I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un metodo per la microiniezione di Patiria minata zigoti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Echinodermi sono stati a lungo un sistema modello preferito per gli studi di riproduzione e sviluppo, e più recentemente per lo studio della regolazione genica e di evoluzione dei processi di sviluppo. La stella di mare, Patiria miniata, sta guadagnando prevalenza come sistema modello per questo tipo di studi, che in precedenza erano svolte quasi esclusivamente nei ricci di mare, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Un vantaggio di questi sistemi modello è la facilità di produzione di embrioni modificati in cui un particolare gene è attivo o inibiti, etichettare un gruppo di celle, o introdurre un gene reporter. Un metodo microiniezione unico è in grado di creare un'ampia varietà di tali embrioni modificati. Qui, vi presentiamo un metodo per ottenere gameti da P. miniata, producendo zigoti, e l'introduzione di reagenti perturbanti tramite microiniezione. Embrioni sani morphant sono successivamente isolati per studi quantitativi e qualitativi di gefunzione ne. La disponibilità di genoma e trascrittoma dati di questo organismo ha aumentato i tipi di studi che vengono eseguite e la facilità di loro esecuzione.
Introduzione
La stella di mare, Patiria miniata, (comunemente noto come la stella pipistrello) sta emergendo come un interessante e versatile sistema modello per una varietà di cellulare da 1 a 3, dello sviluppo 4,5, evolutiva 6- 8, e studi ecologici 9- 11. Adult P. miniata sono distribuiti lungo la costa del Pacifico da Sitka, in Alaska a Baja, California 12 e sono facilmente mantenuti in acquari marini. Gli ovociti sono tutto l'anno ottenibili e ogni femmina può gettare decine di migliaia di uova. Gli ovociti sono facilmente maturati e fecondati esternamente 13. Gli embrioni risultanti sono ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Conservare tutta l'acqua di mare o acqua di mare artificiale (SW), animali adulti, e le culture a 15 ° C per quanto è pratico. Assicurarsi che le uova e gli zigoti sono tenuti immersi in SW.
Sali marini in commercio preparati ricostituiti con acqua distillata o di osmosi inversa serve pure una fonte di SW. Controllare la salinità con un densimetro e regolare sali o acqua per raggiungere livelli ottimali. Mantenere i livelli di peso specifico tra 1,020-1,025. Mantenere la vetreria e plasticware separato da tutti gli altri Equipaggiamento per evitare qualsiasi contaminazione con sostanze chimiche. Pulire embrione di grado da laboratorio....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre i reagenti in embrioni. Dimostriamo l'efficacia del protocollo iniettando un giornalista costrutto di DNA che guida l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP). Embrioni iniettati esprimono GFP a chiazze clonali (Figura 4A-B) in quanto incorpora il DNA durante la prima scissione. Molti reagenti che sono auspicabile introdurre in embrioni sono tossici in quantità elevate e per lotti non ottimali di embrioni. Manifesti di tossicità per rita.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Ci sono due passaggi critici che sono difficili per gli utenti meno esperti di questa tecnica, ma sono essenziali per la creazione di embrioni con successo morphant. La prima è la selezione ovociti sani che matureranno e fertilizzare correttamente. La percentuale di sviluppo normale in una cultura dipende dalla stagione, la salute dell'animale, e il numero di volte che gli ovociti sono stati raccolti da un singolo individuo. Gli oociti tendono ad essere di qualità migliore da aprile a ottobre. E 'importante guar.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati dagli autori.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation IOS e IOS 0844948 1024811
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-metiladenina | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| Filtro in nylon nitex da 190 micron | Piccole parti (originariamente Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| Filtro in nylon nitex da 100 micron | Piccole parti (originariamente Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Piastre di Petri in polistirene, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Tubo capillare | FHC, Inc | 30-30-0 | Per l'estrazione di aghi per microiniezione |
| Modello P-97 Estrattore per aghi | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | Se si inietta un reporter di espressione GFP, è utile sostituire il destrano rosso del Texas come tracciante per iniezione |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster e Smith | CD-116528 | Disponibile anche in molti negozi di animali |
| Punte per microloader | Eppendorf | 5242 956.003 |
Riferimenti
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
