Summary
Målet med denne protokol er at udføre en adfærdsmæssig analyse såsom opmærksomhedskravet sæt skiftende opgave (AST) for at vurdere præfrontale cortex-medieret kognitiv fleksibilitet i mus.
Introduction
Den opmærksomhedsgraden sæt skiftende opgave (AST) blev udviklet som et mål for opmærksomhed og kognitiv fleksibilitet i rotter over ti år siden 1,2. AST er modelleret efter den intradimensional / extradimensional komponent i Cambridge neuropsykologiske Test Automated Batteri (Cantab), som bruges til at identificere kognitiv dysfunktion hos mennesker og ikke-menneskelige primater 3,4. Mens evnen til at lære enkle regler forbliver intakt, til underskud i læring ændre et svar, når reglerne er ændret, er fundet i patienter, der lider af en række neuropsykiatriske lidelser (dvs., skizofreni, obsessiv-kompulsiv lidelse, depression), neurodegenerative lidelser (dvs. Parkinsons sygdom) og hos patienter med læsioner i præ-frontale cortex 5. Mere generelt er disse patienter beskrives som havende underskud i kognitiv fleksibilitet. Analoge underskud er blevet vist i både primater og gnavere Hvis læsioner to den præfrontale cortex er blevet fremkaldt 1,6-8. Disse underskud indikerer en tilstand af kognitiv manglende fleksibilitet eller en nedsat evne til at flytte opmærksomhedsgraden sæt.
En opmærksomhedsgraden sæt dannes, når et emne erfarer, at et regelsæt kan anvendes på komplekse stimuli for at differentiere relevante fra irrelevante signaler. For eksempel i AST, vil dyrene lære at være opmærksom og svare til den relevante cue (dvs. grave medium) og ignorere et irrelevant cue (dvs., lugt), ved at parre en foderbelønning med mediet. Denne forening derefter forstærket i de efterfølgende opgaver, hvor den type grave medium og lugt ændringer, men den parrede association mellem medium og belønning tilbage. Dette forstærkede regel danner en kognitiv sæt. To gange inden for de AST protokol måler aspekter af kognitiv fleksibilitet: vending og den ekstra-dimensionelle skift. Ved vending stadium, de tidligere negative stimuli inden for en dimensionellen (medium i dette eksempel) er nu positiv, hvilket udfordrer dyret til at ignorere de positive stimuli fra den foregående fase. For eksempel, hvis følte grave medium var de positive stimuli i den foregående etape og papir var de negative stimuli, nu det modsatte er tilfældet. Det udfordrer dyrets fleksibilitet i, at den skal opretholde den opmærksomhedskravet sæt (dvs. medium er den relevante dimension), mens ændre reglen lært for stimulus og belønning par i en dimension. Dannelsen af en opmærksomhedsgraden sæt anfægtes ved den ekstra-dimensionelle skift scenen, når det irrelevante dimension (lugt i dette eksempel) bliver den relevante dimension. En perseverative reaktion, som angivet ved en fortsat valg ved hjælp af den tidligere lært regel, enten stadium afspejler et underskud i kognitiv fleksibilitet.
Læsioner undersøgelser i både primater og gnavere har vist specifikke regioner i det præfrontale cortex kan tilskrives evnen til perfOrm særlige faser af AST 1,9. Læsioner til orbitofrontal cortex (OFC), har vist et underområde af den præfrontale cortex (PFC) for at inducere underskud i tilbageførsel læring på AST 8. Derudover læsioner til den mediale præfrontale cortex (MPFC) føre til særlige vanskeligheder i at udføre den ekstra-dimensionelle skift.
