectie verlaten ten gunste van behandeling met geneesmiddelen.
Tenslotte, hoewel dit microinjectiemethode een voldoende hoeveelheid embryo's voor diverse downstream toepassingen, zal het beste produceren enkele 100-1000 gezonde, goed geïnjecteerde embryo. Sommige gewenste experimenten kunnen aanzienlijk meer materiaal dan dat vereisen. Andere werkwijzen met succes gebruikt in de zee-egel systeem kan worden aangepast om tot grotere aantallen morphant zee ster embryo, zoals pantropische retrovirussen 20 maken, maar deze werkwijze is nieuw en nog niet verworven algemeen gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard door de auteurs.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation IOS 0844948 en IOS 1024811
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , UBC Press. (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al.
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A.
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
