Summary
Het doel van dit protocol is om een gedrags-test uit te voeren, zoals de aandachtsproblemen set verschuiven taak (AST) aan prefrontale cortex-gemedieerde cognitieve flexibiliteit bij muizen te beoordelen.
Introduction
De aandachtsproblemen set verschuiven taak (AST) werd ontwikkeld als een maatregel van aandacht en cognitieve flexibiliteit bij ratten meer dan tien jaar geleden 1,2. AST is gemodelleerd naar de intradimensional / extradimensional component van de Cambridge neuropsychologische Automated Accu (Cantab) wordt gebruikt om cognitieve disfunctie bij mensen en niet-humane primaten 3,4 identificeren. Terwijl de mogelijkheid om eenvoudige regels leren blijft intact, tekorten in het leren van een reactie wanneer de regels veranderd worden gevonden bij patiënten met diverse neuropsychiatrische stoornissen (bijvoorbeeld, schizofrenie, obsessieve compulsieve stoornis, depressie), neurodegeneratieve aandoeningen wijzigen (dwz ziekte van Parkinson) en bij patiënten met laesies aan de prefrontale cortex 5. Meer in het algemeen zijn deze patiënten beschreven met tekorten in cognitieve flexibiliteit. Analoge tekorten aangetoond bij zowel niet-humane primaten en knaagdieren wanneer laesies to de prefrontale cortex zijn geïnduceerd 1,6-8. Deze tekorten wijzen op een toestand van cognitieve inflexibiliteit of een verminderd vermogen om aandachtsproblemen set verschuiven.
Een aandachtsproblemen set wordt gevormd wanneer een onderwerp leert dat een set van regels kunnen worden toegepast op complexe stimuli om relevant te onderscheiden van irrelevante cues. Bijvoorbeeld, in de AST zullen dieren leren letten en reageren op de desbetreffende cue (dwz graven gemiddeld) en negeert een irrelevante cue (dwz geur), door het koppelen van een voedselbeloning met het medium. Deze vereniging wordt dan versterkt in de volgende taken waar de soort graven medium en geur verandert, maar de gepaarde associatie tussen medium en beloning blijft. Dit versterkt regel vormt een cognitieve set. Twee etappes in de AST-protocol maatregel aspecten van cognitieve flexibiliteit: omkering en de extra-dimensionale verschuiving. Bij de omkering stadium, de eerder negatieve prikkels binnen één Dimension (gemiddeld in dit voorbeeld) is nu positief dat het dier betwist de positieve prikkels uit de vorige fase negeren. Als bijvoorbeeld vilt graven medium was positief stimuli in de voorgaande fase en papier was de negatieve stimuli, nu het omgekeerde waar. Dit daagt de flexibiliteit van het dier in dat het de aandachtsprocessen set moet doen (dwz, medium is de relevante dimensie), terwijl het veranderen van de regel geleerd voor stimulans en beloning pair binnen een dimensie. De vorming van een aandachtsbias set wordt uitgedaagd op de extra-dimensionale verschuiving stadium, wanneer de irrelevante dimensie (geur in dit voorbeeld) wordt de betreffende dimensie. Een perseverative respons, zoals aangegeven door een voortdurende keuze met de eerder geleerde regel aan beide stadium weerspiegelt een tekort in cognitieve flexibiliteit.
Laesie studies in zowel niet-humane primaten en knaagdieren hebben aangetoond specifieke gebieden van de prefrontale cortex kan worden toegeschreven aan het vermogen om perfORM bepaalde stadia van de AST 1,9. Letsels aan de orbitofrontale cortex (OFC), een subgebied van de prefrontale cortex (PFC), is aangetoond dat tekorten omkering leren op de AST 8 induceren. Bovendien, letsels aan de mediale prefrontale cortex (MPFC) leiden tot specifieke problemen bij het uitvoeren van de extra-dimensionale verschuiving.
Terwijl talrijke studies op de AST werden uitgevoerd bij ratten en niet-menselijke primaten, hebben betrekkelijk weinig AST gebruikt als maat voor cognitieve functie bij muizen. Gezien het gemak van genetische manipulatie bij muizen, en de kritische noodzaak om prefrontale cortex functie te meten in het bestuderen van diverse aandoeningen, aanpassen en valideren van deze gedragsproblemen maatregel bij muizen is een belangrijke aanvulling op het onderzoek naar ziekten die samenhangen met PFC disfunctie. De hier beschreven protocol is een modificatie van de procedure Birrell en Brown 1 die is geoptimaliseerd voor toepassing in muizen en weerspiegelt veel van de muis specific aanpassingen die eerder zijn gemeld 2,6,10-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: dieren die in deze studie zijn mannelijke C57BL / 6J muizen van 4 tot 6 maanden voor optimale resultaten. Muizen worden gehouden op een omgekeerde lichtcyclus om ze gemakkelijk te testen tijdens de actieve (donkere) fase. Wanneer gedrag wordt uitgevoerd in een ruimte gescheiden behuizing worden muizen over ten minste 1 uur op volgende transport wennen aan de testkamer. Behavioral tests worden uitgevoerd onder rood licht minimaliseren verstoring van de normale activiteit van de muizen zo min mogelijk terwijl nog steeds de experimentator voldoende verlichting aan de testsessie visueel controleren.