Mens talrige undersøgelser ved hjælp af AST er udført på rotter og ikke-menneskelige primater, har relativt få udnyttet AST som et mål for kognitiv funktion hos mus. I betragtning af den lethed af genmanipulation i mus, og det afgørende behov for at måle præfrontale cortex funktion i at studere en række lidelser, tilpasning og validering denne adfærdsmæssige foranstaltning i mus er et vigtigt supplement til forskning i sygdomme forbundet med PFC dysfunktion. Protokollen beskrevet her er en modifikation af proceduren Birrell og Brown 1, der er optimeret til anvendelse i mus og afspejler mange af muse-specic tilpasninger, der tidligere er blevet rapporteret 2,6,10-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Dyr anvendt i denne undersøgelse er mænd C57BL / 6J mus mellem 4 og 6 måneder for at opnå optimale resultater. Musene holdes på en omvendt lyscyklus med henblik på bekvemt at teste dem i den aktive (mørke) fase. Hvis adfærd udføres i et rum adskilt fra huset, mus tilladt mindst 1 time at akklimatisere efter transport til test værelse. Behavioral test udføres under rødt lys minimere forstyrrelser af den normale aktivitet af musene så lidt som muligt, mens det stadig tillader forsøgslederen tilstrækkelig belysning til visuelt at overvåge test session.
BEMÆRK: Alle aspekter af den eksperimentelle procedure beskrevet heri blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, 8. udgave (NRC) og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Texas Health Science Center på San Antonio.
- Fyld keramiske ramekins (ikke-porøs 1.5 "dybde x 2,5" diameter) til indre rand med grave medium (ca. 1 "fra bunden); filter papir runder skåret i halve og tapede til indersiden bagsiden af ramekin (figur 1A)
- Break let sødet tør morgenmadsprodukt (mad belønning) - Honning Nut eller sukker overtrukket sorter, i ca. 20 mg stykker for akklimatisering, træning og testning etaper.
- Få et opmærksomhedsgraden sæt skiftende opgave (AST) kammer (Figur 1B): Akklimatisere toget og teste hver mus i individuelle kamre; anbefaler produktion af mindst 8 kamre.
- Byg en 12 "x 8" x 7 "AST kammer; vægge og starte gate lavet af uigennemsigtig hvid akryl, der er let at rengøre med 70% ethanol. Den guillotine-stil, aftagelig startporten adskiller kammer i et venteområde (5 "x 8") og testområde (7 "x 8").
- Indeholde en klar 5221; x7 "aftagelig partition, der adskiller to sider af testområde jævnt; sender tre ¼ "diameter huller i bunddelen af partition at tillade sniffing adgang afstand 1" fra hinanden, og 1 "fra forsiden af skillevæggen (figur 1C).
2. Procedure Oversigt (figur 2)
- Forud for AST, husmus individuelt og give dem mulighed for at tilpasse sig en omvendt lys cyklus i mindst en uge.
- Akklimatisere, tog og teste hvert dyr i de enkelte test kamre. Tildel hvert kammer til en mus og ren med 70% ethanol efter endt den sidste dag i test. Dette vil minimere stress under afprøvning ved at gøre kammeret lugt ligesom "Hjem-bur" eller "selv".
- Duft til afprøvning potter 2 dage før prøvningen for at lade duften at sprede; mus vil ikke grave i potter, der har en meget stærk lugt. Ved hjælp af en sprøjte med en 25 G nål, tilsæt ca. 0,1 mlæterisk olie til toppen af filtrerpapiret.
3. Håndtering (dage 1-8)
- Håndtag mus starter 8 dage før den første dag i mad begrænsning. Dette vil reducere stress i forbindelse med håndtering under testen.
- Vejes, og optage legemsvægt hver dag i håndtering. Håndtag hver mus 2-3 min per dag.
- Hvis flere eksperimentatorer skal inddrages i at teste et sæt mus, sikre, at hver forsøgslederen deltager i håndteringen proces for at øge kendskabet til eksperimentatorer og reducere stress og angst opleves på øvelse eller ved afprøvning dage.
- Fortsæt håndtering og registrering vægte under hele testen.
4. Fødevarer begrænsning (dage 9-12)
- Fra 4 dage forud for starten på akklimatisering, at placere mus på en diæt opretholde mus på 80-85% af deres gratis fodring kropsvægt. Giv 1 gram af fødevarer per mus per dag. Hvis legemsvægt falder underdet angivne interval giver 2 gram per dag, indtil de vender tilbage til det passende område.
- Placer 2 ramekins på forsiden af hvert hjem bur for at give mus at akklimatisere sig til test potter. Det er de samme pletter, der anvendes til at træne med musen for at grave efter en fødevare belønning.
- Tilsæt 2 gram mad og 1 stykke mad belønning (en halv stykke af korn i hver) i formene hver dag i 4 dage.
