Summary
Metoder som producerar morphant embryon är viktigt att studera utvecklingsmekanismer och genreglerande nätverk. Havet stjärnan Patiria miniata är en framväxande modellsystem för dessa studier. Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla könsceller, som producerar kulturer av embryon, och snabb mikroinjektion av zygoter från denna art.
Abstract
Tagghudingar har länge varit en favorit modellsystem för studier av reproduktion och utveckling, och på senare tid för att studera genreglering och utvecklingen av utvecklingsprocesser. Havet stjärna, Patiria miniata, vinner utbredning som modellsystem för dessa typer av studier som tidigare utförts nästan uteslutande i de sjöborrar, Strongylocentrotus purpuratus och Lytechinus variegatus. En fördel med dessa modellsystem är den lätthet att producera modifierade embryon i vilka en särskild gen är upp eller nedregleras, märkning av en grupp av celler, eller införa en reportergen. En enda mikroinjektion metod kan skapa en mängd olika sådana modifierade embryon. Här presenterar vi en metod för att erhålla könsceller från P. miniata, producerar zygotes, och införa störande reagens via mikroinjektion. Friska morphant embryon därefter isoleras för kvantitativa och kvalitativa studier av GEne funktion. Tillgången på genom och transkriptom data för denna organism har ökat de typer av undersökningar som utförs och hur lätt uppdragen.
Introduction
Havet stjärna, Patiria miniata, (vanligen kallad bat stjärnan) växer fram som ett intressant och mångsidigt modellsystem för en mängd olika cell 1 3, utvecklings 4,5, evolutionära 6 8 och ekologiska studier 9- 11. Vuxen P. miniata är fördelade längs Stillahavskusten från Sitka, Alaska till Baja, Kalifornien 12 och lätt underhålls i marina akvarier. Oocyter kan erhållas året runt och varje hona kan kasta tiotusentals ägg. Oocyter lätt mognat och gödslas externt 13. De resulterande embryon är transparenta vilket möjliggör enkel observation; de utvecklas synkront, och kräver endast havsvatten för utveckling. Hela genomet montering och flera transcriptomes är också tillgängliga för P. miniata ( Echinobase.org ). Sådana fördelar gör dem idealiska för en rad forskningsoch undervisningsändamål.
Under de senaste åren, P. miniata har blivit ett modellsystem för utvecklings genreglerande nätanalyser 14- 16. Syftet med sådana undersökningar är att identifiera hela komplimang av reglerande gener och bestämma nätverket av deras interaktioner. Mycket av detta arbete medför störande genuttryck genom införande av antisensoligonukleotider eller in vitro syntetiserade mRNA. Dessutom är cis-regulatoriska analyser användes för att karakterisera funktionen av reglerande DNA 15. Dessa analyser kräver introduktion av störnings reagens och / eller DNA-reporterkonstruktioner i embryon. Vidare att karaktärisera de efterföljande effekterna av dessa störningar måste man analysera många embryon till förändringar i genuttryck av potentiella mål. Tekniker för mikroinjektion av många hundra zygoter är centrala för detta arbete.
Tagghudingar, däribland P. miniata de novo genom mikroinjektion. Mikroinjektion erbjuder en möjlighet att modifiera embryon med reagenser som inte cellpermeabel. Följande protokoll beskriver en metod för att införa DNA, mRNA, cellspårämnen, och morfolino antisensoligonukleotider i hundratals befruktade ägg i en 2-3 tim sammanträdet genom mikroinjektion. Detta producerar tillräckligt material för en mängd olika experiment nedströms inklusive, men inte begränsat till, qPCR, in situ hybridisering, RNA-Seq, och western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Håll alla havsvatten eller artificiell havsvatten (SV), vuxna djur, och kulturer vid 15 ° C så mycket som är praktiskt. Se till ägg och zygoter hålls nedsänkt i SW.
Kommersiellt framställda havet salter rekonstitueras med destillerat eller omvänd osmos vatten tjänar väl såsom en källa av SW. Kontrollera salthalten med hjälp av en hydrometer och justera salter eller vatten för att uppnå optimala nivåer. Håll densitetsnivåer mellan 1,020-1,025. Håll alla glas och plastartiklar åtskild från all annan laboratorieutrustning för att undvika kontaminering med kemikalier. Ren embryo grade laboratorieutrustning genom att skölja med avjoniserat vatten eller tillfällig blötläggning i utspädd natriumhypoklorit följt av sköljning flera gånger i vatten.
