Summary
الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.
Abstract
كانت شوكيات الجلد لفترة طويلة نظام نموذجي المفضل للدراسات الاستنساخ والتنمية، ومؤخرا لدراسة تنظيم الجينات وتطور العمليات التنموية. نجم البحر، Patiria miniata، تكتسب انتشار كنظام نموذج لهذه الأنواع من الدراسات التي أجريت سابقا على وجه الحصر تقريبا في قنافذ البحر، Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus. ميزة هذه الأنظمة النموذج هو سهولة إنتاج أجنة تعديل فيها هو جين معين صعودا أو downregulated، ووضع العلامات مجموعة من الخلايا، أو إدخال الجين المراسل. وهناك طريقة حقن مكروي واحد قادر على خلق مجموعة واسعة من هذه الأجنة تعديل. هنا، فإننا نقدم وسيلة للحصول على الأمشاج من P. miniata، وإنتاج بيضات ملقحة، وإدخال الكواشف مشوشة عبر حقن مكروي. يتم عزل الأجنة morphant صحية في وقت لاحق للدراسات الكمية والنوعية للجنرال الكتريكوظيفة الشرق الأدنى. توافر الجينوم وTranscriptome على البيانات لهذا الكائن الحي ازدادت أنواع الدراسات التي يتم تنفيذها وسهولة تنفيذها.
Introduction
نجم البحر، Patiria miniata، (المعروف باسم نجم الخفافيش) في الظهور كنظام نموذج للاهتمام وتنوعا لمجموعة متنوعة من الخلايا 1- 3، 4،5 التنموية، التطورية 6- 8، والدراسات البيئية 9- 11. الكبار P. وتوزع miniata على طول ساحل المحيط الهادئ من سيتكا، ألاسكا إلى باجا كاليفورنيا 12 ويتم الاحتفاظ بسهولة في الأحواض المائية البحرية. البويضات التي يمكن الحصول عليها على مدار السنة وكل أنثى يمكن إلقاء عشرات الآلاف من البيض. ونضجت بسهولة البويضات المخصبة وخارجيا 13. الأجنة الناتجة شفافة مما يسمح للمراقبة سهلة؛ أن تتطور بشكل متزامن، وتحتاج إلى مياه البحر الوحيد للتنمية. التجمع الجينوم كله وtranscriptomes متعددة متاحة للP. أيضا miniata ( Echinobase.org ). هذه المزايا تجعل يجعلها مثالية لمجموعة واسعة من البحوثوأغراض التدريس.
في السنوات الأخيرة، P. أصبح miniata نظام نموذجي لشبكة تنظيمية الجينات التنموي يحلل 14- 16. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد مجاملة كاملة من الجينات التنظيمية وتحديد شبكة من تفاعلاتها. الكثير من هذا العمل ينطوي على التعبير الجيني من خلال إقلاق إدخال أليغنوكليوتيد] العقاقير أو في المختبر توليفها من mRNAs. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التحليلات التنظيمية رابطة الدول المستقلة لتوصيف وظيفة الحمض النووي التنظيمي 15. هذه التحليلات تتطلب إدخال الكواشف اضطراب و / أو مراسل الحمض النووي يبني في الأجنة. وعلاوة على ذلك، لوصف آثار المصب من هذه الاضطرابات، لا بد من مقايسة العديد من الأجنة لإجراء تغييرات في التعبير الجيني من الأهداف المحتملة. تقنيات Microinjection من عدة مئات من بيضات ملقحة هي المركزية لهذا العمل.
شوكيات الجلد، بما في ذلك P. miniata من جديد من خلال حقن مكروي. يقدم حقن مكروي فرصة لتعديل الأجنة مع الكواشف التي ليست خلية منفذة. يصف بروتوكول التالية طريقة لإدخال DNA، مرنا، استشفاف خلية، وأليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير إلى مئات من البويضات المخصبة في واحدة 2-3 ساعة يجلس من خلال حقن مكروي. هذا وتنتج مادة كافية لمجموعة متنوعة من التجارب المصب بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، QPCR، الموقع التهجين، RNA تسلسل، والنشاف الغربي في.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إبقاء كل مياه البحر أو مياه البحر الاصطناعي (SW)، والحيوانات الكبار، والثقافات في 15 ° C بقدر ما هو عملي. يتم الاحتفاظ ضمان البيض وبيضات ملقحة مغمورة في SW.