OPMERKING: Alle aspecten van de hierin beschreven experimentele procedure werden uitgevoerd in overeenstemming uitgevoerd met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, 8e editie (NRC) en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio.
- Vul keramische schaaltjes (niet-poreuze; 1,5 "diepte x 2,5 diameter"), om binnenrand met het graven medium (ongeveer 1 "van beneden); filterpapier rondes in tweeën gesneden en geplakt is aan binnenkant van de achterflap van schaaltje (figuur 1A)
- Breken licht zoete droge ontbijtgranen (voedsel beloning) - Honey Nut of suiker gecoate rassen, in ongeveer 20 mg stukken voor acclimatisatie, training en testen fasen.
- Maak een aandachtsbias set verschuiven taak (AST) kamer (Figuur 1B): acclimatiseren trein en testen van elke muis in individuele kamers; aanbevelen productie van ten minste 8 kamers.
- Bouw een 12 "x 8" x 7 "AST kamer; muren en start poort gemaakt van ondoorzichtig wit acryl, dat is eenvoudig te reinigen met 70% ethanol. De guillotine-stijl, verwijderbare starthek scheidt kamer in een wachtruimte (5 "x 8") en testen (7 "x 8").
- Een duidelijke 5221; x7 "verwijderbare partitie die twee kanten van testgebied gelijkmatig scheidt; drie gesneden ¼ "diameter gaten in bodemdeel van partitie snuiven toegang op afstand 1 toestaan" apart en 1 "van de voorzijde van de partitie (figuur 1C).
2. Procedure Overzicht (figuur 2)
- Voorafgaand aan AST, huismuizen individueel en hen in staat stellen zich aan te passen aan een omgekeerde licht cyclus gedurende ten minste een week.
- Acclimatiseren, trein en testen van elk dier in individuele testkamers. Wijs elke kamer een muis en schoon met 70% ethanol na het beëindigen van de laatste dag van het testen. Dit zal stress te minimaliseren tijdens het testen door het maken van de kamer ruiken als "thuis-kooi" of "zelf".
- Geur proeven potten 2 dagen voorafgaand aan het testen om de geur te verdrijven; muizen zullen niet graven in potten die een zeer sterke geur hebben. Met behulp van een spuit met een 25 G naald, voeg ongeveer 0,1 mlessentiële olie naar de top van het filterpapier.
3. Behandeling (Dagen 1-8)
- Handvat muizen vanaf 8 dagen voor de eerste dag van voedselrestrictie. Dit zal stress in verband met de behandeling tijdens het testen te verminderen.
- Weeg en opnemen lichaamsgewicht elke dag van de behandeling. Behandel elke muis 2-3 minuten per dag.
- Als er meerdere onderzoekers moeten worden betrokken bij het testen van een reeks van muizen, ervoor te zorgen dat elke onderzoeker participeert in het verwerkingsproces om bekendheid te verhogen met onderzoekers en het verminderen van stress en angst ervaren op training of testen dagen.
- Doorgaan behandeling en opname gewichten gedurende de duur van de test.
4. beperking Eten (Dagen 9-12)
- Beginnend 4 dagen voor de start van acclimatisering, plaats muizen op een dieet muizen handhaven op 80-85% van hun voedingssysteem lichaamsgewicht. Geef 1 gram voedsel per muis per dag. Als het lichaamsgewicht daalthet opgegeven bereik te geven 2 gram per dag, totdat ze terugkeren naar het juiste bereik.
- Plaats 2 schaaltjes aan de voorzijde van elke kooi zodat muizen te acclimatiseren aan het testen potten. Dit zijn dezelfde plekken gebruikt om de muis te trainen om te graven voor een voedsel beloning.
- Voeg 2 gram voedsel en 1 stuk voedselbeloning (half stuk graan in elk) in de schaaltjes per dag gedurende 4 dagen.
