Summary
Morphant भ्रूण उत्पादन विधियों कि विकास तंत्र और जीन विनियामक नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं. समुद्र सितारा Patiria miniata इन अध्ययनों के लिए एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है. यहाँ हम एक भ्रूण की संस्कृतियों, युग्मक प्राप्त करने के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल, और इस प्रजाति से युग्मनज का तेजी microinjection प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
एकीनोडर्म्स लंबे जीन विनियमन और विकास की प्रक्रिया के विकास के अध्ययन के लिए अभी हाल ही में प्रजनन और विकास के अध्ययन के लिए एक पसंदीदा मॉडल प्रणाली है, और है. समुद्र सितारा, Patiria miniata, पहले समुद्री अर्चिन, Strongylocentrotus purpuratus और Lytechinus variegatus में लगभग विशेष रूप से प्रदर्शन किया गया जो पढ़ाई के इन प्रकार के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में प्रसार हो रहा है. इन मॉडल प्रणाली का एक लाभ यह है जिसमें एक विशेष जीन, या downregulated निर्भर है कोशिकाओं का एक समूह लेबलिंग, या एक पत्रकार जीन शुरू संशोधित भ्रूण उत्पादन के कम है. एक एकल microinjection विधि इस तरह संशोधित भ्रूण की एक विस्तृत विविधता बनाने में सक्षम है. यहाँ, हम पी से युग्मक प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत miniata, युग्मनज का निर्माण, और microinjection के माध्यम से perturbing अभिकर्मकों शुरू. स्वस्थ morphant भ्रूण बाद में जीई की मात्रात्मक और गुणात्मक अध्ययन के लिए अलग कर रहे हैंपूर्वोत्तर समारोह. इस जीव के लिए जीनोम और transcriptome डेटा की उपलब्धता प्रदर्शन किया और उन्हें क्रियान्वित करने में आसानी रहे हैं कि पढ़ाई के प्रकार बढ़ गया है.
Introduction
(आमतौर पर बल्लेबाजी स्टार के रूप में जाना जाता है) समुद्र सितारा, Patiria miniata, एक 6 से 8 विकासवादी 4,5 विकास सेलुलर 1 3 की विविधता,,, और पारिस्थितिकी के अध्ययन 9 से 11 के लिए एक दिलचस्प और बहुमुखी मॉडल प्रणाली के रूप में उभर रहा है. वयस्क पी miniata बाजा, कैलिफोर्निया से 12 Sitka, अलास्का से प्रशांत तट के साथ वितरित कर रहे हैं और आसानी से समुद्री aquaria में रखा जाता है. Oocytes प्राप्य वर्ष दौर है और प्रत्येक महिला दसियों अंडे के हजारों के बहाने कर सकते हैं. Oocytes आसानी से परिपक्व और बाह्य 13 निषेचित कर रहे हैं. जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण आसान अवलोकन के लिए अनुमति पारदर्शी हैं; वे synchronously का विकास, और विकास के लिए केवल समुद्र के पानी की आवश्यकता होती है. पूरे जीनोम विधानसभा और कई transcriptomes भी पी के लिए उपलब्ध हैं miniata ( Echinobase.org ). इस तरह के फायदे अनुसंधान की एक श्रृंखला के लिए उन्हें आदर्श बनानेऔर शिक्षण उद्देश्यों.
हाल के वर्षों में, पी miniata विकासात्मक जीन विनियामक नेटवर्क के लिए एक मॉडल प्रणाली 14 16 का विश्लेषण करती है बन गया है. इस तरह के अध्ययन का उद्देश्य नियामक जीन की पूरी तारीफ की पहचान और उनकी बातचीत के नेटवर्क को निर्धारित है. इस काम के बहुत antisense oligonucleotides की या इन विट्रो संश्लेषित mRNAs में परिचय के माध्यम से perturbing जीन अभिव्यक्ति जरूरत पर जोर देता. साथ ही, सीआईएस नियामक विश्लेषण विनियामक डीएनए 15 के समारोह में चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है. ये विश्लेषण गड़बड़ी अभिकर्मकों और / या डीएनए संवाददाता भ्रूण में निर्माणों का परिचय की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, इन perturbations के बहाव के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए, एक संभावित ठिकानों की जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए कई भ्रूण परख चाहिए. युग्मनज के कई सैकड़ों की microinjection के लिए तकनीक इस काम के लिए केंद्रीय हैं.
पी सहित एकीनोडर्म्स, miniata नए सिरे से होने चाहिए. Microinjection सेल पारगम्य नहीं हैं कि अभिकर्मकों के साथ भ्रूण को संशोधित करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक 2-3 घंटा microinjection के माध्यम से बैठे में निषेचित अंडे के सैकड़ों में डीएनए, mRNA, सेल ट्रेसर, और morpholino antisense oligonucleotides शुरू करने की एक विधि का वर्णन है. यह सहित बहाव के प्रयोगों की एक किस्म के लिए पर्याप्त सामग्री का उत्पादन, लेकिन सीटू संकरण, आरएनए Seq, और पश्चिमी सोख्ता में, qPCR तक ही सीमित नहीं.