أملاح البحر مستعدة تجاريا تشكيلها مع المقطر أو المياه بالتناضح العكسي يخدم كذلك مصدرا للSW. تحقق الملوحة باستخدام مقياس ثقل السائل النوعي وضبط الأملاح أو المياه لتحقيق المستوى الأمثل. الحفاظ على مستويات الثقل النوعي بين 1،020-1،025. إبقاء جميع الأواني الزجاجية وبلستيكور منفصلة عن كل المختبرات الأخرى لتجنب أي تلوث بالمواد الكيميائية. نظيف الجنين الصف المختبرات من قبل الشطف بالماء منزوع الأيونات أو نقع أحيانا في هيبوكلوريت الصوديوم المخفف تليها الشطف عدة مرات في الماء.
1. الحصول على النضوج والأمشاج من Patiria miniata الكبار
- اختيار حيوان لاستئصال الغدد التناسلية. تحديد الجنس بعد الختان من خلال البحث عن وجود المبايض أو الخصيتين بسبب P. miniata ليست SEثنائي الشكل xually.
- قطع فتحة صغيرة، لا أكبر من 1 سم، على طول الجانب من ذراع نجم البحر مع شفرة مشرط (الشكل 1A). باستخدام ملقط حادة صغيرة انتهت بسحب حواف شق للوصول إلى أنسجة الغدد التناسلية وسحب أنسجة الغدد التناسلية من خلال شق.
ملاحظة: تجنب سحب أنسجة القناة الهضمية، وهو نسيج رمادية أو بنية اللون فضفاضة (الشكل 1B). المبايض هي برتقالية اللون عادة والأصفر، أو البني الفاتح (الشكل 1C)، في حين الخصيتين هي بيضاء أو البيج، وعندما عطلت سيتسبب مياه البحر ليصبح حليبي أو غائما في المظهر (الشكل 1D). - العودة الإناث إلى أحواض. عزل الذكور لمدة ساعة أو اثنين في وعاء من SW منذ الإجهاد من التعامل قد حث التبويض. الحيوانات تلتئم على موقع شق وتواصل تقديم الأمشاج لعدة أشهر.
- جمع الخصيتين إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب SW مع أقل قدر ممكن وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. تخزين أي الخصيتين ليس لناإد يوم جمع في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
- جمع المبايض في صحن الثقافة زجاجية صغيرة في عدة ملليلتر من SW. الإفراج عن البويضات من أنسجة المبيض، ندف بصرف النظر النسيج مع اثنين من أزواج من الملقط حتى لا تظل القطع الكبيرة.
ملاحظة: على النحو الأمثل، والغالبية العظمى من البويضات يتم تطويرها بشكل كامل. هذه البويضات كبيرة ومستديرة، واضحة الأصفر أو البني الفاتح مع حويصلة جرثومي متميزة في البويضة (الشكل 2A)، مقارنة فرعية من البويضات غير المطورة التي هي أصغر والبني ومحبب، ومبهمة (الشكل 2B). إذا أكثر من حوالي 25٪ من البويضات هي من متنوعة غير المطورة، حدد أنثى مختلفة للحصول على البويضات. - صب البويضات والأنسجة المتبقية من خلال كأس فلتر شبكة مع حجم المسام 200 ميكرون وجمع من خلال تدفق. هذا وسوف تحتوي على جميع أصناف من البويضات ولكن إزالة أنسجة المبيض. طرد البويضات المتبقية من الأنسجة القبض عليهم من قبل مرشح عن طريق الرش ثإيث SW من زجاجة بخ. تتم تصفية أكواب باستخدام 50 مل أنبوب مخروطي الشكل (3A-A ').
- صب تدفق من خلال من الخطوة 1.6 خلال 100 ميكرون فلتر شبكة الكأس. تجاهل البويضات صغيرة في التدفق من خلال. كبيرة البويضات كاملة النمو التي هي على استعداد لنضج سيبقى على التصفية. شطف البويضات في نظيفة 200 مل دورق.
- إضافة 95 مل من SW على الزجاج 200 مل كوب من البويضات. إضافة 5 مل من 200 ميكرومتر 1-methyladenine لتركيز النهائي من 10 ميكرومتر.