- Hvis adfærd skal udføres i et separat rum end den, hvor musene er opstaldet, begyndende på dag 1 i fødebegrænsning, transport mus til testning plads til mindst 1 time per dag før returnering til huset plads til at tillade dem til rådighed til test værelse.
- På den sidste dag af fødevarer begrænsning, før starten af akklimatisering ændre hjembur sengetøj. Buret strøelse ændres ikke igen før efter testen er gennemført for at reducere stress eller angst opleves under træning og test (medmindre det er absolut nødvendigt).
- Vedligeholdmus på mad begrænsning indtil udgangen af test. På dage 13-17, giver mus mad efter akklimatisering, uddannelse, eller afprøvning baseret på et skøn over mængden af mad belønning forbruges (generelt <1 g mad pellet).
5. Akklimatisering (dage 13-14)
- Begyndende 2 dage inden starten på uddannelsen, udføre akklimatisering under den mørke cyklus under rødt lys.
- Spred en lille mængde af beskidte strøelse fra hjemmet bur i kammeret, vil dette reducere stress af at være i et nyt miljø ved at indføre en velkendt "home-bur" eller "selv" lugt til afprøvning kammer (det samme kammer vil være anvendes til en enkelt mus under hele uddannelsen og test).
- Placer en ren ramekin med vand i området venter kammerets; mus tendens til ikke at spise, hvis de ikke har adgang til vand.
- Placer de to ramekins der har været brugt til mad begrænsning i testområdet med en fødevare belønning (~ 20mg korn stykke) i hver.
- Placer musen i området venter; fjerne startgaten og tillade musen til at undersøge kammeret til 1 time.
- Løbende tilføje fødevarer belønninger (~ 20 mg korn stykke) til de tomme ramekins for at tilskynde mus til at udforske testområdet og potterne ofte.
- Kontroller, at musen kan se eksperimentatoren hele akklimatiseringsperiode således at tilstedeværelsen af forsøgslederen er ikke en ekstra stressfaktor under testen.
6. Uddannelse (dag 15)
- Placer musen i området venter.
- Placer de tomme ramekins, som hver indeholder en fødevare belønning (~ 20 mg korn stykke), ind i test-området og løfte startgaten. Tillad mus 3 min at hente begge fødevarer belønninger. Gentag dette trin flere gange.
- Gradvist tilføje savsmuld / mus bur strøelse til potterne i efterfølgende forsøg. Lad musen 3 min for at hente mad belønning fra hver pulje før slutter trial. Når musen har hentet mad belønning fra hver pot, gå videre til næste forsøg. Hvis musen ikke gør forsøg på at grave når maden belønning er delvist dækket, kan hints tilvejebringes (dvs. drys korn støv over område af den mad belønning, gøre en indrykning i savsmuld på fødevareområdet belønning, afdække en del af den foderbelønning).
- Fortsæt med at tilføje savsmuld / sengetøj efter hvert forsøg, indtil maden belønning er helt dækket og musen pålideligt demonstrerer evnen til at grave i en fuld pot at finde fødevarer belønning.
- Hvis en mus ikke pålideligt demonstreret evne til at finde en fødevare belønning i en fuld pot inden 2 timer i starten af uddannelsen, fortsætter til en anden dag med træning. Bevar musen på mad begrænsning og gentage denne procedure den næste dag.
- Hvis musen ikke grave efter en fødevare belønning efter to på hinanden følgende dage, udelukker det fra resten af eksperimentet, og anmærke som en "mislykkedes at grave" i experimental rekord.
7. Test (dage 16-17):
- På dag ét, teste simple diskrimination (SD), forbindelse forskelsbehandling (CD), tilbageførsel (R1), og intra-dimensionelle skift (IDS).
- På dag to, teste intra-dimensionelle skift 2 (IDS2), intra-dimensionelle skift 3 (IDS3), tilbageførsel 2 (R2 ekstraudstyr), ekstra-dimensionelle skift (EDS).
- Binding medier og dufte, som vist i tabel 1.
- På tidspunktet for håndtering på test dag, giver mus en fødevare belønning for at undgå en manglende fokus under test på grund af sult. Fra dette punkt indtil udløbet af de test dag, giver ikke noget mad bortset belønninger for rigtige valg.