- Als gedrag wordt uitgevoerd in een aparte ruimte dan die waar de muizen ondergebracht, vanaf dag 1 van voedselrestrictie, transport muizen de testkamer tenminste 1 uur per dag voor terugkeer naar de behuizing kamer om ze wennen aan de testkamer.
- Op de laatste dag van voedsel beperking, voor de start van acclimatisering, veranderen hun kooi beddengoed. De kooi beddengoed zal niet meer worden gewijzigd nadat het testen is voltooid om stress of angst ervaren te verminderen tijdens de training en testen (tenzij het absoluut noodzakelijk).
- Onderhoudenmuizen op voedsel beperking tot het einde van het testen. Op dagen 13-17, geef muizen voedsel na acclimatisering, training, of het testen op basis van een schatting van de hoeveelheid voedsel beloning verbruikt (meestal <1 g van voedsel pellet).
5. Acclimatisering (Dagen 13-14)
- Beginnend 2 dagen voor aanvang van de opleiding, uit te voeren acclimatisatie tijdens de donkere cyclus onder rood licht.
- Smeer een kleine hoeveelheid vuil strooisel uit de kooi in de kamer, zal dit de stress van het zijn in een nieuwe omgeving te verminderen door de invoering van een vertrouwde "home-kooi" of "zelf" ruiken aan de testkamer (dezelfde kamer zal zijn gebruikt voor een enkele muis voor de duur van de opleiding en het testen).
- Plaats een schoon schaaltje met water in de wachtruimte van de kamer; muizen hebben de neiging om niet te eten als ze geen toegang tot water hebben.
- Plaats de twee schaaltjes die zijn gebruikt voor voedselrestrictie in proeven met een voedselbeloning (~ 20mg stuk graan) in elk.
- Plaats de muis in de wachtruimte; verwijder de start hek en laat de muis om de kamer te verkennen gedurende 1 uur.
- Continu Voedselbeloningen (~ 20 mg stuk graan) om de lege schaaltjes toe te voegen om de muizen te moedigen de testruimte en potten regelmatig onderzoeken.
- Controleer of de muis de experimentator kan zien gedurende de acclimatiseringsperiode zodat de aanwezigheid van de experimentator geen extra stressor tijdens het testen.
6. Training (Dag 15)
- Plaats de muis in de wachtruimte.
- Plaats de lege schaaltjes, elk met een voedsel beloning (~ 20 mg stuk graan), in de testruimte en til de start gate. Laat de muis 3 min voor zowel voedsel beloningen te halen. Herhaal deze stap meerdere malen.
- Voeg geleidelijk zaagsel / muis kooi beddengoed om de potten in de daaropvolgende studies. Laat de muis 3 min om het voedsel beloning van elke pot te halen voor het beëindigen van de trial. Zodra de muis het voedsel beloning heeft opgehaald uit elke pot, ga dan naar de volgende proef. Als de muis niet pogingen te doen bij het graven van zodra het eten beloning gedeeltelijk overdekt is, kan hints worden verstrekt (dwz, strooi ontbijtgranen stof op het gebied van het voedsel beloning, maak een inspringing in het zaagsel op gebied van voedsel beloning, bloot te leggen deel van de voedselbeloning).
- Doorgaan zaagsel / beddengoed voegen na elke proef tot het eten beloning volledig bedekt is en de muis toont het vermogen om te graven in een volle pot aan de voedselbeloning vinden betrouwbaar.
- Als een muis is niet betrouwbaar gebleken de mogelijkheid om een levensmiddel beloning in een volle pot te vinden binnen 2 uur na de start van de opleiding, blijven een tweede dag van de opleiding. Handhaving van de muis op voedsel beperking en herhaal deze procedure de volgende dag.
- Als de muis niet graven een voedselbeloning na twee opeenvolgende dagen, uitsluiten van de rest van het experiment en annoteren als "niet graven" in de experimental record.
7. Testen (Dagen 16-17):
- Op dag één, testen eenvoudige discriminatie (SD), discriminatie verbinding (CD), omkering (R1), en intra-dimensionale verschuiving (IDS).
- Op dag twee, test de intra-dimensionale verschuiving 2 (IDS2), intra-dimensionale verschuiving 3 (IDS3), omkering 2 (R2; optioneel), extra-dimensionale verschuiving (EDS).
- Paar media en geuren zoals getoond in tabel 1.
- Op het moment van de behandeling op het testen van de dag, geef muizen één voedsel beloning voor een gebrek aan focus te vermijden tijdens het testen als gevolg van de honger. Vanaf dit punt tot aan het einde van de testdag, geven geen voedsel behalve beloningen voor de juiste keuzes.