- نقل البويضات في طبق كبير والثقافة الضحلة مكان في 15 درجة مئوية. مساحة عالية لحجم الطبق الثقافة تسمح لتبادل الأوكسجين. البويضات لا تنضج أو لا تتطور بشكل جيد إذا كانت مكتظة خلال هذه المرحلة النضج. انقسم الى عدة أطباق من SW بالإضافة إلى 10 ميكرومتر 1-methlyadenine حتى الثقافة هي أقل من 200 البويضات / مل.
- تسمح البويضات إلى أن تنضج ل45-90 دقيقة، ولكن لم يعد حيث سيؤدي ذلك إلى جعل البويضات غير قادرة على أن تكون وertilized. لتحديد ما إذا اكتمال النضج، والنظر في البويضات تحت نطاق تشريح. التحركات جرثومي الحويصلة نحو والصمامات مع غشاء الخلية أثناء النضج. ثم ينهار وبالتالي لم يعد مرئيا في البويضات الناضجة (الشكل 2C).
2. تسميد البويضات الناضجة
- اختارت مجموعة صغيرة من أنسجة الخصية، تقريبا بحجم حبة البازلاء، واللحم المفروم في طبق ثقافة كوب صغير مع ما يقرب من 1 مل من SW.
- استخدام ماصة باستور لنقل 2-3 قطرات من مياه البحر الناتجة حليبي إلى حوالي 100 مل من البويضات الناضجة ودوامة الطبق الثقافة إلى المزيج. تجنب نقل قطعة من نسيج الخصية. تجنب إضافة كميات أكبر من الحيوانات المنوية لأن هذا قد يؤدي إلى تعدد الإمناء والتنمية الفقيرة اللاحقة.
- بعد عدة دقائق مراقبة البويضات تحت نطاق تشريح. البيض المخصب، أو بيضات ملقحة، لديها المغلف الإخصاب، وهي فقاعة واضحة التي ترتفع قبالة سلل غشاء (الشكل 2D).
ملاحظة: عدم المضي قدما في الثقافة إذا كانت أقل من حوالي 90٪ من البيض تسميد منذ معدلات التسميد الفقيرة هي مؤشر على ثقافة غير الصحية التي قد أيضا لا تضع أيضا. - بعد الإخصاب كاملة، تغيير SW على بيضات ملقحة عن طريق سكب من خلال مرشح شبكة 100 ميكرون والشطف في صحن الثقافة مع SW الطازجة. من المهم لإزالة الحيوانات المنوية الزائد لمنع المجاعة الأكسجين. وضع الطبق الثقافة عند 15 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.
3. دي jellying والتجديف أسمدة البيض
- إعداد أطباق الحقن عن طريق أخذ غطاء من طبق بتري 60 × 15 مم البوليسترين.
- رسم خط قلم دائم على الجزء الخلفي من الطبق، في جميع أنحاء المنطقة التي تتوافق مع مجال الرؤية على المجهر حقن مكروي. وهذا يضمن أن جميع الأجنة التجديف ضمن مجال المجهر نظر.
- استخدام الزجاج ماصة باستور ليسجل الخط من خلال الدائرة، صreferably من جانب واحد للدائرة (الشكل 3B). استخدام هذا الخط لاحقا لكسر إبر الحقن (الخطوة 4.5).
ملاحظة: الكواشف تستخدم عادة التمسك الأجنة قنفذ البحر، على سبيل المثال، سلفات بروتامين أو بولي-L يسين، ليست ضرورية. دي هلامي P. بيضات ملقحة miniata عصا جيدا إلى البلاستيكية غير المصقول. نلاحظ أنها لا تلتصق بشكل جيد لأطباق الزجاج.
- إضافة حوالي 10 مل SW إلى كل طبق بحيث يتم تغطية السطح، ولكن المياه لا دفقة مفرط في الطبق لأن هذا قد التشويش على الأجنة التجديف.
- إزالة P. miniata معطف هلام البيضة الملقحة مع SW الحمضية قبل التجديف. هذا معطف هلام هو أكثر شمولا من تلك التي لوحظت بالنسبة للأنواع قنفذ البحر النموذج.