- Ved starten af test, med pincet (begrænser spredningen af dufte mellem potter), placere et stykke af den mad belønning i potten, der angiver et korrekt valg. Maden belønning bør være fuldt dækket af medier (se figur 3). For at undgå en duft cue fra den mad belønning, drys korn støv over alle gryder i starten af etapen.
- Placer musen i området venter med startgaten lukket. Placer potter på hver side af testkammeret. Forsøget begynder, når startgaten fjernes, og timeren startes. Tillad hver mus 3 min per forsøg for at foretage et valg. Optag valget (korrekt eller ukorrekt) og tid indtil musen foretaget et valg for hvert forsøg.
BEMÆRK: Et "valg" er angivet med et forsøg på at grave i begge pot. En udgravning registreres kun som et valg, hvis musen har fortrængt medierne og stak sin næse langt nok i det rum, den skaber for at finde fødevarer belønning eller forskudt nok af medierne til at afdække maden belønning. Hvis en mus ikke har foretaget et valg inden for 3 min, er der tale om noget valg (forkert). - Når et valg er foretaget for hver pot, fjerne potten, der ikke blev valgt fra test kammeret. Hvis et korrekt valg blev foretaget, lade musen til at afslutte mad belønning før placere musen tilbage iområdet venter. Hvis et forkert valg er foretaget, lade musen til at udforske puljen for at vise, at der ikke er mad belønning for dette valg før han vendte tilbage musen til ventesalen.
- Ved afslutningen af hvert forsøg, skal du placere musen tilbage i området venter og erstatte startgaten.
- Sørg for, at musen opfylder kriteriet om 8 korrekte forsøg efter hinanden for at gå videre til den næste fase af AST. Hvis en mus ikke opnår 8 rigtige valg efter hinanden inden for 50 forsøg, det mislykkes at scenen og kan ikke gå videre for at fuldføre testen. 6 på hinanden følgende ingen valgmuligheder (3 min uden et valg) er en fiasko for at deltage og forbyder musen fra går videre til næste fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den typiske afhængig foranstaltning i denne test er antallet af forsøg pr scenen for at opfylde kriterium (eller 8 rigtige træk valg). Figur 4A viser det gennemsnitlige antal forsøg for at opfylde kriteriet på hvert trin i ubehandlet C57BL / 6J hjælp af AST. Som mus udgør en opmærksomhedsgraden sæt på det pågældende cue dimension (lugt eller medier), vil ydeevne forbedres, som indikeret ved en reduktion i forsøg for at opfylde kriteriet i successive intradimensional skift, og vendingen stadier og den extradimensional skift vil kræve yderligere forsøg for at opfylde kriterium. Det er vigtigt at opveje det antal dyr, der starter på hver af de to relevante dimensioner (dvs. medier eller lugt), som vi har observeret en vis forskel på den simple diskrimination scenen afspejles i et øget antal forsøg til kriterium hvis lugt er det relevant cue (figur 4B). Hvis forsøgene at nå kriterium på SD stadium er signifikant forskellig mellem the to relevante cue dimensioner (dvs. bedre ydeevne, når medier er relevant som i figur 4B), effektivitetsdata for hver mus under efterfølgende etaper kan normaliseres med sine præstationer i den simple diskrimination scenen. Som illustreret i figur 4C, denne normalisering trin reducerer variation forbundet med at lære oprindeligt relevant cue og forbedrer visualisering af forbedret ydeevne på de efterfølgende IDS etaper. Selv gruppestørrelser på ~ 20 mus vil være tilstrækkelig til at tillade analyse af rådata uden normalisering. Det er vigtigt, at en betydelig stigning i forsøgene opfylder kriteriet i extradimentional skift i forhold til de tidligere intradimentional skift indikerer en vigtig kontrolforanstaltning af testen gyldighed (figur 4D & 4E). Forud for ED skift scenen, lærer mus at være opmærksom på et enkelt relevant cue dimension (lugt eller medier) med henblik på at lokalisere belønning. Overgangen til en new relevant cue dimension, der tidligere var irrelevant, bør kræve flere forsøg for at nå kriterium, hvilket resulterer i et ID / ED skift. Interessant analyse af ID / ED skift inden for de rå data viste en betydelig stigning i forsøgene at nå kriterium mellem IDS2 og ED (figur 4D), og tendens til en stigning mellem IDS3 og ED (data ikke vist, p <0,1) og en stigning mellem middelværdien forsøg at nå kriteriet IDS2 og IDS3 forhold til ED (data ikke vist). Interessant, en betydelig ID / ED skift var tydelig mellem både IDS2 og IDS3 forhold til ED, når oplysningerne blev normaliseret til ydeevne på SD trin (Figur 4E).