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Protocol
व्यावहारिक है जितना 15 डिग्री सेल्सियस पर सभी समुद्र के पानी या कृत्रिम समुद्री जल (दप), वयस्क जानवरों, और संस्कृतियों रखें. सुनिश्चित अंडे और युग्मनजों दप में डूबे रखा जाता है.
आसुत या रिवर्स ऑस्मोसिस पानी के साथ पुनर्गठन व्यावसायिक तौर पर तैयार समुद्र लवण दप के एक स्रोत के रूप में अच्छी तरह से कार्य करता है. एक हाइड्रोमीटर का उपयोग लवणता की जाँच करें और इष्टतम स्तर को प्राप्त करने के लिए नमक या पानी को समायोजित. 1.020-1.025 के बीच विशिष्ट गुरुत्व का स्तर रखें. सभी कांच के बने पदार्थ रखें और plasticware रसायनों के साथ किसी भी संक्रमण से बचने के लिए अन्य सभी Labware से अलग. विआयनीकृत पानी या पानी में कई बार rinsing द्वारा पीछा पतला सोडियम हाइपोक्लोराइट में सामयिक भिगोने के साथ rinsing द्वारा स्वच्छ भ्रूण ग्रेड Labware.
Patiria miniata वयस्कों से 1 प्राप्त करने और परिपक्व युग्मकों
- Gonads आबकारी करने के लिए एक जानवर का चयन करें. अंडाशय या वृषण की उपस्थिति के लिए देख द्वारा छांटना के बाद लिंग का निर्धारण पी क्योंकि miniata एसई नहीं हैंxually द्विरूपी.
- एक स्केलपेल ब्लेड (चित्रा 1 ए) के साथ एक समुद्र सितारा हाथ की ओर के साथ 1 सेमी से भी बड़ा एक छोटे से खोलने, काटें. छोटे कुंद समाप्त संदंश वापस चीरा के किनारों खींच का प्रयोग जननपिंड ऊतक का उपयोग और चीरा के माध्यम से बाहर जननपिंड ऊतक खींच लिए.
नोट: एक ढीला ग्रे या ब्राउन ऊतक (चित्रा 1 बी) है, जो पेट ऊतक, बाहर खींच से बचें. वृषण सफेद या बेज हैं जबकि और उपस्थिति (चित्रा -1) में दूधिया या बादल बनने के लिए समुद्र के पानी के कारण होगा बाधित जब अंडाशय, आम तौर पर, नारंगी, पीला, या हल्के भूरे (चित्रा 1C) कर रहे हैं. - Aquaria के लिए महिलाओं लौटें. Spawning के लिए प्रेरित कर सकते हैं निपटने से तनाव के बाद से दप के एक कंटेनर में एक या दो घंटे के लिए पुरुषों को अलग. पशु चीरा साइट के साथ ठीक है और कई महीनों के लिए युग्मक प्रदान करने के लिए जारी है.
- जितना संभव हो कम दप के साथ एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में वृषण लीजिए और उपयोग करें जब तक बर्फ पर दुकान. हमें किसी भी वृषण संग्रह नहींएक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह के दिन पर एड.
- दप के कई मिलीलीटर में एक छोटा गिलास संस्कृति डिश में अंडाशय लीजिए. कोई बड़े टुकड़े रहना जब तक संदंश के दो जोड़े के साथ ऊतक के अलावा तंग, अंडाशय के ऊतकों से oocytes जारी है.
नोट: बेहतर, oocytes की बहुमत पूरी तरह से विकसित कर रहे हैं. इस तरह oocytes (चित्रा 2B), भूरा, छोटे दानेदार, और अपारदर्शी हैं कि अविकसित oocytes के सबसेट की तुलना में, बड़े दौर, और oocyte (2A चित्रा) में एक अलग कीटाणु पुटिका के साथ पीले या हल्के भूरे रंग स्पष्ट कर रहे हैं. Oocytes की अधिक से अधिक 25 के आसपास से% अविकसित किस्म के होते हैं, oocytes प्राप्त करने के लिए एक अलग महिला का चयन करें. - एक 200 माइक्रोन छेद के आकार के साथ एक जाल फिल्टर कप के माध्यम से oocytes और शेष ऊतक डालो और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा. इस oocytes की सभी किस्मों के होते हैं लेकिन डिम्बग्रंथि ऊतक निकाल देंगे. डब्ल्यू छिड़काव द्वारा फिल्टर द्वारा पकड़ा ऊतक से शेष oocytes बेदखलएक धारा निकलना बोतल से ith दप. फ़िल्टर कप एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (चित्रा 3A-ए ') का उपयोग किया जाता है.
- एक 100 माइक्रोन जाल फिल्टर कप के माध्यम से कदम 1.6 से के माध्यम से प्रवाह डालो. के माध्यम से प्रवाह में छोटे oocytes त्यागें. फिल्टर पर रहेगी परिपक्वता के लिए तैयार कर रहे हैं कि बड़े पूरी तरह से विकसित oocytes. एक स्वच्छ 200 मिलीलीटर बीकर में oocytes कुल्ला.