1 Skaffa och Förfall Könsceller från Patiria miniata Vuxna
- Välj ett djur för att skära könskörtlarna. Bestäm sex efter excision genom att leta efter förekomst av äggstockarna eller testiklarna eftersom P. miniata är inte i sigxually dimorfa.
- Skär en liten öppning, inte större än 1 cm, längs sidan av en sjöstjärna arm med ett skalpellblad (Figur 1A). Med små trubbiga ändar pincett pull back kanter snittet för att komma åt gonad vävnad och dra gonad vävnad ut genom snittet.
OBS: Undvik att dra ut tarmvävnad, vilket är en lös grå eller brun vävnad (Figur 1B). Äggstockar är vanligtvis orange, gul eller ljusbrun (Figur 1C), medan testiklarna är vita eller beige och när störs orsakar havsvatten blir mjölkaktig eller grumlig (figur 1D). - Återgå honor till akvarier. Isolera hanar för en timme eller två i en behållare med SW eftersom stress från hantering kan framkalla lek. Djur läker längs snittet webbplatsen och fortsätta att ge könsceller i flera månader.
- Samla testiklar i ett 1,5 ml Eppendorf-rör med så lite SW som möjligt och förvara på is fram till användning. Förvara alla testiklarna inte ossed på insamlingsdagen vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Samla äggstockar i ett litet glas odlingsskål i en flera milliliter SW. För att frigöra de oocyter från äggstockarna vävnad, retas isär vävnaden med två par pincett tills inga stora bitar kvar.
OBS: Optimalt är majoriteten av oocyter fullt utvecklade. Sådana ägg är stora, runda och klar gul eller ljusbrun med en distinkt germinal vesikel i äggcellen (Figur 2A), jämfört med den undergrupp av outvecklade ägg som är mindre, brun, kornig och ogenomskinlig (Figur 2B). Om mer än cirka 25% av oocyter är av den outvecklade sorten, välja en annan kvinna att få ägg. - Häll oocyter och återstående vävnaden genom ett filternät kopp med en 200 | im porstorlek och samla flöda igenom. Denna kommer att innehålla alla sorters ägg men ta bort äggstocksvävnad. Få bort kvarvarande ägg från vävnaden fångas av filtret genom sprutning wte SW från en sprutflaska. Filter koppar görs med hjälp av en 50 ml koniskt rör (Figur 3A-A ").
- Häll flödet genom från steg 1.6 genom en 100 pm nätfilter cup. Kasta små ägg i flödet genom. Stora fullt utvecklade ägg som är färdiga för mognad kommer att stanna på filtret. Skölj ägg i en ren 200 ml bägare.
- Lägg 95 ml SW till 200 ml glasbägare oocyter. Tillsätt 5 ml 200 pM 1-metyladenin för en slutlig koncentration av 10 | iM.
- Överför oocyterna till ett stort grunt odlingsskål och placera vid 15 ° C. En hög ytarea till volym odlingsskål möjliggör syreutbytet. Oocyterna inte mogna eller inte utvecklas väl om de är överfulla under denna mognadsfasen. Dela upp i flera rätter av SW plus 10 ^ M 1-methlyadenine tills kulturen är mindre än 200 oocyter / ml.
- Låt oocyter mogna i 45-90 minuter, men inte längre eftersom detta kommer att medföra att de äggceller som inte kan vara fertilized. För att avgöra om mognad är klar, titta på ägg under ett dissekera omfattning. De germinala vesikler rör sig mot och säkringar med cellmembranet under mognad. Det bryter sedan ner och därför inte längre är synlig i mogna oocyter (fig 2C).
2. Befruktning av mogna oocyter
- Valde en liten samling av testikelvävnad, ungefär ärtstora och köttfärs i en liten glasodlingsskål med ca 1 ml SW.
- Använd en Pasteur-pipett för att överföra 2-3 droppar av den resulterande mjölkiga havsvatten till cirka 100 ml av den mogna oocyter och snurra odlingsskålen för att blanda. Undvik att överföra bitar av testikel vävnad. Undvik att lägga större mängder spermier eftersom detta kan leda till polyspermi och efterföljande dålig utveckling.
- Efter flera minuter observera ägg under ett dissekera omfattning. Befruktade ägg eller zygoter, har en befruktning kuvert, vilket är en klar bubbla som stiger av cell membran (figur 2D).