Det forventes, at ca. 70-80% af kontrol mus vil fuldføre hele opgaven (20-30% dropper ud sats). Alternative afhængige foranstaltninger omfatter gennemsnitlige ventetid til at foretage et valg, som målt på hvert trin i opgaven (selv om vi har fundet dette er meget varierende mellem mus),samlede antal fejl og antallet af "set-loss" fejl ved tilbageførslen og ekstra-dimensionelle skift etaper som defineret af Lapiz-Bluhm et al. 14 som det antal gange et forkert valg var foretaget efter tre eller flere i træk rigtige valg. Et øget antal "set-loss" fejl kan indikere en perseverative adfærd. Derudover mus fuldføre typisk hver fase af test i mindre end 30 min (figur 5), og varigheden af tid brugt på hvert trin er en funktion af forsøg at nå kriterium.
I en tidligere undersøgelse med et lignende paradigme som beskrevet her, neurotoksiske læsioner i OFC eller mPFC i mus viste sig at forringe ydeevnen på tilbageførslen og ekstra-dimensionelle skift etaper henholdsvis validering af brugen af denne test til at bestemme funktionelle underskud på samme områder som rotter og ikke-menneskelig primat studies11. Mens rækkefølgen af opgaverne i den ovennævnte undersøgelse vVædderen lidt, der er vist her, forventes det, at læsioner eller underskud i OFC og mPFC også vil resultere i nedsat ydelse på R1 og EDS, som afspejles i en stigning i antallet af forsøg til kriterium på de stadier. .
| Stage | Relevant | Eksempler | Relevant | Eksempler | ||
| Simple Diskrimination (SD) | Medium | Filt (+) | Papir (-) | Lugt | Muskatnød (+) | Rosemary (-) |
| Forbindelse Diskrimination (CD) | Medium | Filt (+) / Muskatnød | Papir (-) / Rosemary | Lugt | Muskatnød (+) / Filt | Rosemary (-) / Papir |
| Filt (+) / Rosmarin | Papir (-) / Nutmeg | Muskatnød (+) / Papir | Rosemary (-) / Filt | |||
| Tilbageførsel 1 (R1) | Medium | Papir (+) / Rosemary | Filt (-) / Muskatnød | Lugt | Rosemary (+) / Papir | Muskatnød (-) / Filt |
| Papir (+) / Muskatnød | Filt (-) / Rosemary | Rosemary (+) / Filt | Muskatnød (-) / Papir | |||
| Intradimensional Shift (IDS) | Medium | Pomponer | Pailletter (-) / Clove | Lugt </ Td> | Cinnamon (+) / Pompoms | Fed (-) / Pailletter |
| (+) / Cinnamon | ||||||
| Pompoms (+) / Clove | Pailletter (-) / Kanel | Kanel (+) / Pailletter | Fed (-) / Pompoms | |||
| IDS2 | Medium | Pipecleaners | Googly øjne (-) / Ginger | Lugt | Red timian (+) / Pipecleaners | Ginger (-) / googly øjne |
| (+) / Rød timian | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ginger | Googly øjne (-) / Rød timian | Red timian (+) / googly øjne | Ginger (-) | |||
| IDS3 | Medium | Ribbon (+) / Vanilla | Metalliske strimler (-) / Lemon | Lugt | Vanilla (+) / Ribbon | Citron (-) / Metallic strips |
| Ribbon (+) / Lemon | Metalliske strimler (-) / Vanilla | Vanilla (+) / Metallic strips | Citron (-) / Ribbon | |||
| R2 | Medium | Metalliske strimler (+) / Vanilla | Ribbon (-) / Lemon | Lugt | Citron (+) / Ribbon | Vanilla (-) / Metallic Strips |
| Metalliske strimler (+) / Lemon | Ribbon (-) / Vanilla | Citron (+) / Metal fentlige strimler | Vanilla (-) / Ribbon | |||
| Extradimensional Shift (EDS) | Lugt | Citronella (+) / Raffia | Anis (-) / Skum | Medium | Raffia (+) / Citronella | Skum (-) / Anis |
| Citronella (+) / Foam | Anis (-) / Raffia | Raffia (+) / Anis | Skum (-) / Citronella | |||
Tabel 1. Eksempel kombinationer af lugt og grave medium. De dufte og grave medier i disse kombinationer er blevet valideret i denne undersøgelse. Repræsentative resultater opnået ved anvendelse af disse specifikke kombinationer er vist i figur 2.