- Oocytes की 200 मिलीलीटर कांच बीकर दप के 95 मिलीलीटर जोड़ें. 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए 200 माइक्रोन 1-methyladenine के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
- 15 डिग्री सेल्सियस पर एक बड़े उथले संस्कृति पकवान और जगह के लिए oocytes स्थानांतरण. मात्रा संस्कृति डिश के लिए एक उच्च सतह क्षेत्र ऑक्सीजन विनिमय के लिए अनुमति देता है. oocytes परिपक्व नहीं है या वे इस परिपक्वता के चरण के दौरान भीड़ हो तो विकास नहीं हो सकता. संस्कृति कम से कम 200 oocytes / मिलीलीटर है जब तक कई दप के व्यंजन प्लस 10 माइक्रोन 1-methlyadenine में विभाजित है.
- च oocytes इस होना करने में असमर्थ oocytes प्रस्तुत करना होगा के रूप में नहीं रह 45-90 मिनट के लिए परिपक्व है, लेकिन करने की अनुमति देंertilized. परिपक्वता पूरा हो गया है, तो यह निर्धारित करने के लिए, एक विदारक गुंजाइश के तहत oocytes पर दिखेगा. परिपक्वता के दौरान कोशिका झिल्ली के साथ कीटाणु पुटिका की ओर चलता रहता है और फ़्यूज़. यह तो टूट जाती है और इसलिए अब कोई परिपक्व oocytes (चित्रा -2) में दिख रही है.
परिपक्व oocytes की 2 निषेचन
- दप के लगभग 1 मिलीलीटर के साथ एक छोटे से गिलास संस्कृति डिश में वृषण ऊतक, मोटे तौर पर मटर के आकार, और कीमा के एक छोटे समूह को चुना.
- परिपक्व oocytes की करीब 100 मिलीलीटर के परिणामस्वरूप दूधिया समुद्र के पानी की 2-3 बूंदें हस्तांतरण और मिश्रण करने के लिए संस्कृति डिश चक्कर आने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. वृषण ऊतक के टुकड़े को स्थानांतरित करने से बचें. Polyspermy और बाद में गरीब विकास में हो सकता है इस रूप में शुक्राणु की अधिक से अधिक मात्रा जोड़ने से बचें.
- कई मिनट के बाद एक विदारक गुंजाइश के तहत oocytes निरीक्षण करते हैं. निषेचित अंडे, या युग्मनज, सीईएल बंद बढ़ जाता है कि एक स्पष्ट बुलबुला है जो एक निषेचन लिफाफा, हैएल झिल्ली (चित्रा 2 डी).
नोट: गरीब निषेचन दर भी अच्छी तरह से विकसित नहीं हो सकता है कि एक अस्वास्थ्यकर संस्कृति का एक संकेत कर रहे हैं, क्योंकि अंडे का कम 90 के आसपास से% खाद यदि संस्कृति के साथ आगे बढ़ना नहीं है. - निषेचन के पूर्ण होने पर, एक 100 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से डालने के लिये और ताजा दप साथ एक संस्कृति डिश में rinsing द्वारा युग्मनजों पर दप बदल जाते हैं. यह ऑक्सीजन भुखमरी को रोकने के लिए अतिरिक्त शुक्राणु को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. 15-30 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति डिश रखें.
3 डी jellying और रोइंग निषेचित अंडे
- एक 60 x 15 मिमी polystyrene पेट्री डिश ढक्कन लेने के द्वारा इंजेक्शन व्यंजन तैयार करते हैं.
- Microinjection माइक्रोस्कोप पर देखने के क्षेत्र से मेल खाता है कि आसपास के क्षेत्र डिश के पीछे, पर एक स्थायी मार्कर पेन लाइन ड्रा. यह सब rowed भ्रूण देखने की खुर्दबीन क्षेत्र के भीतर कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है.
- चक्र, पी के माध्यम से एक लाइन स्कोर करने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग करेंreferably चक्र (3B चित्रा) के एक तरफ से. इंजेक्शन सुई (4.5 चरण) को तोड़ने के लिए बाद में इस लाइन का प्रयोग करें.
नोट: अभिकर्मकों सामान्यतः समुद्री साही भ्रूण, जैसे, protamine सल्फेट या पाली एल Lysine, अनावश्यक हैं पालन करने के लिए इस्तेमाल किया. पी डी जेली का सा miniata युग्मनजों uncoated प्लास्टिक को बहुत अच्छी तरह से चिपके रहते हैं. वे कांच के बर्तन को अच्छी तरह से छड़ी नहीं है कि ध्यान दें.
- सतह कवर किया जाता है, ताकि प्रत्येक पकवान लगभग 10 मिलीलीटर दप जोड़ें, लेकिन इस rowed भ्रूण उपद्रव हो सकता है के रूप में पानी पकवान में जरूरत से ज्यादा दिखावा नहीं होगा.