- إعداد SW حامض في نطاق درجة الحموضة 4،0-4،2. الرقم الهيدروجيني أمر بالغ الأهمية للسماح إزالة فعالة من معطف هلام مع السماح التطور الطبيعي.
- إضافة قطرات واحدة من 1 N (1 M) حمض الهيدروكلوريك في SW للسهم 1 لتر من SW. تسمح كل قطرة لخلط تماماورصد درجة الحموضة قبل أن يضيف المزيد من حمض الهيدروكلوريك.
ملاحظة: واحد إلى عدة مل من حمض الهيدروكلوريك النتائج في درجة الحموضة المناسبة، ولكن لا تضيف وحدة التخزين بالكامل دفعة واحدة.
ملاحظة: إعداد 1 N حمض الهيدروكلوريك في غطاء الدخان مع SW و 12 N (12 M) حمض الهيدروكلوريك. - إزالة SW على بيضات ملقحة عن طريق سكب لهم على مرشح شبكة 100 ميكرون. شطف في 200 مل دورق في أقل قدر ممكن من SW (حوالي 10 مل). ملء كوب تصل إلى 150 مل مع SW الحمضية (الرقم الهيدروجيني 4.0) والسماح للبيضات ملقحة للجلوس في SW الحمضية لمدة 3 دقائق.
- تجريد معطف هلام من بيضات ملقحة عن طريق سكب عليها ذهابا وإيابا بين اثنين 200 مل الأكواب، في كل مرة تمرير بيضات ملقحة من خلال مرشح شبكة 200 ميكرون. صب بيضات ملقحة من خلال تصفية جميع أنحاء 5-10x على نحو نافذة الوقت 2 دقيقة.
- إزالة حمض SW بواسطة صب بيضات ملقحة على مرشح شبكة 100 ميكرون. شطف بيضات ملقحة في طبق زجاجي صغير مع ثقافة SW. بيضات ملقحة دي هلامي قد التمسك أطباق بلاستيكية. الأجنة التوالي فورا؛ أنها بداية لانتاج المزيد من يمعطف اللي مما يؤدي إلى التصاق الفقراء إلى الأطباق البلاستيكية مع مرور الوقت.
- استخدام ماصة الفم (الشكل 3C-C ') لالتقاط بيضات ملقحة من الطبق الثقافة الزجاج ووضعها في خطوط مستقيمة على أطباق الحقن. تذوب وسط الجانب رقيقة من ماصة باستور فوق لهب حتى الزجاج لينة. سحب بسرعة ينتهي من الزجاج بعيدا لإنتاج تمتد رقيقة جدا من الزجاج. بمجرد أن الزجاج هو بارد، وقطع صغيرة من نهاية ماصة باستير (للحصول على معلومات إضافية حول إعداد ماصة الفم ترى السفن وآخرون 2004 17 أو الحلو وآخرون 2004 18).
- جعل ماصة مثل التجديف أن القطر هو مجرد أكبر من قطر الأجنة ذلك أنه ليس هناك سوى واحد البيضة الملقحة سوف دخول والخروج من ماصة في كل مرة. هذا سيسمح صف واحد لتشكيل. ماصات قطرها أصغر قد تجرد المغلف الإخصاب وتعطيل بيضات ملقحة كما P. بيضات ملقحة miniata ليس لديها غشاء زجاجي لالثانية هي لينة جدا.
- إذا كان بيضات ملقحة لا التمسك طبق من البلاستيك، والاحتفاظ بها لوقت إضافي في SW الحمضية (تصل إلى عدة دقائق إضافية). بدلا من ذلك قطرها أصغر ماصة قد تساعد في إزالة هلام معطف للسماح للبيضات ملقحة التمسك أكثر فعالية.
- وبيضات ملقحة هي طافيا قليلا وتميل إلى تعويم أو تحوم فوق قاع الطبق. في هذه الحالة، ضع ماصة التجديف بحيث يتم الضغط على بيضات ملقحة بلطف على سطح الطبق لأنها خروج من ماصة (الشكل 3D).
ملاحظة: يجوز لتناسب العديد من الصفوف على هذه الأطباق P. الأغشية الجنينية miniata لا تصبح أكثر صعوبة في اختراق مع مرور الوقت، وبالتالي يمكن للمرء أن حقن مئات بيضات ملقحة على طبق واحد.