hres.jpg "/>
Figur 1. AST testkammeret. (A) Picture og dimensioner ramekin og eksempel filterpapir placering. (B) et billede af AST testkammeret tilpasset til mus og (C) en tredimensionel diagram af testkammeret illustrerer placering af huller i skillevæggen.
Figur 2. Udgravning medium. Eksempler på grave medium par i denne protokol så detaljeret i listen materialer (II.-XI.). Pots er fyldt omtrent til den indre rand med grave medium.
Figur 3. Tidslinje til test.
Figur 4. C57BI / 6J præstation i AST. (A) Gennemsnitligt antal forsøg for at opfylde kriteriet i AST for mandlige C57BL / 6J mus. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 22 mus / gruppe), p = 0,013 for vigtigste effekt af scenen. (B) Gennemsnitligt antal forsøg for at nå kriterium på SD scenen for forskellige indledende relevante cue dimensioner. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 22 mus / gruppe), * p = 0,01. (C) Normaliserede data repræsenteret som en procentdel af hver mus individuelle præstation ved SD fase. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 22 mus / gruppe), p = 0,06 for vigtigste effekt af scenen. (D) ID / ED skift i forsøg for at nå kriterium mellem IDS2 og ED. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 22 mus / gruppe), * p = 0,03. (E) ID / ED skift i normaliserede data mellem IDS3 og ED. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 22 mus / gruppe), * p = 0,012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Underskud i kognitiv fleksibilitet medieret af PFC udgør en betydelig invaliditet forbundet med en række neurologiske og neuropsykiatriske lidelser, og kan have en stor indvirkning på resultaterne og livskvaliteten for personer, der lider af disse sygdomme. Optimering af AST til brug i mus er afgørende for at undersøge genetiske fundament i sygdomme koblet til præfrontale kortikale medieret kognitiv dysfunktion. Vi har fundet, at den ovenfor beskrevne fremgangsmåde er en pålidelig måling af en specifik kognitiv underskud, kognitiv fleksibilitet og nærmest de opnåede resultater ved anvendelse af denne opgave i rotter og ikke-humane primater. Den beskrevne metode er resultatet af en omfattende undersøgelse af tidligere beskrevne protokoller hos rotter og mus samt rådgivning og vejledning af eksperter på vores institution.
Tidligere rapporter anvender lignende opgaver i mus har vist tilpasningsevne sådan en adfærdsmæssig foranstaltning, om end medflere forbehold 2,6,11. Colacicco et al. Begrænset antallet af testede om dagen til 2 forskelsbehandling, som spreder prøvning i en fire dages periode 11. Dette omfattede gentagelser af tidligere lærte stimuli par på hinanden følgende test dage. Mens effektiv, om at udvikle den protokol, der præsenteres her er at minimere varigheden af testperioden og maksimere effektiviteten. Her begrænser vi test til en to dages periode og fjerne gentagelser af tidligere lært stimuli par. Tidligere forskere har bemærket, at mus kræver overtræning at danne en opmærksomhedsgraden sæt og udviser en lille "vindue af testbarhed", hvor de vil opretholde effortful reagere. Vores protokol indebærer også beskeden overtræning på intradimensional skift inden den oprindeligt relevant cue dimension. Især når de evaluerer de normaliserede data i figur 4C, fremgår det, at afprøvet i vores protokol mus kan udvise en mere udtalt underskud During den anden intradimensional vending (i forhold til det foregående trin). Denne observation er i overensstemmelse med begrebet overtræning for at sikre dannelse af en opmærksomhedsgraden sæt, som mus også udviste et ID / ED skift. En mulighed, hvorfor mus opretholde effortful resultater i vores protokol (figur 5), hvilket indebærer en gennemsnitlig længde session af 2 timer, kan skyldes anvendelse af en omvendt lyscyklus. Vi testede adfærd i en isoleret og dedikeret test værelse under røde lysforhold i de første fire timer af mørke (vågen) cyklus. Imidlertid ville systematisk test uden for denne metode manuskript være forpligtet til at afgøre, hvad faktorer bidrager til varigheden, hvor mus fortsat vil udføre AST, og hvis underskud i olfaktoriske diskrimination er mistanke, kan prescreening være berettiget inden prøvningen som suppleant lugtfri metoder er blevet rapporteret.