- पी निकालें पूर्व नौकायन के लिए एसिड दप साथ miniata युग्मनज जेली कोट. यह जेली कोट मॉडल समुद्री साही प्रजातियों के लिए मनाया कि अधिक से अधिक व्यापक है.
- पीएच 4.0-4.2 की रेंज में एसिड दप तैयार करें. पीएच सामान्य विकास की अनुमति है, जबकि जेली कोट के कुशल हटाने की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है.
- दप के 1 एल शेयर करने दप में 1 एन 1 (एम) एचसीएल की एकल बूँदें जोड़ें. प्रत्येक बूंद पूरी तरह से मिश्रण करने की अनुमतिऔर अधिक एचसीएल जोड़ने से पहले पीएच की निगरानी.
नोट: उचित पीएच में एचसीएल परिणामों के कई मिलीलीटर करने के लिए एक, लेकिन एक बार में पूरी मात्रा जोड़ नहीं है.
नोट: दप साथ धूआं हुड में 1 एन एचसीएल को तैयार है और 12 एन (12 मीटर) एचसीएल. - एक 100 माइक्रोन जाल फिल्टर पर उन्हें गिरने से युग्मनजों पर दप निकालें. (लगभग 10 मिलीलीटर) संभव दप की छोटी राशि में एक 200 मिलीलीटर बीकर में कुल्ला. एसिड दप (पीएच 4.0) के साथ 150 मिलीलीटर बीकर भरें और युग्मनजों 3 मिनट के लिए एसिड दप में बैठने की अनुमति.
- दो 200 मिलीलीटर बीकर के बीच आगे और पीछे उन्हें गिरने से युग्मनज से जेली कोट पट्टी, एक 200 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से युग्मनजों गुजर हर बार. के बारे में एक 2 मिनट का समय खिड़की पर 5-10x आसपास फिल्टर के माध्यम से युग्मनजों डालो.
- एक 100 माइक्रोन जाल फिल्टर पर युग्मनजों गिरने से एसिड दप निकालें. दप के साथ एक छोटे से गिलास संस्कृति डिश में युग्मनजों कुल्ला. डी जेली का सा युग्मनजों प्लास्टिक के बर्तन के लिए छड़ी सकता है. पंक्ति भ्रूण तुरंत; वे अधिक जम्मू उत्पादन शुरूसमय के साथ प्लास्टिक के बर्तन को गरीब आसंजन की ओर जाता है जो Elly कोट.
- कांच संस्कृति पकवान से युग्मनज उठाओ और इंजेक्शन व्यंजन पर सीधे लाइनों में उन्हें जगह एक मुँह पिपेट (चित्रा -3 सी सी ') का प्रयोग करें. कांच नरम है जब तक एक लौ पर एक पाश्चर पिपेट की पतली पक्ष के केंद्र पिघला. जल्दी से कांच का एक बहुत पतली खिंचाव के उत्पादन के लिए अलग कांच की छोर खींच. गिलास ठंडा हो जाने पर, (एक मुँह पिपेट Wessel एट अल देखने की तैयारी पर अतिरिक्त जानकारी के लिए. 2004 17 या मीठा एट अल. 2004 18) पाश्चर पिपेट के छोटे अंत से टूट गया.
- केवल एक ही युग्मनज दर्ज करें और एक समय में पिपेट बाहर निकल जाएगा तो यह है कि व्यास भ्रूण के व्यास से सिर्फ बड़ा है कि एक रोइंग पिपेट ऐसे बनाओ. यह एक ही पंक्ति फार्म के लिए अनुमति देगा. छोटे व्यास pipettes निषेचन लिफाफा पट्टी और पी के रूप में युग्मनज को बाधित कर सकते हैं miniata युग्मनजों एक Hyaline झिल्ली एक के लिए नहीं हैND काफी नरम हैं.
- युग्मनजों प्लास्टिक पकवान के लिए छड़ी नहीं है, तो अतिरिक्त समय एसिड दप में (कई मिनट तक) के लिए उन्हें रखना. वैकल्पिक रूप से एक छोटे व्यास पिपेट युग्मनजों अधिक प्रभावी ढंग से छड़ी करने के लिए अनुमति देने के लिए जेली कोट को दूर करने में सहायता कर सकते हैं.
- युग्मनजों थोड़ा सकारात्मक उछाल रहे हैं और नाव या बस पकवान के नीचे से ऊपर मंडराना के लिए करते हैं. युग्मनजों धीरे वे पिपेट (चित्रा 3 डी) से बाहर निकलने के रूप में पकवान की सतह पर दबाया जाता है, ताकि इस मामले में, रोइंग पिपेट की स्थिति.
नोट:. यह इन व्यंजनों पर कई पंक्तियों को फिट करने की अनुमति है पी miniata भ्रूण झिल्ली समय के साथ घुसना और अधिक कठिन नहीं हो जाते और इसलिए एक एक डिश पर युग्मनजों के सैकड़ों इंजेक्षन कर सकते हैं.