- Begin tests van pincet (beperkt de verspreiding van geuren tussen potten), plaats een stuk van het levensmiddel beloning in de pot die een juiste keuze aangeeft. Het eten beloning moet volledig worden gedekt door de media (zie figuur 3). Om een geur cue uit het voedsel beloning te voorkomen, strooi ontbijtgranen stof oVer van alle potten bij de start van de etappe.
- Plaats de muis in de wachtruimte met de start poort gesloten. Plaats de potten aan weerszijden van de testkamer. Het proces begint wanneer de startplaats verwijderd en de timer wordt gestart. Laat elke muis 3 min per proef om een keuze te maken. Noteer de keuze (juist of onjuist) en de tijd totdat de muis een keuze gemaakt voor elk onderzoek.
OPMERKING: Een "keuze" wordt aangegeven door een poging te graven in beide pot. Een opgraving wordt alleen opgenomen als een keuze als de muis de media heeft verplaatst en stak zijn neus ver genoeg in de ruimte creëert om het voedsel beloning of verplaatst genoeg van de media om het voedsel te belonen ontdekken vinden. Als een muis een keuze binnen 3 minuten niet heeft gemaakt, deze wordt opgenomen als er geen keuze (verkeerd). - Zodra een keuze is gemaakt voor een van beide pot, verwijder de pot die niet werd gekozen uit de testkamer. Als een correcte keuze is gemaakt, kan de muis om het voedsel te belonen afmaken voordat het plaatsen van de muis terug inde wachtruimte. Als er een verkeerde keuze is gemaakt, kan de muis om de pot te verkennen om te laten zien dat er geen voedsel beloning voor die keuze alvorens terug te keren met de muis naar de wachtruimte.
- Aan het einde van elke test, plaats de muis terug in de wachtruimte en vervang de startplaats.
- Zorg ervoor dat de muis voldoet aan het criterium van 8 correcte proeven achtereenvolgens door te gaan naar de volgende fase van AST. Als een muis niet correct 8 keuzes achtereenvolgens binnen 50 proeven verkrijgen, mislukt dat stadium en niet kan bewegen op de proef te voltooien. 6 opeenvolgende geen keuzes (3 min zonder keuze) is een mislukking om deel te nemen en verbiedt de muis van de overgang naar de volgende fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De typische afhankelijke maatregel in deze test is het aantal proeven per podium om criterium (of 8 correcte opeenvolgende keuzes) te voldoen. Figuur 4A toont het gemiddelde aantal proeven te voldoen aan het criterium in elke fase van onbehandelde C57BL / 6J met behulp van de AST. Als muizen vormen een aandachtsbias set op de relevante cue dimensie (geur of media), zal de prestaties te verbeteren, zoals aangegeven door een vermindering van de proeven te voldoen aan het criterium in opeenvolgende intradimensional verschuivingen, en de terugboeking etappes en de extradimensional verschuiving zal bijkomende proeven nodig om te voldoen aan criterium. Het is belangrijk om het aantal dieren die beginnen op elk van de twee relevante dimensies (bijv media of geur) en we een verschil in een groter aantal proeven waargenomen op de eenvoudige stadium discriminatie gereflecteerd criterium als geur relevante tegenwicht cue (Figuur 4B). Als de proeven om criterium bereiken op de SD-stadium zijn significant verschillend tussen the twee relevante cue afmetingen (dwz betere prestaties wanneer media relevant als in figuur 4B), prestatiegegevens voor elke muis gedurende de volgende fasen kan worden om zijn prestaties genormaliseerd tijdens de eenvoudige etappe discriminatie. Zoals geïllustreerd in figuur 4C, normalisering stap vermindert de onzekerheid aangaande leren de oorspronkelijk desbetreffende cue en verbetert visualisatie van verbeterde prestaties op het volgende IDS fasen. Hoewel groepsgrootte van ~ 20 muizen voldoende analyses van ruwe data mogelijk zonder normalisering wordt. Belangrijk is een aanzienlijke verhoging van de proeven criterium voldoen tijdens de extradimentional verschuiving ten opzichte van de vorige intradimentional verschuift geeft een belangrijke controlemaatregel van de test geldig (figuur 4D en 4E). Vóór de ED verschuiving stadium muizen leren om aandacht te besteden aan één relevante cue dimensie (geur of media) om de beloning te lokaliseren. De overstap naar een new relevant cue dimensie die voorheen irrelevant zou meer proeven vereisen criterium te bereiken, waardoor een ID / ED shift. Interessant analyse van de ID / ED verschuiving binnen de onbewerkte gegevens bleek een aanzienlijke toename van de proeven criterium bereiken tussen IDS2 en ED (figuur 4D), en de trend naar een toename tussen IDS3 en ED (data niet getoond, p <0,1) en een toename van de gemiddelde proeven criterium bereiken van IDS2 en IDS3 vergelijking ED (gegevens niet getoond). Interessant is dat een belangrijke ID / ED verschuiving zichtbaar tussen beide IDS2 en IDS3 vergelijking met ED wanneer de gegevens werden genormaliseerd om de prestaties op de SD-fase (Figuur 4E).
