Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, eine Verhaltenstest wie Aufmerksamkeits Satz Schaltaufgabe (AST) und präfrontalen Kortex vermittelten kognitiven Flexibilität bei Mäusen beurteilt auszuführen.
Introduction
Die Aufmerksamkeits Satz Verschiebung Aufgabe (AST) wurde als Maß der Aufmerksamkeit und der kognitiven Flexibilität bei Ratten vor über einem Jahrzehnt 1,2 entwickelt. AST ist nach dem intradimensional / extradimensional Komponente der Cambridge neuropsychologischen Testmated Batterie (CANTAB), die verwendet wird, um die kognitive Dysfunktion bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten 3,4 identifizieren modelliert. Während die Fähigkeit, einfache Regeln zu lernen intakt bleibt, Defizite in Lernen, um eine Antwort, wenn die Regeln bei Patienten mit einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen (zB, Schizophrenie, Zwangsstörungen, Depressionen) geändert zu finden sind, neurodegenerative Erkrankungen zu modifizieren (dh Parkinson-Krankheit) und bei Patienten mit Verletzungen an den präfrontalen Kortex 5. Ganz allgemein werden diese Patienten mit der Defizite der kognitiven Flexibilität beschrieben. Analog Defizite in sowohl nicht-menschlichen Primaten und Nagetieren, wenn Läsionen t gezeigto präfrontalen Kortex wurden induzierte 1,6-8. Diese Defizite zeigen einen Zustand kognitiver Inflexibilität oder eine gestörte Fähigkeit zur Aufmerksamkeits Satz verschieben.
Ein Aufmerksamkeits Satz gebildet wird, wenn ein Thema erfährt, dass ein Satz von Regeln können komplexe Reize, um von irrelevanten Signale unterscheiden relevanten angewendet werden. Zum Beispiel in der AST, Tiere lernen, darauf zu achten und reagieren auf die jeweiligen Cue (dh Graben mittel) und ignorieren eine irrelevante Cue (dh, Geruch), indem Sie nach einer Futterbelohnung mit dem Medium. Diese Zuordnung wird dann in nachfolgenden Aufgaben verstärkt, wo die Art der Graben Medium und Geruchsveränderungen, aber die paarweise Verbindung zwischen Mittel- und Belohnung bleibt. Dies verstärkt Regel bildet eine kognitive Set. Zwei Stufen innerhalb der AST-Protokoll Maßnahme Aspekte der kognitiven Flexibilität: Umkehr und der extraDimensionsWechsel. Am Wendephase der zuvor negativen Impulse innerhalb eines dimension (Medium in diesem Beispiel) ist jetzt positiv, was das Tier herausfordert, die positiven Impulse aus der vorherigen Stufe zu ignorieren. Wenn beispielsweise Filz Graben Medium war die positiven Impulse in der vorherigen Stufe und Papier war die negativen Impulse, nun umgekehrt ist. Das fordert Flexibilität des Tieres, dass es muss die Aufmerksamkeitssatz pflegen (dh ist mittel die entsprechende Dimension), während die Änderung der Regel gelernt, für Anregung und Belohnung Paar innerhalb einer Dimension. Die Bildung einer Aufmerksamkeitssatz am extradimensionalen Schaltstufe, wenn die Dimension irrelevant (Geruch in diesem Beispiel) wird die entsprechende Dimension in Frage gestellt. Ein kehr Antwort, wie durch eine anhaltende Wahl mit Hilfe der zuvor gelernten Regel angegeben ist, an jeder Bühne spiegelt ein Defizit in der kognitiven Flexibilität.
Läsionsstudien sowohl in nicht-menschlichen Primaten und Nagern spezifischen Regionen des präfrontalen Cortex nachgewiesen werden kann, die Fähigkeit, Perf zurückzuführenorm bestimmten Phasen des AST 1,9. Läsionen an den orbitofrontalen Kortex (OFC), ein Teilbereich des präfrontalen Kortex (PFC), haben gezeigt, dass Defizite in der Umkehrung Lernen am AST 8 induzieren. Zusätzlich Läsionen an den medialen präfrontalen Kortex (MPFC) führen zu besonderen Schwierigkeiten bei der Durchführung des außerDimensionsWechsel.