युग्मनज के 4 इंजेक्शन
- एक अंतिम सान्द्र में उपयुक्त morpholino antisense oligonucleotides की सांद्रता (MASO), mRNA, या DNAs साथ इंजेक्शन समाधान तैयार200 मिमी KCl की entration. 400-800 माइक्रोन MASO और डीएनए की 2.5 एनजी / μl विषाक्तता को कम करते हुए morphant phenotypes का उत्पादन करते हैं. अंडे में अंतिम एकाग्रता प्रारंभिक एकाग्रता 14 वें 1/125 हो जाएगा. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस MASOs, गर्मी से युक्त इंजेक्शन समाधान के लिए इस्तेमाल करते हैं और फिर कमरे के तापमान पर स्टोर करने के लिए तुरंत पहले.
- इंजेक्शन भ्रूण छँटाई की आसानी के लिए, 0.1% की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन समाधान के लिए rhodamine dextran ट्रेसर जोड़ें.
- निर्माता के निर्देशों का पालन साधन खींच एक सुई में गिलास केशिका टयूबिंग (1.0 मिमी आयुध डिपो एक्स 0.75 मिमी आईडी, 100 मिमी लंबाई) खींच कर इंजेक्शन सुई तैयार करें. समुद्री अर्चिन में इंजेक्शन के लिए उपयुक्त सुई भी समुद्र सितारों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, तो इसी तरह मापदंडों 19 का उपयोग करें.
- एक microloader विंदुक टिप का उपयोग कर एक इंजेक्शन सुई में इंजेक्शन समाधान के लगभग 2 μl लोड.
- मीटर में सुई की कुंद अंत डालेंanipulator. सेट 100 मिसे नाड़ी को Picospritzer और 40 साई की एक हवा के दबाव.
- खुर्दबीन मंच पर rowed भ्रूण का एक पकवान प्लेस और देखने के क्षेत्र में सभी भ्रूण है. रन लाइन सुई के सबसे करीब तरफ है कि इस तरह के पकवान मालूम. टिप लाइन के बीच निकट और सिर्फ पानी की सतह से ऊपर है तो एक लगभग 60 डिग्री के कोण पर सुई की स्थिति.
- रन लाइन पर ध्यान केंद्रित करने और टिप ध्यान में आता है जब तक सुई कम है. एक छोटे से अधिक टिप लोअर और रन लाइन की लकीरें में धीरे यह चलाकर यह खुला टूट गया. पकवान की सतह से टिप उठाएँ और युग्मनजों की पहली पंक्ति के शीर्ष पर, यह स्थिति और युग्मनजों पर ध्यान केंद्रित.
- यह एक 60 डिग्री कोण के आसपास से आने युग्मनज के केंद्र कोंचना होगा कि इस तरह की टिप कम करें. सुई आसानी पी प्रवेश miniata युग्मनजों. Inje की एक सांस में पेश करने का पैर पेडल (या इंजेक्शन की सुई से सामग्री मजबूर के अन्य साधन) पर कदमभ्रूण में ction समाधान.
- 20-30% भ्रूण का व्यास है, या 25 के बीच और 80 PL कि एक सांस के लिए निशाना लगाओ. सांस में इस से भी बड़ा या छोटा है, तो Picospritzer पर इंजेक्शन की अवधि को समायोजित करने और अगले भ्रूण इंजेक्षन. वांछित सांस आकार प्राप्त करने की अवधि को समायोजित करने के लिए आगे बढ़ें. 100 मिसे अवधि में प्रारंभ करें. लगभग 200 मिसे से अधिक उपयुक्त सांस में पेश करने की जरूरत है अगर सुई पुन: टूट गया. सुई त्यागें और कम से कम 15-20 मिसे सुई का आकार बहुत बड़ा है के रूप में इस सांस आकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और सामान्य विकास बाधित हो सकता है अगर एक नया एक तैयार करते हैं.
- इंजेक्शन पकवान पर शेष युग्मनजों इंजेक्षन के लिए आगे बढ़ें. भ्रूण आसानी से दरार शुरू होता है और जब तक पहली दरार के बाद एकल blastomeres में इंजेक्ट किया जा सकता है. समय समय पर सुई पर चिपके रहते हैं कि युग्मनजों दूर करने के लिए पानी की सतह से ऊपर सुई उठा. आवश्यक सुई की नोक फिर से तोड़ने या एक रुकावट आती है, तो एक नई सुई लोड.
- भ्रूण दप में 15 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने की अनुमति. ऑक्सीजन विनिमय के लिए अनुमति देने के लिए संस्कृतियों में मात्रा के लिए उच्च सतह क्षेत्र बनाए रखें. भ्रूण भीड़ नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करना; पर या 200 भ्रूण / एमएल नीचे संस्कृतियों रखना. भ्रूण के वांछित मंच पर निर्भर करता है, चारों ओर 20-24 घंटे के बाद निषेचन में इंजेक्शन भ्रूण को इकट्ठा करने की योजना है.