De verwachting is dat ongeveer 70-80% van de controle muizen de volledige taak (20-30% drop-out rate) zal voltooien. Alternatieve afhankelijke maatregelen omvatten gemiddelde latency om een keuze te maken, zoals gemeten in elke fase van de taak (hoewel we hebben gevonden dit te zeer variabel tussen muizen zijn),totaal aantal fouten en het aantal "set-verlies" fouten bij de omkering en extra-dimensionale verschuiving stadia zoals gedefinieerd door Lapiz-Bluhm et al. 14 als het aantal keren dat een verkeerde keuze is gemaakt naar aanleiding van drie of meer opeenvolgende juiste keuzes. Een toename van het aantal "set-verlies" fouten kan een perseverative gedrag aan te geven. Daarnaast muizen vullen typisch elk testfase in minder dan 30 min (figuur 5), en de tijdsduur doorgebracht in elke trap is een functie van proeven criterium bereiken.
In een eerdere studie met eenzelfde paradigma zoals hier beschreven, neurotoxische laesies de OFC of mPFC bij muizen bleken prestaties bij de omkering en extra-dimensionale shift stages respectievelijk aantasten, valideren het gebruik van deze test functionele gebreken in het bepalen dezelfde regio als ratten en niet-menselijke primaat studies11. Hoewel de volgorde van de taken in de bovengenoemde studie varies licht dat hier wordt verwacht dat laesies of tekorten in de OFC en mPFC ook resulteren in verminderde prestaties bij R1 en EDS, hetgeen tot een toename van het aantal pogingen criterium in stadia. .
| Podium | Relevant | Voorbeelden | Relevant | Voorbeelden | ||
| Eenvoudige Discriminatie (SD) | Medium | Vilt (+) | Paper (-) | Geur | Nootmuskaat (+) | Rozemarijn (-) |
| Verbinding Discriminatie (CD) | Medium | Vilt (+) / Nootmuskaat | Papier (-) / Rozemarijn | Geur | Nootmuskaat (+) / Vilt | Rozemarijn (-) / papier |
| Vilt (+) / Rozemarijn | Papier (-) / Nootmuskaat | Nootmuskaat (+) / papier | Rozemarijn (-) / Vilt | |||
| Reversal 1 (R1) | Medium | Paper (+) / Rozemarijn | Vilt (-) / Nootmuskaat | Geur | Rozemarijn (+) / papier | Nootmuskaat (-) / Vilt |
| Papier (+) / Nootmuskaat | Vilt (-) / Rozemarijn | Rozemarijn (+) / Vilt | Nootmuskaat (-) / papier | |||
| Intradimensional Shift (IDS) | Medium | Pompons | Pailletten (-) / Kruidnagel | Geur </ Td> | Kaneel (+) / Pompoms | Kruidnagel (-) / pailletten |
| (+) / Cinnamon | ||||||
| Pompons (+) / Kruidnagel | Pailletten (-) / Cinnamon | Kaneel (+) / pailletten | Kruidnagel (-) / Pompoms | |||
| IDS2 | Medium | Pipecleaners | Googly ogen (-) / Ginger | Geur | Rode tijm (+) / Pipecleaners | Gember (-) / Googly ogen |
| (+) / Red tijm | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ginger | Googly ogen (-) / Red tijm | Rode tijm (+) / Googly ogen | Gember (-) | |||
| IDS3 | Medium | Lint (+) / Vanilla | Metallic strips (-) / Lemon | Geur | Vanille (+) / Ribbon | Citroen (-) / Metallic strips |
| Lint (+) / Citroen | Metallic strips (-) / Vanilla | Vanille (+) / Metallic strips | Citroen (-) / Ribbon | |||
| R2 | Medium | Metallic strips (+) / vanille | Ribbon (-) / Lemon | Geur | Citroen (+) / Ribbon | Vanilla (-) / Metallic Strips |
| Metallic strips (+) / Lemon | Ribbon (-) / Vanilla | Citroen (+) / Metal lic strips | Vanilla (-) / Ribbon | |||
| Extradimensional Shift (EDS) | Geur | Citronella (+) / Raffia | Anijs (-) / Foam | Medium | Raffia (+) / Citronella | Schuim (-) / Anijs |
| Citronella (+) / Foam | Anijs (-) / Raffia | Raffia (+) / Anijs | Schuim (-) / Citronella | |||
Tabel 1. Voorbeeld combinaties van geur en graafmachines medium. De geuren en graafmachines media in deze combinaties zijn gevalideerd in deze studie. Representatieve resultaten met deze specifieke combinaties worden getoond in Figuur 2.