Während zahlreiche Studien mit dem AST wurden an Ratten und nicht-menschlichen Primaten durchgeführt wurden, sind relativ wenige AST als Maß für kognitive Funktion in Mäusen verwendet. Angesichts der Leichtigkeit der Genmanipulation von Mäusen, und die kritische Notwendigkeit, präfrontalen Kortex-Funktion bei der Untersuchung eine Reihe von Krankheiten, die Anpassung und die Validierung dieses Verhaltensmaßnahme bei Mäusen zu messen, ist eine wichtige Ergänzung der Erforschung von Krankheiten mit PFC Dysfunktion. Die hier aufgeführten Protokoll ist eine Modifikation des Verfahrens von Birrell und Brown 1, die für die Anwendung in Mäusen optimiert ist und spiegelt viele der Maus-spezific Anpassungen, die zuvor berichtet 2,6,10-13 wurden.
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Protocol
HINWEIS: Tiere in dieser Studie verwendet werden, sind männliche C57BL / 6J-Mäusen zwischen 4 und 6 Monaten für optimale Ergebnisse. Mäuse werden auf einer Umkehrlichtzyklus, um während der aktiven (dunkel) Phase bequem testen sie erhalten. Wenn das Verhalten in einem Raum getrennt vom Gehäuse durchgeführt werden Mäuse erlaubt mindestens 1 Stunde zu folgenden Transport in den Testraum akklimatisieren. Verhaltenstests unter Rotlichtbedingungen durchgeführt Ausfälle zu minimieren die normale Aktivität der Mäuse so wenig wie möglich, solange noch die Versuchsleiter eine ausreichende Beleuchtung, um visuell die Testsitzung überwachen.
HINWEIS: Alle Aspekte des hier beschriebenen Versuchsdurchführung wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8. Auflage (NRC) durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der University of Texas Health Science zugelassen Center in San Antonio.
- Füllen Keramik Förmchen (nicht-porösen, 1.5 "Tiefe x 2.5" Durchmesser), den inneren Rand mit Graben Medium (ca. 1 "von unten); Filterpapier Runden in zwei Hälften geschnitten und nach innen Rückseite ramekin abgeklebt (Abbildung 1A)
- Brechen leicht gesüßte trockenen Frühstücksflocken (Futterbelohnung) - Honey Nut oder Zucker überzogen Sorten, in etwa 20 mg Stücke für Akklimatisierung, Training und Testphasen.
- Machen Sie ein Aufmerksamkeits Satz Verschiebung Aufgabe (AST) Kammer (1B): Akklimatisieren Zug und testen Sie jede Maus in einzelnen Kammern; empfehlen Produktion von mindestens 8 Kammern.
- Bauen Sie ein 12 "x 8" x 7 "AST Kammer; Wände und Starttor von Deckweiß Acryl die leicht zu reinigen mit 70% Ethanol ist gemacht. Die Guillotine-Stil, abnehmbare Starttor trennt Kammer in einem Wartebereich (5 "x 8") und Testbereich (7 "x 8").
- Beinhalten eine klare 5221; x7 "Trennwand, die zwei Seiten einer Testfläche gleichmäßig trennt; Schnitt drei ¼ "Durchmesser Löcher in unteren Teil der Trennwand, damit Sniffing-Zugang, Abstand 1" auseinander und 1 "von der Vorderseite der Trennwand (1C).
2. Verfahren Übersicht (Abbildung 2)
- Vor der AST, Hausmäuse einzeln und es ihnen ermöglichen, zu einem umgekehrten Lichtzyklus für mindestens eine Woche ein.
- Akklimatisieren, trainieren und testen jedes Tier in den einzelnen Testkammern. Weisen Sie jeder Kammer zu einer Maus und sauber mit 70% Ethanol nach Beendigung der letzten Testtag. Dadurch wird Stress während der Prüfung, indem sie die Kammer Geruch wie "home-Käfig" oder "Selbst" zu minimieren.
- Duft der Testtöpfen 2 Tage vor der Prüfung, damit der Duft zu zerstreuen; Mäuse werden nicht in Töpfen, die einen sehr starken Geruch haben zu graben. Unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel, gibt man etwa 0,1 mlätherisches Öl auf die Oberseite des Filterpapiers.
3. Handhabung (Tage 1-8)
- Hand Mäusen ab 8 Tage vor dem ersten Tag des Nahrungsmittelbeschränkung. Dadurch wird Stress mit der Handhabung während des Tests zu reduzieren.
- Wiegen und Plattenkörpergewicht pro Tag der Behandlung. Fassen Maus 2-3 Minuten pro Tag.
- Wenn mehrere Experimentatoren sind bei der Untersuchung einer Reihe von Mäusen beteiligt sein, sicherzustellen, dass jeder Experimentator beteiligt sich an der Verarbeitungsprozess, um die Vertrautheit mit Experimentatoren zu erhöhen und Stress und Angst erlebt auf die Ausbildung oder Testtagen.