4. حقن بيضات ملقحة
- تحضير محاليل الحقن بتركيزات مناسبة من أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير (MASO)، مرنا، أو السلطات الوطنية المعينة في اضرب النهائيentration من 200 ملي بوكل. 400-800 ميكرومتر MASO و 2.5 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي تميل إلى إنتاج الظواهر morphant مع تقليل سمية. فإن التركيز النهائي في البيضة يكون 1/125 عشر تركيز انطلاق 14. عن حلول حقن تحتوي على MASOs والحرارة إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام وعلى الفور ثم تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- لسهولة فرز الأجنة حقن، إضافة رودامين ديكستران التتبع في حل حقن للحصول على تركيز 0.1٪.
- إعداد إبر الحقن عن طريق سحب أنابيب زجاجية الشعرية (1.0 ملم × 0.75 ملم OD ID، 100 مم طول) في إبرة سحب أداة التالية تعليمات الشركة الصانعة. الإبر المناسبة للحقن في قنافذ البحر أيضا تعمل بشكل جيد لنجوم البحر، وذلك باستخدام معايير مماثلة 19.
- تحميل ما يقرب من 2 ميكرولتر من محلول الحقن في إبرة الحقن باستخدام طرف microloader ماصة.
- إدراج نهاية حادة من الإبرة في مanipulator. تعيين picospritzer إلى 100 ميللي ثانية النبض وضغط الهواء من 40 PSI.
- وضع طبق من الأجنة التجديف على خشبة المسرح المجهر، وجميع الأجنة في مجال الرؤية. توجيه الطبق بحيث خط وسجل على الجانب الأقرب إلى إبرة. ضع الإبرة في وحوالي 60 درجة زاوية بحيث غيض بالقرب من منتصف خط وفقط فوق سطح الماء.
- التركيز على خط وسجل وخفض الإبرة حتى يأتي طرف إلى التركيز. خفض الحافة أكثر من ذلك بقليل وكسر مفتوحا عن طريق تشغيل برفق في التلال من خط وسجل. رفع رأس قبالة سطح الطبق ووضعه على رأس الصف الأول من بيضات ملقحة والتركيز على بيضات ملقحة.
- خفض الحافة بحيث سيكون أسعد مركز البيضة الملقحة القادمة من جميع أنحاء زاوية 60 درجة. الإبرة تخترق بسهولة P. بيضات ملقحة miniata. خطوة على دواسة القدم (أو وسائل أخرى لإجبار المواد من إبرة الحقن) لإدخال البلعة من inje حل ction إلى الجنين.
- تهدف لالبلعة التي هي 20-30٪ قطر للجنين، أو ما بين 25 و 80 رر. إذا كان البلعة هي أكبر أو أصغر من هذا، وضبط مدة الحقن على picospritzer وحقن الجنين القادم. مواصلة لضبط مدة للحصول على حجم بلعة المطلوب. تبدأ في مدة 100 ميللي ثانية. إعادة كسر الإبرة إذا أكبر من حوالي 200 ميللي ثانية هناك حاجة لإدخال البلعة المناسبة. تجاهل الإبرة وإعداد واحدة جديدة إذا كانت هناك حاجة أقل من 15-20 ميللي ثانية للحصول على هذا الحجم البلعة حيث حجم الإبرة كبير جدا ويمكن أن يعطل التطور الطبيعي.
- المضي قدما لحقن بيضات ملقحة المتبقية على طبق الحقن. يمكن بسهولة حقن الأجنة حتى يبدأ في الانقسام وعن Blastomeres واحدة بعد الانقسام الأول. رفع دوري إبرة فوق سطح الماء لإزالة بيضات ملقحة التي تلتصق على الإبرة. إذا لزم الأمر إعادة كسر غيض من الإبرة أو تحميل إبرة جديدة في حالة حدوث انسداد.
ق ق = "jove_title"> 5. جمع حقن الأجنة لتحليل المصب
- السماح للأجنة لتطوير عند 15 درجة مئوية في SW. الحفاظ على مساحة عالية لحجم في الثقافات للسماح لتبادل الأوكسجين. ضمان الأجنة ليست مزدحمة. الحفاظ على الثقافات أو أقل من 200 الأجنة / مل. وهذا يتوقف على المرحلة المطلوبة من الجنين، تخطط لجمع الأجنة المحقونة في حوالي 20-24 ساعة بعد الإخصاب.