hres.jpg "/>
Figuur 1. AST testkamer. (A) Afbeelding en afmetingen schaaltje en voorbeeld filtreerpapier plaatsing. (B) Afbeelding van de AST testkamer aangepast voor muizen en (C) een driedimensionaal diagram van de testkamer geïllustreerd plaats van de perforaties in de partitie.
Figuur 2. Graven medium. Voorbeelden van graven medium paren gebruikt in dit protocol zoals beschreven in de lijst materialen (II.-xi.). Potten worden ongeveer gevuld tot de binnenrand met graven medium.
Figuur 3. Timeline voor het testen.
Figuur 4. C57BL / 6J prestaties in de AST. (A) Gemiddeld aantal proeven om criterium in de AST voor mannelijke C57BL / 6J muizen te voldoen. Gegevens stellen gemiddelde ± SEM (n = 22 muizen / groep), p = 0,013 voor de belangrijkste effect van het podium. (B) Gemiddeld aantal proeven om criterium bereiken op de SD-podium voor verschillende initiële relevante cue dimensies. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 22 muizen / groep), * p = 0,01. (C) genormaliseerde gegevens weergegeven als percentage van individuele prestaties elke muis bij de SD stadium. Gegevens stellen gemiddelde ± SEM (n = 22 muizen / groep), p = 0,06 voor de belangrijkste effect van het podium. (D) ID / ED verschuiving in proeven om criterium te bereiken tussen IDS2 en ED. Gegevens stellen gemiddelde ± SEM (n = 22 muizen / groep), * p = 0,03. (E) ID / ED verschuiving in genormaliseerde gegevens tussen IDS3 en ED. Gegevens stellen gemiddelde ± SEM (n = 22 muizen / groep), * p = 0,012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekortkomingen in cognitieve flexibiliteit gemedieerd door de PFC vertegenwoordigen een significante invaliditeit geassocieerd met een verscheidenheid van neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen, en kan een grote invloed op het resultaat en kwaliteit van leven van individuen die lijden aan deze aandoeningen. Optimalisatie van het AST voor gebruik in muizen is essentieel voor het onderzoek naar genetische risicofactoren bij ziekten verbonden met corticale gemedieerde cognitieve dysfunctie prefrontale. Wij hebben gevonden dat de hierboven beschreven werkwijze is een betrouwbare maat van een specifieke cognitieve tekorten, cognitieve flexibiliteit, en benadert de verkregen middels deze taak bij ratten en niet-menselijke primaten resultaten. De beschreven methode is het resultaat van een uitgebreid onderzoek van de eerder beschreven protocollen bij ratten en muizen, evenals advies en begeleiding van experts bij onze instelling.
Eerdere rapporten met behulp van vergelijkbare taken bij muizen hebben het aanpassingsvermogen van een dergelijke gedragsmaatregel aangetoond, zij het metenkele kanttekeningen 2,6,11. Colacicco et al. Beperkt het aantal discriminaties getest per dag tot 2, waarbij het testen over een periode van vier dagen 11 verspreid. Dit omvatte herhalingen van eerder geleerde stimuli paren op opeenvolgende testdagen. Doeltreffende, teneinde het ontwikkelen van de hier gepresenteerde protocol is de duur van de testperiode minimaliseren en efficiëntie maximaliseren. Hier beperken we testen om een periode van twee dagen en herhalingen van eerder geleerde stimuli paren te elimineren. Vorige onderzoekers hebben opgemerkt dat muizen vereisen overtraining een aandachtsbias set vormen en vertonen een klein "venster van testbaarheid" waarin ze zal handhaven effortful reageert. Ons protocol omvat ook bescheiden overtraining op de intradimensional verschuiving binnen de aanvankelijk relevante cue dimensie. Vooral wanneer zij de genormaliseerde gegevens in figuur 4C blijkt dat muizen getest in ons protocol kan een meer uitgesproken duri tekort vertonenng het tweede intradimensional omkering (ten opzichte van de direct daaraan voorafgaande fase). Deze waarneming is in overeenstemming met de notie van overtraining met het oog op de vorming van een aandachtsbias set te garanderen, zoals muizen vertoonden ook een ID / ED shift. Een mogelijkheid waarom muizen houden inspannend prestaties in ons protocol (figuur 5), dat een gemiddelde sessie lengte van 2 uur omvat, kan door gebruik van een omgekeerde lichtcyclus. We testten gedrag in een geïsoleerde en toegewijde testkamer onder rood lichtomstandigheden tijdens de eerste vier uur van de donkere (wakkere) cyclus. Toch zouden systematisch testen buiten de scope van deze werkwijze manuscript nodig te bepalen welke factoren dragen bij aan de duur waarin muizen zal de AST voeren, en indien tekorten olfactorische discriminatie vermoed, kan prescreening voorafgaand gerechtvaardigd proeven plaatsvervangend geurvrij methoden zijn gemeld.