नोट: इस बार सॉर्ट और सामान्य रूप से विकसित भ्रूण आसानी आकृति विज्ञान प्रतिष्ठित हैं, लेकिन अभी तक तैराकी नहीं कर रहे हैं क्योंकि इकट्ठा करने के लिए एक आदर्श समय है. - भ्रूण रची है, तो धीरे तैराकी रोकने के लिए झटका नमक. धीरे दप घूमता जबकि इंजेक्शन डिश में दप के 10 एमएल के लिए 5 एम NaCl के 200 μl जोड़ें. कुछ ही मिनटों के बाद, भ्रूण पकवान की तह तक गिर जाएगी. इन लीजिए और सामान्य लवणता दप के लिए उन्हें स्थानांतरित.
- Injecti में इस्तेमाल किया ट्रेसर के साथ संगत एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत के तहत इंजेक्शन भ्रूण लीजिएसमाधान पर. कोई ट्रेसर इस्तेमाल किया गया था, की तरह भ्रूण सामान्य आकारिकी के लिए चयन करने के लिए.
- एक मुंह विंदुक का प्रयोग, दप की एक न्यूनतम राशि के साथ भ्रूण ऊपर fluorescing आकर्षित और दप से भरा एक छोटा सा संस्कृति डिश में उन्हें बाहर उड़ा. आदर्श मुंह pipettes भ्रूण उन्हें नुकसान पहुँचाए बिना में और बाहर खींच लिया, लेकिन अवांछित भ्रूण और बाहरी दप भी खिंचाई कर रहे हैं कि इतने बड़े नहीं होने के लिए एक बड़ा पर्याप्त खोलने की है.
- एक बार वांछित भ्रूण के सभी नए पकवान में एकत्र किया गया है, फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत भ्रूण निरीक्षण और किसी भी संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन भ्रूण या खराब विकसित भ्रूण को हटा दें.
- संस्कृति एक मशीन में वांछित चरणों के भ्रूण हल और इमेजिंग या अन्य वांछित प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के भ्रूण में अभिकर्मकों लागू है. हम हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति है कि ड्राइव एक डीएनए संवाददाता का निर्माण इंजेक्शन द्वारा प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन. डीएनए जल्दी दरार के दौरान शामिल किया गया के रूप में इंजेक्शन भ्रूण प्रतिरूप पैच (चित्रा -4 ए बी) में GFP व्यक्त करते हैं. भ्रूण में पेश करने वांछनीय हैं कि कई अभिकर्मकों उच्च मात्रा में और भ्रूण की suboptimal बैचों को विषाक्त कर रहे हैं. , विकास में देरी निषेचित अंडे चरण जल्दी दरार में या कम से विकास को गिरफ्तार करने से विषाक्तता प्रकट होता है, या न्यायपालिका विकास (चित्रा 5A-सी) लगाने से.
पी से चित्रा 1 प्राप्त युग्मक miniata वयस्कों. ए) उत्पाद शुल्क के लिए gonads एक हाथ समीपस्थ की ओर एक चीरा बनानेइस चीरा से निकाला गहरे भूरे रंग सामग्री) जानवर. बी के बीच करने के लिए पेट ऊतक है. यह यहाँ के रूप में दिखाया अंडाशय ऊतक रंग में आमतौर पर नारंगी है) पशु. सी चोट पहुंचाना होगा, लेकिन यह भी पीले या हल्के भूरे रंग के रूप में हो सकता आंत ऊतक खींच से बचें. के रूप में दिखाया डी) testes, रंग में सफेद या बेज हैं. सभी स्केल सलाखों 1 सेमी निरूपित.
चित्रा 2 परिपक्वता और oocytes की निषेचन. परिपक्वता के लिए तैयार कर रहे हैं कि एक) स्वस्थ oocytes एक दृश्य कीटाणु पुटिका. बी) परिपक्वता के लिए तैयार नहीं हैं उपस्थिति. सी) 1-methyladenine साथ परिपक्व किया गया है कि एक oocyte में, छोटे भूरे रंग के, और दानेदार हैं कि Oocytes के साथ बड़े और स्पष्ट कर रहे हैं . कीटाणु पुटिका) एक फर्टिलाइजर्स से घिरे युग्मनज. टूट घ हैilization लिफाफा. ई) इनमें oocytes निस्पंदन द्वारा नहीं हटाया जाएगा क्योंकि परिपक्व नहीं किया जा सकता कि बड़े oocytes साथ संस्कृतियों से बचें. इस तरह oocytes ए में एक से थोड़ा छोटा कर रहे हैं और गहरे भूरे रंग और दानेदार बनावट हैं. एक में पैमाने बार 50 माइक्रोन अर्थ और छवियों एई के लिए पैमाने का प्रतिनिधित्व करता है.