- Weiter Handhabung und Aufzeichnungsgewichte während der gesamten Dauer der Prüfung.
4. Lebensmittelbeschränkung (Tage 9-12)
- Ab 4 Tage vor dem Beginn der Akklimatisierung, statt Mäuse auf einer eingeschränkten Diät Mäusen bei 80-85% ihrer freien Fütterung Körpergewicht zu halten. Geben Sie 1 Gramm Nahrung pro Maus pro Tag. Wenn das Körpergewicht unterschreitetder angegebene Bereich, wobei 2 Gramm pro Tag, bis sie an den entsprechenden Bereich zurückzukehren.
- Platzieren 2 ramekins an der Vorderseite jedes Heimkäfig, damit Mäusen auf die Testtöpfe akklimatisieren. Dies sind die gleichen Stellen verwendet, um die Maus zu trainieren, um für eine Futterbelohnung zu graben.
- Fügen Sie 2 Gramm Nahrung und ein Stück von Lebensmitteln Belohnung (ein halbes Stück von Getreide in jedem) in den Förmchen jeden Tag für 4 Tage.
- Wenn Verhalten ist in einem separaten Raum als dem, in dem die Mäuse untergebracht sind, ausgeführt werden, beginnend an Tag 1 des Nahrungsmittelbeschränkung und Verkehrs Mäusen auf den Testraum für mindestens 1 Stunde pro Tag vor der Rückkehr in den Gehäuseraum zu ermöglichen, sie auf den Testraum akklimatisieren.
- Am letzten Tag von Lebensmitteln Einschränkung, vor Beginn der Akklimatisierung, ändern Sie den Heimkäfig Betten. Der Käfig Bettwäsche wird erst wieder nach dem Test abgeschlossen ist, um Stress oder Angst erlebt während der Ausbildung und Prüfung (wenn es unbedingt notwendig) zu reduzieren geändert werden.
- PflegenMäuse auf Nahrungsmittelbeschränkung bis zum Ende des Tests. An den Tagen 13-17, geben Mäuse Essen nach Akklimatisierung, Ausbildung oder Prüfung auf der Basis einer Schätzung der Menge der Nahrung Belohnung verbraucht (in der Regel <1 g Futterpellet).
5. Akklimatisierung (Tage 13-14)
- Ab 2 Tage vor dem Beginn der Ausbildung, führen Akklimatisierung während der Dunkel-Zyklus unter Rotlicht.
- Verteilen Sie eine kleine Menge an schmutzigen Einstreu aus dem Käfig in der Kammer, wird dies den Druck, sich in einer neuen Umgebung, indem eine bekannte "home-Käfig" oder "Selbst" Geruch der Testkammer zu reduzieren (die gleiche Kammer werden für eine einzelne Maus für die Dauer der Ausbildung und Prüfung) verwendet.
- Ein sauberes ramekin mit Wasser im Wartebereich der Kammer; Mäuse sind in der Regel nicht zu essen, wenn sie keinen Zugang zu Wasser.
- Legen Sie die beiden Förmchen, die für die Nahrungsmittelbeschränkung im Testbereich mit einer Futterbelohnung verwendet wurden (~ 20mg Getreide Stück) in jedem.
- Platzieren Sie die Maus im Wartebereich; entfernen Sie das Starttor und lassen Sie die Maus, um die Kammer für 1 Stunde zu erkunden.
- Kontinuierlich hinzufügen Futterbelohnungen (~ 20 mg Getreide Stück), um die leeren Förmchen, um die Mäuse zu ermutigen, den Testbereich und die Töpfe häufig zu erkunden.
- Sicherzustellen, dass die Maus den Experimentator gesamten Akklimatisierungszeit zu sehen, so dass die Anwesenheit des Experimentators nicht ein zusätzlicher Stressor während des Tests.
6. Training (Tag 15)
- Platzieren Sie die Maus im Wartebereich.
- Legen Sie die leere Förmchen, die jeweils eine Futterbelohnung (~ 20 mg Getreide Stück) enthält, in den Testbereich und heben Sie die Startrampe. Lassen Maus 3 min, beide Essen Belohnungen zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals.