OBS: Fortsätt inte med kulturen om mindre än cirka 90% ägg gödsla eftersom dåliga befruktnings priser är en indikation på en ohälsosam kultur som kanske inte heller utvecklas väl. - Efter befruktningen är klar ändrar SW på zygotes genom att hälla genom en 100 pm filternät och sköljning i en odlingsskål med färskt SW. Det är viktigt att avlägsna överskottet spermier för att förhindra syrebrist. Placera odlingsskålen vid 15 ° C under 15-30 min.
3 De-jellying och Rodd befruktade ägg
- Förbered injektionsrätter genom att ta bort locket från en 60 x 15 mm polystyren petriskål.
- Rita en permanent märkpenna linje på baksidan av skålen, runt det område som motsvarar synfältet på mikroinjektion mikroskop. Detta säkerställer att alla rodde embryon är inom mikroskopets synfält.
- Använd ett glas pasteurpipett att göra mål en linje genom cirkeln, sreferably off till en sida av cirkeln (figur 3B). Använd denna linje senare bryta injektionsnålar (Steg 4.5).
OBS: Reagens som vanligen används för att hålla sig över havet urchin embryon, till exempel, protaminsulfat eller poly-L lysin, är onödiga. De-gelatinerad P. miniata zygotes hålla mycket väl till obestruket plast. Observera att de inte fastnar bra på glas rätter.
- Lägg ca 10 ml SW till varje maträtt så att ytan är täckt, men vattnet kommer inte plaska för mycket i skålen eftersom det kan störa rodde embryon.
- Ta av P. miniata zygot gelé päls med syra SW före rodd. Denna gelé päls är mer omfattande än den som observerats för modell Sea Urchin arter.
- Förbered syra SW i intervallet pH 4,0-4,2. PH är avgörande för att möjliggöra en effektiv borttagning av gelé päls samtidigt medger normal utveckling.
- Lägg enstaka droppar 1 N (1 M) HCl i SW till en 1 L lager av SW. Låt varje droppe att blanda heltoch övervaka pH innan du lägger mer HCI.
OBS: En till flera ml HCl resultat i lämpligt pH, men inte lägga hela volymen på en gång.
OBS: Bered 1 N HCl i dragskåp med SW och 12 N (12 M) HCl. - Ta SW på zygoter genom att hälla dem på en 100 pm nätfilter. Skölj i en 200 ml bägare i den minsta mängden SW möjligt (ca 10 ml). Fyll bägaren upp till 150 ml med syra SW (pH 4,0) och låta zygoter att sitta i syra SW för 3 min.
- Skala gelé päls från zygotes genom att hälla dem fram och tillbaka mellan två 200 ml bägare, varje gång passerar zygotes genom en 200 pm nätfilter. Häll zygotes genom filtret runt 5-10x över om en 2 min tid.
- Ta bort syra SW genom att hälla zygotes på en 100 pm nätfilter. Skölj zygotes i en liten glasodlingsskål med SW. De-jellied zygotes kan fastna på plastskålar. Embryon Row omedelbart; de börjar producera mer jelly päls vilket leder till dålig vidhäftning till plastskålar med tiden.
- Använd en mun pipett (figur 3C-C) för att plocka upp zygotes från glasodlingsskål och placera dem i räta linjer på injektions rätter. Smält centrum av den tunna sidan av en pasteurpipett över en låga tills glaset är mjukt. Snabbt dra ändarna av glaset från varandra för att åstadkomma en mycket tunn sträcka av glas. När glaset är coolt, bryta den lilla änden av pasteurpipett (för ytterligare information om att förbereda en mun pipett se Wessel et al. 2004 17 eller söt et al. 2004 18).
- Gör en rodd pipett så att diametern är precis större än diametern av embryona, så att endast en enda zygot kommer in och ut ur pipetten åt gången. Detta kommer att tillåta en enda rad för att bilda. Pipetter mindre diameter kan skala gödsling kuvertet och störa zygotes som P. miniata zygoter har inte en hyalinmembran ennd är ganska mjuk.
- Om zygotes inte fastnar på plastskål, hålla dem under ytterligare tid i syra SW (upp till flera minuter). Alternativt en pipett mindre diameter kan hjälpa till att ta bort gelé päls att låta zygotes att hålla mer effektivt.
- De zygoter är något positivt flytande och tenderar att flyta eller sväva strax ovanför botten på skålen. I detta fall, placera rodd pipetten så att zygotes försiktigt pressas på ytan av skålen när de lämnar pipett (Figur 3D).