Derudover underden indledende metodeudvikling, opdagede vi, at unge voksne mus (8-12 uger gamle) udført med større variation at lidt ældre 4-6 måneder gamle mus. Vi spekulere at protokol maden begrænsning påvirker voksende mus anderledes end mere modne mus, og mens, i en klassisk nervesystemets udvikling forstand er musehjernen anses fuldt udviklet med 6 uger er det muligt, at overgangen fra teenager til voksen modenhed og tidlige voksenalder synaptisk remodellering i det præfrontale cortex forvirre AST præstation i yngre mus. Forbliver dog disse fascinerende spørgsmål, der skal udforskes.
Andre variationer af AST protokoller i mus omfatter "gratis" forsøg, hvilket betyder en udpeget antal forsøg (typisk 4) i begyndelsen af hver etape er ikke scoret, og dyret får lov til at udforske begge potter indtil belønningen hentes. Protokollen beskrevet her omfatter ikke "gratis" forsøg. Desuden har vi indstille KRAVNTS opfyldte kriterium strengere (8 fortløbende korrekte forsøg kriterium i stedet for den tidligere beskrevne 8/10 forsøg for at opfylde kriteriet), og har fundet, at det er en effektiv indikator for, om dyret har virkelig lært reglen. Garner et al. viste, at en periode med overtræning efter en IDS (dvs. præsentation af de tidligere relevante stimuli i yderligere 50 forsøg) steg betydeligt forsøgene kriterium i EDS 2. Her vi medtage flere intra-dimensionelle skift, i et forsøg på at "overtrain", og sikre dannelsen af en opmærksomhedsgraden sæt på det pågældende dimension, efter aftale med Bissonette et al. 6. Derudover Garner et al. begrænsede test sessioner til ca. 1 time (eller når musen ikke længere reagerede) 2, mens vi har fundet, at C57BL6 / J-mus tilstrækkeligt og pålideligt fremskridt gennem alle fire faser præsenteret for dem hver dag inden for cirka en 2 hr periode (til styringmus). Selv bør overvejes potentielle forskelle i motorik mellem forsøgsgrupper ved fortolkningen ydeevne. Vores procedure begrænser tid og arbejdskraft investering til 17 dage for hvert dyr fra starten af håndtering gennem færdiggørelse af test. Det anbefales, at en individuel eksperimentator begrænse antallet af testede i en enkelt dag mus til ikke mere end 2 (dette kan modificeres baseret på individuel eksperimentator evne og erfaring), hvilket giver en enkelt eksperimentatoren mulighed for at gennemføre test på mindst 6 mus pr uge. Hvis motorik mildt er nedsat, kan længden af hvert forsøg øges, da korrekt at svare, ikke hastighed for at reagere, er nøglen afhængige variabel.
Visual diskrimination paradigmer svarende til dem, der er blevet anvendt til at vurdere kognitive ydeevne i ikke-humane primater er for nylig blevet tilpasset til anvendelse i gnavere og kan anvendes som et alternativ til lugt og medium discrimination opgaver beskrevet her. Denne fremgangsmåde kan være nødvendig, hvis betydelige forskelle i olfaktoriske diskrimination er til stede mellem eksperimentelle grupper af mus. Brigman et al. Har vist, at mus let skelne sammensatte visuelle stimuli i et ID og ED skift paradigme 15. Selv om denne automatiske metode bedre viser ansat til at studere præfrontale cortex dysfunktion hos mennesker og ikke-menneskelige primater test, at udgifterne til de operantkamre og touchscreens nødvendige udføre denne automatiserede test i mus kan være uoverkommelige.