ملاحظة: هذا هو غالبا ما يكون الوقت المثالي لفرز وجمع ولأن الأجنة النامية عادة وتتميز بسهولة شكليا، ولكن لم يتم بعد السباحة. - إذا فقس الأجنة والملح بلطف صدمة لمنع السباحة. إضافة 200 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 إلى 10 مل من SW في طبق حقن حين يحوم بلطف SW. بعد بضع دقائق، وسوف الأجنة تسقط إلى قاع الطبق. جمع هذه ونقلها إلى وضعها الطبيعي SW الملوحة.
- جمع الأجنة المحقونة تحت مصدر ضوء الفلورسنت المناسب متوافق مع التتبع المستخدمة في injectiعلى الحل. إذا تم استخدام أي التتبع، نوع الأجنة لاختيار لمورفولوجيا العادي.
- باستخدام ماصة الفم، رسم الاستشعاع الأجنة حتى مع الحد الأدنى من SW وضربة بها في صحن الثقافة صغيرة مليئة SW. ماصات الفم مثالية لها فتحة كبيرة بما فيه الكفاية للأجنة ليتم سحبها داخل وخارج دون تعرضها للتلف، ولكن ليس كبيرا بحيث الأجنة غير المرغوب فيها وSW دخيلة يتم سحبها أيضا.
- مرة واحدة تم جمعها من جميع الأجنة المرغوب في طبق جديد، ومراقبة الأجنة تحت ضوء الفلورسنت، وإزالة أي أجنة من الامم المتحدة وحقن أو الأجنة غير متطورة.
- ثقافة فرز الأجنة إلى المراحل المطلوبة في حاضنة والمضي قدما مع التصوير أو بروتوكولات أخرى مرغوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم الكواشف إلى الأجنة. نحن إثبات فعالية البروتوكول عن طريق حقن مراسل بناء الحمض النووي الذي يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). حقن الأجنة تعبر عن GFP في بقع نسيلي (الشكل 4A-B) والحمض النووي خلال الانقسام يتضمن المبكر. العديد من الكواشف أن تكون مرغوبة لإدخال الأجنة في سامة بكميات عالية وعلى دفعات دون المستوى الأمثل من الأجنة. كشوف سمية عن طريق تأخير التنمية، اعتقال التنمية في الانقسام المبكر أو في مرحلة البويضة الملقحة، أو من خلال فرض تنمية الشاذة (الشكل 5A-C).
الرقم 1. الحصول على الأمشاج من P. miniata البالغين. أ) إلى استئصال الغدد التناسلية إجراء شق على الجانب الأقرب من الذراعإلى منتصف الحيوان. B) والمواد البني الداكن سحبها من هذا الشق هو نسيج القناة الهضمية. تجنب سحب أنسجة الأمعاء لأنها سوف تصيب الحيوان. C) أنسجة المبيض هي البرتقالي عادة في اللون كما هو موضح هنا، ولكن قد يكون أيضا الأصفر أو البني الفاتح. D) الخصية هي أبيض أو بيج اللون، كما هو مبين. جميع الحانات نطاق دلالة 1 سم.
الشكل 2. نضوج البويضات والإخصاب. A) البويضات السليمة التي هي على استعداد لنضج كبيرة وواضحة مع حويصلة جرثومي مرئية. B) البويضات التي ليست جاهزة للنضوج هي أصغر، والبني، ومحبب في المظهر. C) بويضة التي تم نضجت مع 1-methyladenine . قد كسر الحويصلة الجرثومية أسفل. D) واقحة محاطة FERTilization المغلف. E) تجنب الثقافات مع البويضات الكبيرة التي لا يمكن نضجت لأنه لن يتم إزالة هذه البويضات عن طريق الترشيح. هذه البويضات هي أصغر قليلا من واحد في A. وهي قتامة البني ومحكم محبب. شريط النطاق في ويدل 50 ميكرون، ويمثل مقياس للصور AE.