Bovendien, tijdensde eerste methode ontwikkeling, ontdekten we dat jonge volwassen muizen (8-12 weken oud) uitgevoerd met grotere variabiliteit die iets ouder 4-6 maanden oude muizen. We speculeren dat het voedselrestrictie protocol beïnvloedt groeiende muizen anders dan de meer volwassen muizen, en terwijl, in een klassieke neuro zin is muizenhersenen beschouwd als volledig ontwikkeld door 6 weken, is het mogelijk dat de overgang van adolescent tot volwassene rijpheid en vroege volwassenheid synaptische verbouwing binnen de prefrontale cortex verwarren AST prestaties bij jongere muizen. Echter, deze boeiende vragen nog worden onderzocht.
Andere variaties van AST protocollen bij muizen omvatten "vrij" proeven, betekent een aangewezen aantal pogingen (typisch 4) aan het begin van elke fase niet gescoord, en het dier kan zowel potten onderzoeken totdat de beloning wordt opgehaald. Het protocol hier beschreven omvat geen "gratis" proeven. Daarnaast zetten we de requirements aan criterium strengere (8 achtereenvolgens correcte trials tot criterium in plaats van de eerder beschreven 8/10 proeven om criterium te voldoen) te ontmoeten en hebben geconstateerd dat dit een effectieve indicator van de vraag of het dier echt de regel heeft geleerd. Garner et al. toonde aan dat een periode van overtraining na een IDS (dat wil zeggen, de presentatie van de eerder relevante stimuli voor een extra 50 proeven) aanzienlijk toegenomen de proeven aan criterium in de EDS 2. Hier hebben we onder andere meerdere intra-dimensionale verschuivingen, in een poging om "ondertraint" en zorgen voor de vorming van een aandachtsbias set op de relevante dimensie, in overeenstemming met Bissonette et al. 6. Daarnaast Garner et al. beperkte testsessies tot ongeveer 1 uur (of wanneer de muis niet meer gereageerd) 2, terwijl we hebben gemerkt dat C57BL6 / J muizen adequaat en betrouwbaar vooruitgang door alle vier stadia aan hen elke dag binnen ongeveer een 2 uur tijd (voor controlemuizen). Hoewel, mogelijke verschillen in motoriek tussen experimentele groepen moeten worden overwogen bij het interpreteren van de prestaties. Onze werkwijze beperkt de tijd en arbeid investeringen tot 17 dagen per dier vanaf het begin van het hanteren door de voltooiing van het testen. Aanbevolen wordt een individu experimentator beperken het aantal muizen getest in een enkele dag niet meer dan 2 (dit kan worden gewijzigd op basis van individuele experimentator bekwaamheid en ervaring), die een enkele onderzoeker de mogelijkheid proeven voltooien minstens 6 laat muizen per week. Als motoriek mild is aangetast, kan de lengte van elke proef worden verhoogd, als juist te reageren, niet de snelheid van reageren, is de sleutel afhankelijke variabele.
Visuele discriminatie paradigma vergelijkbaar met die welke zijn gebruikt om de cognitieve prestaties in niet-humane primaten zijn onlangs aangepast voor gebruik in knaagdieren te evalueren, en kunnen worden gebruikt als alternatief voor de geur en medium discrimination taken hier beschreven. Deze werkwijze kan nodig zijn als significante verschillen in olfactorische onderscheid aanwezig is tussen de experimentele groepen van muizen. Brigman et al. Hebben aangetoond dat muizen gemakkelijk te onderscheiden verbinding visuele stimuli in een ID en ED shift paradigma 15. Hoewel deze geautomatiseerde methode beter het gebruikte test prefrontale cortex disfunctie bij mensen en niet-humane primaten studie, de kosten van de operante kamers en aanraakschermen moeten uitvoeren dit geautomatiseerde test bij muizen kan worden onbetaalbaar.