विधानसभा के लिए 3 apparatuses चित्रा. एए ') एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बांधा एक जाल फिल्टर. ट्यूब और ढक्कन के बीच की पतली अंत संस्कृतियों ट्यूब और फिल्टर. बी) एक 60 x 15 मिमी polystyrene संस्कृति डिश के ढक्कन से निर्मित एक इंजेक्शन पकवान के माध्यम से डाला जा करने के लिए अनुमति देने के लिए बाहर काट रहे हैं. केंद्र के चारों ओर खींचा एक चक्र इंजेक्शन खुर्दबीन के मद्देनजर क्षेत्र की रूपरेखा और रोइंग भ्रूण के लिए एक गाइड के रूप में कार्य करता है. एक लाइन पूर्णांक रन बनाएओ पकवान इंजेक्शन सुइयों को तोड़ने के लिए उपयोगी है. सीसी ') मुँह पिपेट सेट अप. एक कई फुट लंबी रबर ट्यूब के एक छोर में एक मुखपत्र फ़िट. संक्षेप में पिघलने से आकार दिया गया है, जो एक पाश्चर पिपेट, को दूसरे छोर से फिट हैं और योजनाबद्ध भ्रूण को नुकसान पहुँचाए बिना चिपके बढ़ावा देने के लिए एक आदर्श रोइंग पाश्चर पिपेट आकार और चौड़ाई का प्रदर्शन) गिलास. डी की संकीर्ण अंत खींच रहा है. खींच लिया विंदुक के बंद अंत तोड़ने जब अंत दूर पकवान से फ्लोटिंग से उभरते युग्मनज को रोकने के लिए पतला है, तो यह उपयोगी है. सभी स्केल सलाखों 3 सेमी निरूपित.
चित्रा 4 अभिकर्मकों सफलतापूर्वक Microinjection द्वारा शुरू की. ए) एक GFP संवाददाता प्लाज्मिड इंजेक्शन के साथ एक ब्लासटुला चरण भ्रूण के डीआईसी. भ्रूण सामान्य आकारिकी है. बी) GFP expreए सी में दिखाया भ्रूण) दो आकृति विज्ञान के सामान्य ब्लासटुला चरण भ्रूण. डी) सी से एक भ्रूण के डीआईसी छवि में ssion टेक्सास लाल dextran की शुरूआत से एक लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है. अन्य भ्रूण संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन है और कोई प्रतिदीप्ति दर्शाती है. स्केल सलाखों 50 माइक्रोन निरूपित. एक में स्केल बार सी में ए और बी स्केल बार के लिए पैमाने का प्रतिनिधित्व सी और डी के लिए पैमाने का प्रतिनिधित्व करता है
एक भ्रूण गिरफ्तार गिरफ्तार या न्यायपालिका विकास. सभी छवियों भ्रूण का एक ही इंजेक्शन बैच से 24 घंटे के बाद इंजेक्शन हैं. ए.ए. में चित्रा 5 Overinjection और अभिकर्मक विषाक्तता परिणाम ') एक सेल चरण में गिरफ्तार एक overinjected युग्मनज. बी बी') जल्दी दरार में. इस भ्रूण को गिरफ्तार कर लिया, जबकि एक स्वस्थ भ्रूण, संतुलित रूप से बांट देंगेअसामान्य कोशिका विभाजन की वजह से. सीसी ') के कारण विषाक्तता के लिए बेतहाशा न्यायपालिका विकास के साथ एक भ्रूण. इस भ्रूण को मोटे तौर पर एक ब्लासटुला भ्रूण (डी) जैसे आकार का होता है, तो यह ठीक से ब्लासटुला चरण भ्रूण इंजेक्शन विकसित विषम और असामान्य रूप से ठंडा. डीडी ') एक है. एक में स्केल बार 50 माइक्रोन अर्थ और सभी पैनलों के लिए पैमाने का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
इस तकनीक का नौसिखिया उपयोगकर्ताओं के लिए मुश्किल हैं लेकिन सफलतापूर्वक morphant भ्रूण बनाने के लिए आवश्यक हैं कि दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. पहले परिपक्व और ठीक से खाद डालना होगा कि स्वस्थ oocytes का चयन होता है. एक संस्कृति में सामान्य विकास के प्रतिशत के मौसम पर निर्भर करता है, पशुओं के स्वास्थ्य, और oocytes एक ही व्यक्ति से काटा गया है कि बार की संख्या. Oocytes अक्टूबर के माध्यम से अप्रैल से बेहतर गुणवत्ता के हो जाते हैं. यह बहुमत 2A चित्रा बजाय चित्रा 2B की तरह लग रही है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आगे बढ़ने से पहले oocytes को ध्यान से देखने के लिए महत्वपूर्ण है. यह वे oocytes कार्रवाई की जाती है के रूप में बाहर फिल्टर करने के लिए काफी छोटे हैं, खासकर अगर परिपक्व नहीं होगा कि oocytes की एक छोटी संख्या है करने की अनुमति है. कभी कभी, अविकसित हैं कि oocytes परिपक्वता के लिए तैयार कर रहे हैं कि पूरी तरह से विकसित oocytes के रूप में लगभग के रूप में बड़े हैं. वे अपने दानेदार, भूरा कलर से साफ़ कर रहे हैंजी (चित्रा 2 ई). निस्पंदन अविकसित oocytes से पूरी तरह से विकसित oocytes अलग नहीं होगा और वे अक्सर चित्रा 5 में देखा दोषों का प्रदर्शन करने की संभावना है कि असामान्य भ्रूण संस्कृतियों में परिणाम क्योंकि इस प्रकार के oocytes के बैच का प्रयोग न करें.