Det anbefales, at adfærden udføres så ensartet som muligt for hver mus, dvs. tilvænning, træning og test skal udføres på samme tidspunkt af dagen for hvert dyr. Endvidere bør adfærd rummet forbliver uændrede under hele forsøget, som gør brugen af delte / community plads problematisk på grund af ukontrollabel trafikstrøm, lugt introduktion etc. Hvis dyrene skal transporteresfra et hus plads til en ekstern adfærd rum (som det er tilfældet her), bør den samme rute tages hver gang. Den adfærd rummet skal være i et område, hvor forsøgslederen og dyrene vil ikke blive forstyrret under testproceduren. Hvis flere eksperimentatorer udfører opgaven i samme rum, indrejse og udrejse fra rummet skal være så små som muligt for at undgå høje lyde eller forstyrrelser, som kan øge stress eller angst af dyret under test. Desuden bør eksperimentatorer være forsigtig med at fjerne og udskifte startgaten samt potter ind i og ud af kammeret for at skabe så lidt støj og forstyrrelser som muligt. Forsøg udført på rotter har vist, at AST ydelse kan brydes ved forskellige stressfaktorer.
Scenting af potterne skal udføres hver uge og på samme dag hver uge, mindst 2 dage før den første test dag. Det anbefales, at potterne er duftende i et godt aftrækilated område uden for det område, hvor prøven skal udføres (f.eks særskilt laboratorium, entre, emhætte). Dette vil bidrage til at undgå krydskontaminering af dufte og vil undgå at forvirre musene med dufte, der ikke er en del af testen. Derudover før og under test, stærke dufte, der kan distrahere dyret fra diskrimination (dvs. forbrug af tyggegummi eller kaffe umiddelbart før testning, stærk parfume / deodorant, etc.) bør undgås i den førnævnte grund. Skulle eksperimentatorer ønsker at bruge alternative grave medium end det, der er beskrevet i denne protokol, anbefales det, at mediet have samme tæthed og vægt til at her beskrevet (overdreven vægt / densitet gør det svært for musen til at grave tilstrækkeligt). For eksempel fandt vi, at små plastperler var ikke egnet, fordi de var vanskeligt for musene at skubbe til side. Derudover alle medier med en meget stærk duft (f.eks., Gummilister og nogle plastic materiale) er ikke egnet, da det kan påvirke evnen til at opdage dufte, der testes.
Uddannelse og test af en individuel mus skal udføres af en enkelt experimenter, kan dog akklimatisering ske ved enhver forsøgslederen, så længe de har deltaget i håndtering. Alle potter, der skal anvendes i de fire trin udføres hver dag bør være inden for rækkevidde for at begrænse den tid, dyret er i området venter mellem faser. Dette vil bidrage til at bevare opmærksomhed musen på hver opgave. Desuden når test er begyndt, er det vigtigt ikke at stoppe, før afslutningen af de opgaver, for den dag af test (dvs., skal alle 4 faser for hver test dag være afsluttet efter hinanden).
Sammenfattende protokollen beskrevet her giver detaljerede metodologiske instruktioner til effektiv udnyttelse af AST at måle præfrontale cortical-afhængig kognitiv funktion hos mus, herunder beskrivelsedataanalyse og potentielle forbehold. En række mus AST metoder er rapporteret i den primære litteratur, hver med sin egen særlige proceduremæssige detaljer. Den unikke kobling af både tekstbaserede og visuel information vil være særligt nyttigt for forskere forsøger at indarbejde denne kraftfulde adfærdsmæssige analyse i deres videnskabelige repertoire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud R01-MH090127, P30-MH089868 fra National Institute of Mental Health og tildeling nummer UL1TR001120 fra National Center for Fremme Translationelle Sciences. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIMH eller NCATS. Derudover vil vi gerne takker Dr. David Morilak for hans værdifulde ekspertise i at lede metodeudvikling tidligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