الرقم 3. جهاز لتجميع. AA ') مرشح شبكة مثبتة على أنبوب مخروطي 50 مل. يتم قطع نهاية مدبب من الأنبوب ووسط غطاء من السماح الثقافات أن تدفقت من خلال أنبوب والتصفية. B) طبق حقن شيدت من غطاء 60 × 15 مم طبق الثقافة البوليسترين. دائرة مرسومة حول مركز وتحدد مجال الرؤية من المجهر الحقن وبمثابة دليل للأجنة التجديف. وسجل خط كثافة العملياتس الطبق مفيد لكسر إبر الحقن. ماصة CC ') الفم انشاء. تناسب لسان حال في واحدة من نهاية عدة القدم أنبوب المطاط طويلة. تناسب الطرف الآخر إلى ماصة باستور، الذي تم تشكيله من قبل لفترة وجيزة ذوبان وسحب نهاية ضيقة من الزجاج. D) تخطيطي مما يدل على التجديف المثالي باستور ماصة الشكل والعرض لتعزيز التصاق دون الإضرار الأجنة. عندما كسر نهاية الخروج من ماصة سحبت، فإنه من المفيد إذا مدبب نهاية بيضات ملقحة لمنع الناشئة من العائمة بعيدا عن الطبق. جميع الحانات على نطاق وتدل 3 سم.
الرقم 4. الكواشف أدخلت بنجاح بواسطة حقن مكروي. A) DIC من مرحلة الجنين الأريمة حقن البلازميد مراسل GFP. الجنين لديه التشكل الطبيعي. B) GFP expression في الجنين هو مبين في A. C) DIC صورة اثنين طبيعية شكليا الأجنة مرحلة الأريمة. D) واحدة من الجنين C تنبعث مضان أحمر من إدخال تكساس الأحمر ديكستران. الجنين الآخر هو برنامج الأمم المتحدة للحقن ويسلك أي مضان. أشرطة النطاق دلالة 50 ميكرون. شريط النطاق في ويمثل مقياس لألف وباء في شريط مقياس C يمثل مقياس C و D.
الشكل 5. Overinjection وكاشف نتيجة سمية في القبض أو تطوير الشاذة. جميع الصور هي من الأجنة 24 ساعة بعد الحقن من نفس حقن دفعة واحدة. AA ') إن اقحة overinjected اعتقل في مرحلة خلية واحدة. BB') جنين اعتقلت في انشقاق مبكر. وهناك تقسيم الجنين صحي بشكل متناظر، في حين أن هذا الجنين اعتقالبسبب انقسامات الخلية غير طبيعية. CC ') الجنين مع التنمية الشاذة بعنف بسبب سمية. بينما يتشكل هذا الجنين تقريبا مثل الجنين الأريمة (D)، فمن غير متناظرة وغير طبيعي سميكة. DD ') وصحيح النامية حقن الأريمة الجنين المرحلة. شريط النطاق في ويدل 50 ميكرون، ويمثل المقياس لجميع لوحات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة التي من الصعب بالنسبة للمستخدمين المبتدئين لهذه التقنية ولكن لا غنى عنها لخلق أجنة morphant بنجاح. الأول هو اختيار البويضات السليمة التي من شأنها أن تنضج وتسميد بشكل صحيح. نسبة التطور الطبيعي في ثقافة تعتمد على الموسم، وصحة الحيوان، وعدد المرات التي تم حصادها البويضات من فرد واحد. البويضات تميل إلى أن تكون ذات نوعية أفضل من أبريل حتى أكتوبر تشرين الاول. من المهم أن ننظر بعناية في البويضات قبل الشروع في ضمان أن الغالبية تبدو وكأنها الشكل 2A بدلا من الشكل 2B. فإنه يجوز أن يكون عدد قليل من البويضات التي لن تنضج، خاصة إذا كانت صغيرة بما يكفي لتصفية ما تتم معالجة البويضات. في بعض الأحيان، البويضات التي هي متخلفة تكاد تكون كبيرة مثل البويضات كاملة النمو التي هي على استعداد للنضوج. هم تمييزها بواسطة محبب، colorin من البنيز (الشكل 2E). لا تستخدم دفعات من البويضات من هذا النوع لأن الترشيح لا عزل البويضات كاملة النمو من البويضات غير المطورة والتي غالبا ما تؤدي إلى ثقافات الجنين غير الطبيعية التي يرجح أن تظهر العيوب رأينا في الشكل 5.