- Nach und Sägemehl / Maus Käfig Betten zu den Töpfen in nachfolgenden Studien hinzuzufügen. Lassen Sie die Maus 3 min, um die Futterbelohnung von jedem Topf vor dem Ende der drei abrufenal. Sobald die Maus den Futterbelohnung von jedem Topf abgerufen wird, gehen Sie zum nächsten Versuch. Wenn die Maus Versuche zu graben, wenn der Futterbelohnung wird zum Teil abgedeckt nicht machen kann Hinweise zur Verfügung gestellt werden (dh, streuen Getreidestaub über Bereich der Futterbelohnung, vereinbaren Sie einen Einzug im Sägemehl auf Gebiet der Lebensmittel Belohnung, aufzudecken Teil der Futterbelohnung).
- Weiter Sägemehl / Bettwäsche Zugabe nach jedem Versuch, bis die Futterbelohnung ist komplett abgedeckt und die Maus zuverlässig zeigt die Fähigkeit, in einem vollen Topf zu graben, um die Futterbelohnung zu finden.
- Wenn eine Maus nicht zuverlässig die Fähigkeit gezeigt, eine Futterbelohnung in einem vollen Topf innerhalb von 2 h nach Beginn der Ausbildung zu finden, weiterhin einen zweiten Tag des Trainings. Pflegen Sie die Maus auf Nahrungsmittelbeschränkung und wiederholen Sie den Vorgang am nächsten Tag.
- Wenn die Maus nicht für eine Futterbelohnung nach zwei aufeinanderfolgenden Tagen zu graben, schließt es aus dem Rest des Experiments, und mit Anmerkungen als "ausgefallen zu graben" im experimental Rekord.
7. Prüfung (16-17 Tage):
- Am ersten Tag, testen Sie einfach Diskriminierung (SD), Verbindung Diskriminierung (CD), Auflösung (R1) und Intra-Dimensionswechsel (IDS).
- Am zweiten Tag, testen Sie die intra-Dimensionswechsel 2 (IDS2), intra-Dimensionswechsel 3 (IDS3), Umkehr 2 (R2; optional), extra-dimensionale Verschiebung (EDS).
- Pair Medien und Düfte, wie in Tabelle 1 dargestellt.
- Zum Zeitpunkt der Behandlung auf Testtag, geben Mäusen eine Futterbelohnung einen Mangel an Konzentration durch Hunger zu vermeiden, während des Tests. Von diesem Punkt bis zum Ende des Testtages, bieten keine Nahrung außer Belohnungen für richtige Entscheidungen.
- Zu Beginn des Tests, mit einer Pinzette (begrenzt die Ausbreitung von Gerüchen zwischen Töpfen), legen Sie ein Stück des Futterbelohnung in den Topf, der eine richtige Wahl anzeigt. Das Essen Belohnung sollten in vollem Umfang von den Medien (siehe Abbildung 3) abgedeckt werden. Um einen Duft Stichwort von der Futterbelohnung zu vermeiden, streuen Getreidestäube over alle Töpfe zu Beginn der Stufe.
- Platzieren Sie die Maus in den Wartebereich mit der Start Tor geschlossen. Stellen Sie die Töpfe auf beiden Seiten der Testkammer. Der Prozess beginnt, wenn das Startgate entfernt und der Timer gestartet. Lassen Sie jede Maus 3 min pro Versuch, eine Wahl zu treffen. Notieren Sie die Wahl (richtig oder falsch) und die Zeit, bis die Maus machte eine Wahl für jeden Versuch.
HINWEIS: Eine "Wahl" wird von einem Versuch, in jedem Topf graben angezeigt. Ein Seitenhieb wird nur als Wahl angesetzt, wenn die Maus den Medien verdrängt und steckte seine Nase weit genug in den Raum schafft, um die Nahrung Belohnung oder verdrängt genug von den Medien, um die Futterbelohnung zu entdecken finden. Wenn eine Maus nicht eine Wahl innerhalb von 3 min hergestellt, wird dies als keine andere Wahl (falschen) aufgezeichnet. - Sobald eine Wahl hat für beide Topf gemacht, entfernen Sie den Topf, die nicht von der Testkammer gewählt. Wenn eine richtige Wahl getroffen wurde, damit die Maus, um die Futterbelohnung, bevor Sie die Maus wieder in beendender Wartebereich. Wenn eine falsche Auswahl getroffen haben, damit die Maus, um den Pot zu erforschen, um zu zeigen, dass es keine Futterbelohnung für diese Wahl vor der Rückkehr mit der Maus in den Wartebereich.
- Am Ende jeder Studie, die Maus wieder in den Wartebereich und ersetzen Sie die Startrampe.