OBS. Det är tillåtet att montera flera rader på dessa rätter P. miniata embryonala membran blir inte svårare att tränga in över tid och därför kan man injicera hundratals zygoter på en enda maträtt.
4 Injektion av Zygotes
- Förbered injektionslösningar med lämpliga koncentrationer av morpholino antisensoligonukleotider (maso), mRNA, eller DNA-sekvenser i en slutlig koncentration av 200 mM KCl. 400-800 iM MASO och 2,5 ng / l av DNA tenderar att producera morphant fenotyper samtidigt minimera toxicitet. Den slutliga koncentrationen i ägget kommer att vara 1/125: e utgångskoncentrationen 14. För injektionslösningar innehållande Masos, värm till 65 ° C under 5 minuter omedelbart före användning och sedan förvara i rumstemperatur.
- För att underlätta sortering injicerade embryon, till rodamin dextran tracer till injektionslösningen för erhållande av en koncentration av 0,1%.
- Förbered injektionsnålar genom att dra glas kapillärrör (1,0 mm YD x 0,75 mm innerdiameter, 100 mm längd) i en nål att dra instrumentet enligt tillverkarens instruktioner. Needles lämpliga för injektion i sjöborrar fungerar också bra för sjöstjärnor, så använd liknande parametrar 19.
- Fyll ca 2 l av injektionslösning i en injektionsnål med hjälp av en microloader pipettspetsen.
- Sätt i den trubbiga änden av nålen i manipulator. Ställ Picospritzer till 100 ms puls och ett lufttryck av 40 psi.
- Placera ett fat med rodde embryon på mikroskop scenen och har alla embryon i synfältet. Orientera skålen så att den perforerade linjen är på den sida som ligger närmast nålen. Placera nålen med en approximativt 60 ° vinkel så spetsen är nära mitten av raden och strax ovanför vattenytan.
- Fokus på den perforerade linjen och sänka nålen tills spetsen kommer i fokus. Sänk spetsen lite mer och bryta upp den genom att köra försiktigt in åsarna i den perforerade linjen. Lyft spetsen från ytan av skålen och placera den på toppen av den första raden i zygoter och fokusera på zygoter.
- Sänk spetsen så att den kommer att spetsa centrum av zygot som kommer in från omkring en 60 ° vinkel. Nålen tränger lätt P. miniata zygoter. Kliv på pedalen (eller andra medel för att tvinga materialet från injektionsnålen) att införa en bolus av Injektion lösning i embryot.
- Sikta på en bolus som är 20-30% av diametern av embryot, eller mellan 25 och 80 pl. Om bolus är större eller mindre än detta, justera längden på injektions på Picospritzer och injicera nästa embryot. Fortsätt att justera längden för att få önskad bolus storleken. Börja på 100 ms varaktighet. Åter bryta nålen, om den överstiger ca 200 msek behövs för att införa en lämplig bolus. Kasta nålen och förbereda ett nytt om det behövs mindre än 15-20 ms för att få denna bolus storlek som nålen är för stor och kan störa normal utveckling.
- Fortsätt att injicera återstående zygotes på injektions skålen. Embryon kan lätt injiceras tills klyvnings startar och i enskilda blastomeres efter första klyvning. Periodvis lyfta nålen ovanför vattenytan för att avlägsna zygoter som fastnar på nålen. Igen vid behov bryta nålspetsen eller ladda en ny nål om en blockering inträffar.
- Låt de embryon som utvecklas vid 15 ° C i SW. Upprätthåll hög ytarea till volym i kulturerna för att möjliggöra syreutbytet. Se till embryon är inte trångt; hålla kulturer vid eller under 200 embryon / ml. Beroende på den önskade stadiet av embryo, planerar att samla injicerade embryon på runt 20-24 timmar efter befruktning.
OBS: Detta är ofta en perfekt tid att sortera och samla in och eftersom normalt utvecklings embryon lätt särskiljas morfologiskt, men är ännu inte simma. - Om embryon har kläckts, försiktigt salt chock att förhindra simning. Tillsätt 200 pl av 5 M NaCl till 10 ml SW i injektions skålen samtidigt som du försiktigt snurra SW. Efter några minuter, kommer embryona faller till botten av skålen. Samla dem och flytta dem till normal salthalt SW.
- Samla injicerade embryon enligt ett lämpligt fluorescerande ljuskälla kompatibel med spårämnet används i injection lösning. Om ingen spårämne användes, sortera embryon för att välja för normal morfologi.