अन्य महत्वपूर्ण कदम इंजेक्शन सांस आकार है. गैर विशिष्ट प्रभाव पैदा करने के रूप में एक प्रभाव डालती पर्याप्त बड़ी है, लेकिन इतनी बड़ी नहीं है कि perturbing अभिकर्मक की राशि का परिचय. एक perturbing अभिकर्मक प्रयोग किया जाता है पहली बार, यह अभिकर्मक के कई सांद्रता की कोशिश कर रहे हैं, जिसमें एक अनुमापन प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है. उम्मीद phenotype, या देरी विकास (चित्रा 5A) से संबंधित नहीं हैं कि विकास संबंधी असामान्यताएं पैदा नहीं करता कि सर्वोच्च एकाग्रता के साथ बाद microinjections प्रदर्शन करना. यह सामान्य विकास को बाधित कर सकते हैं के रूप में अधिक से अधिक से अधिक 30% भ्रूण का व्यास है कि एक सांस में इंजेक्शन लगाने से बचें. सीओ द्वारा पीढ़ी छोटे सांस आकार,ntrast, नेत्रहीन replicates भर में गड़बड़ी phenotypes की एक अत्यधिक श्रृंखला के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो लगातार नौकरशाही का आकार घटाने के लिए निरीक्षण करने के लिए मुश्किल है.
Perturbing अभिकर्मकों प्रभावी एकाग्रता पर्वतमाला में विकासात्मक देरी या गैर विशिष्ट phenotypes कारण हो सकता है. यह इसलिए, इस तरह के एक मानक नियंत्रण MASO, मानक डीएनए निर्माणों, या rhodamine ट्रेसर के रूप में एक सौम्य अभिकर्मक के साथ भाई नियंत्रण इंजेक्षन, बहुत महत्वपूर्ण है. इन नियंत्रणों सामान्य विकास दिखाने केवल अगर परख morphant भ्रूण. नियंत्रण सहित इंजेक्शन भ्रूण,, कभी कभी एक झुर्रियों ब्लासटुला फेनोटाइप प्रदर्शन, लेकिन वे अक्सर सामान्य रूप से विकास के बाकी के माध्यम से आगे बढ़ना होगा. एक विशेष अभिकर्मक लगातार परिणामस्वरूप morphant भ्रूण में विकास की देरी का कारण बनता है तो इसके साथ ही, वे अनुभव कर रहे हैं कि कितने देरी के घंटे निर्धारित करने के लिए भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए इन भ्रूणों की तुलना करें.
एस में इसकी उपयोगिता सीमित कर सकता है कि इस विधि के कुछ गुण मौजूद हैंpecific प्रयोगात्मक परिदृश्यों. ऐसा ही एक मुद्दा एक ही निषेचित अंडे या जल्दी दरार चरणों में अभिकर्मकों लागू कर सकते हैं कि तथ्य यह है. ब्याज की जीन या मार्ग inviable जल्दी विकास और परिणामी morphant भ्रूण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण रहे हैं या सार्थक अध्ययन के लिए भी developmentally असामान्य है अगर यह विशेष रूप से समस्याग्रस्त है. कभी कभी इस मुद्दे को एक gentler, अधूरा पछाड़ना है, जिसके परिणामस्वरूप perturbing अभिकर्मक से कम प्रतियां इंजेक्शन द्वारा हल हो गई है. लक्ष्य जीन या मार्ग के लिए एक उपयुक्त सेल पारगम्य दवा मौजूद है, तो यह एक बाद में, अधिक उपयुक्त मंच पर दवा के साथ इलाज भ्रूण के साथ निषेचित अंडे चरण में अभिकर्मकों के साथ इंजेक्शन भ्रूण के phenotype तुलना करने के लिए उपयोगी है. MASOs या mRNAs का इंजेक्शन अधिक से अधिक विशिष्टता प्रदान करता है, क्योंकि यह दवा उपचार के पक्ष में microinjection छोड़ने के लिए विरोध के रूप में एक दवा उपचार के अध्ययन के साथ संयोजन के रूप में इस विधि का उपयोग करने के लिए और अधिक शक्तिशाली है.
अंत में, इस सूक्ष्म हालांकिइंजेक्शन विधि यह सबसे अच्छा कई 100-1000 स्वस्थ, सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण का उत्पादन होगा, बहाव के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए भ्रूण के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पादन होगा. कुछ वांछित प्रयोगों इस तुलना में काफी अधिक सामग्री की आवश्यकता हो सकती. इस विधि उपन्यास है और अभी तक व्यापक उपयोग प्राप्त नहीं हुआ है, हालांकि सफलतापूर्वक समुद्री साही प्रणाली में इस्तेमाल अन्य विधियों, ऐसे pantropic रेट्रोवायरस के रूप में 20 morphant समुद्र सितारा भ्रूण की भी बड़ी संख्या बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष लेखकों द्वारा घोषित.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन IOS 0844948 और IOS 1024811 द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
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