في خطوة حاسمة أخرى هي حجم حقن البلعة. إدخال مبلغ كاشف إقلاق كبير بشكل كاف لممارسة تأثير، ولكن ليست كبيرة بحيث تتسبب في آثار غير محددة. أول مرة يتم استخدام كاشف إقلاق، فمن المفيد إجراء المعايرة التي يتم حاول عدة تركيزات كاشف. أداء microinjections اللاحقة مع أعلى تركيز أن لا يسبب تشوهات النمو التي لا علاقة لها النمط الظاهري المتوقع، أو تطوير تأخير (الشكل 5A). تجنب حقن البلعة أكبر من 30٪ من قطر الجنين لأن هذا قد يعطل التطور الطبيعي. البلعة أحجام صغيرة بشكل مفرط، من خلال التعاونntrast، يصعب تفقد البصر لتحديد حجم ثابت والذي يمكن أن يؤدي إلى مجموعة من الظواهر الاضطراب المفرط عبر مكررات.
قد يسبب الكواشف مشوشة تأخر النمو أو الظواهر غير محددة في نطاقات تركيز فعالة. من المهم جدا، لذلك، لحقن ضوابط الأخوة مع كاشف حميدة مثل التحكم القياسية MASO، يبني DNA القياسية، أو رودامين التتبع. الأجنة morphant الفحص فقط إذا أظهرت هذه الضوابط التطور الطبيعي. حقن الأجنة، بما في ذلك الضوابط، تظهر أحيانا النمط الظاهري الأريمة التجاعيد لكنها لن تكون في كثير من الأحيان من خلال المضي قدما بقية تنمية عادة. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان كاشف معين يسبب تأخر النمو باستمرار في الأجنة الناتجة morphant، مقارنة هذه الأجنة لمراقبة الأجنة لتحديد عدد ساعات التأخير التي يمرون بها.
هناك عدد قليل من سمات هذه الطريقة التي قد تحد من فائدته في قسيناريوهات تجريبية pecific. واحدة من هذه القضية هو حقيقة أن واحدا يمكن أن يعرض الكواشف في البويضة المخصبة أو المراحل المبكرة الانقسام فقط. وهذه مشكلة خاصة إذا كان الجين أو مسار المصالح أمر بالغ الأهمية خاصة في التنمية في وقت مبكر والأجنة الناتجة morphant وinviable جدا أو غير طبيعي تنمويا للدراسة ذات مغزى. أحيانا يتم حل هذه المشكلة عن طريق حقن نسخ أقل من إقلاق كاشف، مما أدى إلى ألطف، ضربة قاضية ناقصة. في حالة وجود دواء خلايا قابلة للاختراق المناسبة لهذا الجين المستهدف أو مسار، فإنه من المفيد أن نقارن النمط الظاهري للأجنة حقن الكواشف في مرحلة البويضة المخصبة مع الأجنة تعامل مع المخدرات في مرحلة لاحقة، أكثر ملاءمة. لأن حقن MASOs أو من mRNAs يوفر قدر أكبر من الدقة، هو أكثر قوية لاستخدام هذا الأسلوب بالتزامن مع دراسة العلاج من تعاطي المخدرات في مقابل التخلي عن حقن مكروي لصالح العلاج من تعاطي المخدرات.
وأخيرا، على الرغم من أن هذا الصغيرطريقة الحقن سوف تنتج كمية كافية من الأجنة لمجموعة واسعة من التطبيقات المصب، سيكون في أفضل إنتاج العديد 100-1000 صحية، حقن الأجنة بنجاح. قد تتطلب بعض التجارب المطلوب أكبر بكثير من هذه المادة. يجوز تعديل الأساليب الأخرى المستخدمة بنجاح في نظام قنفذ البحر إلى خلق عدد أكبر من الأجنة نجمة البحر morphant، مثل الفيروسات القهقرية شمولي التوجه 20، على الرغم من أن هذا الأسلوب هو رواية ولم تكتسب بعد الاستخدام واسع النطاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أي تضارب في المصالح أعلنت من قبل المؤلفين.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية وIOS IOS 0844948 1024811
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , UBC Press. (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