- Med hjälp av en mun pipett, rita fluorescerande embryon med en minimal mängd av SW och blåser ut dem i en liten odlingsskål fylld med SW. Ideal mun pipetter har en tillräckligt stor öppning för embryon som skall dras in och ut utan att skada dem, men inte så stor att oönskade embryon och främmande SW också dras upp.
- När alla önskade embryon har samlats in i den nya skålen, observera embryon i lysrörsljus och ta bort eventuella un-injicerade embryon eller dåligt utvecklade embryon.
- Kultur sorterade embryon till önskade stadier i en inkubator och fortsätt med avbildning eller andra önskade protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med detta protokoll är att införa reagenser i embryon. Vi visar effektiviteten av protokollet genom att injicera en DNA reporterkonstruktion som driver uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP). Injicerade embryon uttrycker GFP i klon fläckar (Figur 4A-B) som DNA innehåller under tidig klyvning. Många reagens som är lämpligt att i embryon är giftiga i stora mängder och till suboptimala partier av embryon. Toxicitets manifest by försena utvecklingen, arresting utveckling i tidig klyvning eller vid det befruktade ägget stadiet eller genom att införa avvikande utveckling (figur 5A-C).
Figur 1. Skaffa könsceller från P. miniata vuxna. A) För att skära gonader göra ett snitt på sidan av en arm proximaltill mitten av djuret. B) Den mörkbruna materialet dras från detta snitt är tarmvävnad. Undvik att dra tarmvävnad eftersom det kommer att skada djuret. C) Äggstock vävnad är vanligtvis orange färg som visas, men kan också vara gul eller ljusbrun. D) Testiklar är vita eller beige till färgen, så som visas. Alla skal barer betecknar 1 cm.
Figur 2 Mognad och gödsling av oocyter. A) Friska ägg som är färdiga för mognad är stora och tydliga med en synlig embryon vesikler. B) Oocyter som inte är redo för mognad är mindre, brunt, och korniga utseende. C) En Oocyte som har mognat med 1-metyladenin . Den germinal vesikel har brutit samman. D) En zygot omgiven av en fertsering kuvert. E) Undvik kulturer med stora ägg som inte kan mognat eftersom dessa ägg inte kommer att tas bort genom filtrering. Sådana ägg är något mindre än den i A. och är mörkare brunt och korniga struktur. Skalan bar i A betecknar 50 um och representerar skalan för bilder AE.
Figur 3. Apparat för montering. AA ') Ett filternät fäst vid ett 50 ml koniskt rör. Den avsmalnande änden av röret och mitten av locket skärs ut för att tillåta kulturer att hällas genom röret och filtret. B) En injektions skålen konstrueras från locket på en 60 x 15 mm polystyren odlingsskål. En cirkel dragen runt centrum skisserar synfältet av injektions mikroskop och fungerar som en guide för rodd embryon. En linje gjorde into skålen är användbart för att bryta injektionsnålar. CC ') Mun pipett set-up. Montera ett munstycke i ena änden av en flera fot lång gummislang. Montera den andra änden till en pasteurpipett, som har formats genom att kort smältning och dra den smala änden av glaset. D) Schematisk visar en ideal rodd pasteurpipett form och bredd för att främja fastnar utan att skada embryon. När bryta i slutet av av drog pipetten är det bra om slutet är avsmalnande för att förhindra att nya zygotes flyter bort från skålen. Alla skal barer anger 3 cm.
Figur 4. Reagens framgångsrikt Införd genom mikroinjektion. A) DIC en blastula skede embryo injiceras med en GFP reporter plasmid. Embryot har normal morfologi. B) GFP Expression i embryot som visas i A. C) DIC bild av två morfologiskt normala blastula skede embryon. D) Ett embryo från C avger en röd fluorescens från införandet av Texas Red dextran. Det andra embryot är un-injicerade och uppvisar ingen fluorescens. Skalstrecken anger 50 pm. Skala bar i A representerar skalan för A och B. Skala bar i C representerar skalan för C och D.