Aanbevolen wordt gedrag consistent mogelijk worden uitgevoerd voor elke muis, dwz gewenning, getraind en getest worden op hetzelfde tijdstip voor elk dier uitgevoerd. Bovendien moet het gedrag kamer ongewijzigd gedurende het experiment blijven, waardoor het gebruik van gedeelde / gemeenschapsruimte problematisch vanwege oncontroleerbare verkeersstroom, geur inleiding, enz. Als de dieren zullen worden vervoerdeen behuizing kamer met een externe gedrag ruimte (zoals het geval is), moet dezelfde route telkens genomen. Het gedrag kamer zou moeten zijn in een gebied waar de experimentator en de dieren niet gestoord worden tijdens de testprocedure. Als er meerdere onderzoekers zijn het uitvoeren van de taak in dezelfde kamer, ingang en uitgang van de kamer moet zo beperkt mogelijk op elk harde geluiden of verstoring die de stress of angst van de dieren tijdens het testen kan toenemen voorkomen. Bovendien moeten onderzoekers voorzichtig bij het verwijderen en vervangen van de startplaats en de potten in en uit de kamer om zo weinig ruis en verstoring mogelijk maken. Experimenten uitgevoerd bij ratten hebben aangetoond dat AST prestatie kan worden verstoord door verschillende stressoren.
Geurende van de potten dient elke week uitgevoerd en op dezelfde dag per week, tenminste 2 dagen vóór de eerste testdag. Het wordt aanbevolen dat de potten zijn geparfumeerd in een goed-ventilated gebied buiten het gebied waar de test moet worden uitgevoerd (bijvoorbeeld aparte laboratorium, hal, zuurkast). Dit zal helpen om kruisbesmetting van de geuren te voorkomen en voorkomt verwarring de muizen met geuren die geen deel van de test. Bovendien, voorafgaand aan en tijdens het testen, sterke geuren die het dier uit de discriminatie kunnen afleiden (dat wil zeggen, het verbruik van de lijm of koffie onmiddellijk voorafgaand aan het testen, sterke parfum / deodorant, enz.) Moet worden vermeden voor de hiervoor genoemde reden. Moeten onderzoekers de wens om alternatieve graven medium dan wat wordt beschreven in dit protocol te gebruiken, is het raadzaam dat het medium te zijn van soortgelijke dichtheid en gewicht, dat hier wordt beschreven (overmatig gewicht / dichtheid maakt het moeilijk voor de muis om adequaat te graven). Zo vonden we dat kleine plastic kralen waren niet geschikt omdat ze moeilijk voor de muizen opzij duwen. Bovendien, alle media met een zeer sterke geur (bijv., Rubberen strips en sommige plastic materiaal) niet geschikt omdat het kan interfereren met het vermogen om te detecteren de geuren getest.
Training en toetsing van een individuele muis moet worden uitgevoerd door een enkele experimentator, kan echter acclimatisatie uitgevoerd worden door elk experimentator zolang ze hebben deelgenomen aan de behandeling. Alle potten te gebruiken in de vier stappen uitgevoerd elke dag moeten binnen handbereik om de hoeveelheid tijd die de dieren in de wachtruimte tussen trappen beperken. Dit zal bijdragen tot het behoud van de aandacht van de muis op elke taak. Verder kan, zodra testen begonnen is het belangrijk niet te stoppen tot de voltooiing van de taken die testdag (dwz, moeten alle 4 fasen voor elke testdag achtereenvolgens worden ingevuld).
Concluderend, de hier beschreven protocol gedetailleerde methodologische instructies voor effectief gebruik van de AST prefrontale cortex afhankelijke cognitieve functie bij muizen, inclusief een beschrijving metenvan data-analyse en mogelijke valkuilen. Verschillende muis AST methoden worden in de primaire literatuur, elk met zijn eigen specifieke procedurele details. De unieke koppeling van zowel tekst-gebaseerde en visuele informatie zal bijzonder nuttig zijn voor de onderzoekers een poging om deze krachtige gedrags test te nemen in hun wetenschappelijke repertoire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies R01-MH090127, P30-MH089868 van het National Institute of Mental Health en het aantal award UL1TR001120 van het National Center for Translational Voortschrijdende Sciences. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het NIMH of NCATS. Daarnaast willen wij dankbaar erkennen Dr. David Morilak voor zijn waardevolle expertise in het begeleiden van de ontwikkeling van jonge methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