Figur 5 Overinjection och toxicitet resultat reagens i arresterad eller avvikande utveckling. Samtliga bilder är av embryon 24 timmar efter injektion från samma injektions parti. AA ') En overinjected zygot greps vid en cellstadiet. BB') Ett embryo greps i början av klyvning. En frisk embryo kommer att dela symmetriskt, medan detta embryo grepspå grund av onormala celldelningar. CC ') Ett embryo med vilt avvikande utveckling på grund av toxicitet. Även om detta embryo är formad ungefär som en blastula embryo (D), det är asymmetrisk och onormalt förtjockad. DD ') En väl utveckla injiceras blastula skede embryo. Skala bar i A betecknar 50 um och representerar skalan för alla paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två viktiga steg som är svåra för nybörjare av denna teknik, men är väsentliga för framgångsrikt skapa morphant embryon. Den första är att välja hälsosamma oocyter som förfaller och befrukta ordentligt. Andelen normal utveckling i en kultur beror på säsong, hälsa djuret, och antalet gånger som äggceller har skördats från en enda individ. Oocyter tenderar att vara av bättre kvalitet från april till oktober. Det är viktigt att titta noga på ägg innan du fortsätter att se till att de flesta ser ut som figur 2A stället figur 2B. Det är tillåtet att ha ett litet antal oocyter som inte kommer att mogna, i synnerhet om de är tillräckligt små för att filtrera ut som oocyterna bearbetas. Ibland, ägg som är outvecklad är nästan lika stor som fullt utvecklade ägg som är färdiga för mognad. De är särskiljbara genom deras kornig, brun coloring (Figur 2E). Använd inte partier av ägg av denna typ, eftersom filtrering inte isolera fullt utvecklade ägg från outvecklade oocyter och de leder ofta till onormala embryo kulturer som är mer benägna att ställa ut de brister som ses i figur 5.
Den andra kritiska steget är form bolus storlek. Införa en mängd av störande reagens som är tillräckligt stor för att utöva en effekt, men inte så stor att den orsakar icke-specifika effekter. Första gången en störande reagens används, är det bra att utföra en titrering där flera koncentrationer av reagens prövas. Utför efterföljande microinjections med den högsta koncentrationen som inte orsakar utvecklingsstörningar som inte är relaterade till den förväntade fenotypen, eller försening utveckling (Figur 5A). Undvik att injicera en bolus som är större än 30% av diametern av embryot, eftersom detta kan störa normal utveckling. Alltför små bolus storlekar av contrast, är svåra att visuellt inspektera för konsekvent dimensionering vilket kan leda till en överdriven utbud av störnings fenotyper över replikat.
Störande reagens kan orsaka försenad utveckling eller ospecifika fenotyper vid effektiva koncentrationsintervall. Det är mycket viktigt, därför att injicera syskonkontroller med en godartad reagens, som en standardkontroll MASO, standard DNA-konstruktioner, eller rodamin spårämne. Analys morphant embryon endast om dessa kontroller visar normal utveckling. Injicerade embryon, inklusive kontroller, uppvisar ibland ett skrynkligt blastula fenotyp men de kommer ofta gå igenom resten av utvecklingen normalt. Dessutom, om en viss reagens orsakar ständigt försenad utveckling i de resulterande morphant embryon, jämföra dessa embryon att styra embryon för att avgöra hur många timmar av förseningar de upplever.
Det finns några attribut för denna metod som kan begränsa dess användbarhet i sÄRSKILDA experimentella scenarier. En sådan fråga är det faktum att man bara kan införa reagenser vid befruktat ägg eller tidiga klyvningssteg. Detta är särskilt problematiskt om genen eller vägen av intresse är särskilt viktigt i början av utvecklingen och resulterande morphant embryon inviable eller för utvecklings onormalt för meningsfull undersökning. Ibland problemet är löst genom att injicera färre kopior av störande reagens, vilket resulterar i en mjukare, ofullständig knockdown. Om en lämplig cellpermeabel läkemedel för målgenen eller vägen finns, är det bra att jämföra fenotypen av embryon som injicerats med reagenser på det befruktade ägget scenen med embryon som behandlats med läkemedlet vid en senare, mer lämpligt skede. Eftersom injektion av Masos eller mRNA ger större specificitet, är det mer kraftfullt för att använda denna metod i kombination med en drog-behandlingsstudie i stället för att överge mikroinjektion till förmån för läkemedelsbehandling.
Slutligen, även denna mikroinjektionsmetod kommer att producera en tillräcklig mängd av embryon för en mängd olika tillämpningar i senare led, det kommer i bästa fall producera flera hundra och tusen friska, framgångsrikt injiceras embryon. Några önskade experiment kan kräva betydligt mer material än så. Andra metoder framgångsrikt används i sjöborre systemet kan modifieras för att skapa ännu större antal morphant hav stjärn embryon, såsom pantropiska retrovirus 20, även om denna metod är ny och har inte vunnit bred användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras av författarna.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation IOS 0844948 och IOS 1024811
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , UBC Press. (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