- Sicherzustellen, dass die Maus erfüllt das Kriterium 8 korrekten Versuche nacheinander an die nächste Stufe der AST voranzutreiben. Wenn eine Maus nicht nacheinander erhalten 8 richtigen Entscheidungen innerhalb von 50 Studien, schlägt es dieses Stadium und kann nicht weitergehen, um den Test zu beenden. 6 aufeinanderfolgenden keine Entscheidungen (3 min ohne Wahl) ist ein Ausfall zu beteiligen und verbietet die Maus bewegt auf die nächste Stufe.
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Representative Results
Die typische abhängig Maßnahme in diesem Test ist die Anzahl der Versuche pro Stufe zu Kriterium (oder 8 aufeinanderfolgenden richtigen Entscheidungen) zu erfüllen. 4A zeigt die durchschnittliche Anzahl von Versuchen, um Kriterium in jeder Phase in unbehandelten C57BL / 6J mit dem AST erfüllen. Mäuse sind ein Aufmerksamkeits Satz auf der entsprechenden Cue Dimension (Geruch oder Medien), wird die Leistung zu verbessern, wie durch eine Verringerung der Versuche angezeigt, um Kriterium in aufeinander intradimensional Verschiebungen zu treffen, und die Umkehrstufen und die überdimensionalen Verschiebung werden zusätzliche Studien erforderlich, um zu treffen Kriterium. Es ist wichtig, die Anzahl der Tiere, die auf jeder der beiden relevanten Dimensionen (dh Medien oder Geruch) beginnen, wie wir einen Unterschied in der einfachen Diskriminierung Bühne in einer erhöhten Anzahl von Studien beobachtet reflektiert Kriterium Ist ein Geruch der entsprechende Gegengewicht Cue (4B). Wenn die Versuche auf Kriterium bei der SD-Stadium zu erreichen sind signifikant unterschiedlich zwischen the zwei relevante cue Abmessungen (dh eine bessere Leistung, wenn Medien relevant, wie in 4B), die Leistungsdaten für jede Maus während der nachfolgenden Stufen, um seine Leistung bei der einfachen Diskriminierungsstufe normiert werden. Wie in 4C dargestellt ist, diese Normalisierungsschritt reduziert die Variabilität beim Erlernen der zunächst relevante cue zugeordnet und verbessert Visualisierung verbesserte Leistung auf den nachfolgenden Stufen IDS. Obwohl Gruppengrößen von ~ 20 Mäusen wird ausreichen, um Analyse der Rohdaten ohne Normalisierung zu ermöglichen. Wichtig ist, dass eine deutliche Steigerung in den Studien zum Kriterium bei der extradimentional Verschiebung gegenüber den vorherigen intradimentional Verschiebungen gibt erfüllen eine wichtige Steuerungsgröße des Tests Gültigkeit (4D und 4E). Vor der ED-Schaltstufe, Mäuse lernen, die Aufmerksamkeit auf eine einzige relevante Dimension Cue (Geruch oder Medien), um die Belohnung zu finden bezahlen. Der Wechsel zu einem new relevant cue Dimension, nämlich bisher irrelevant, sollte mehr Versuche erforderlich Kriterium zu erreichen, was in einer ID / ED Verschiebung. Interessanterweise Analyse der ID / ED Verschiebung innerhalb der Rohdaten zeigte einen signifikanten Anstieg in den Prüfungen nach Kriterium zwischen IDS2 und ED (4D) zu erreichen, und Trend in Richtung einer Zunahme zwischen IDS3 und ED (Daten nicht gezeigt, p <0,1) und ein Anstieg zwischen den mittleren Versuche zur Kriterium IDS2 und IDS3 Vergleich zum ED (Daten nicht gezeigt) zu erreichen. Interessanterweise wurde ein signifikanter ID / ED Verschiebung offensichtlich zwischen beiden IDS2 und IDS3 Vergleich zum ED, wenn die Daten wurden normalisiert, um die Leistung an der SD-Stufe (Figur 4E).
Es wird erwartet, dass etwa 70-80% der Kontrollmäuse, die gesamte Aufgabe (Drop-out-Rate von 20 bis 30%) zu vervollständigen. Alternative Maßnahmen sind abhängig durchschnittliche Latenzzeit, um eine Wahl zu treffen, wie in jeder Phase der Aufgabe gemessen (obwohl wir gefunden haben, um diese sehr variabel zwischen Mäusen)Gesamtzahl der Fehler und die Anzahl der "Set-Verlust" Fehler bei der Auflösung und extra-dimensionalen Schaltstufen wie Lapiz-Bluhm et al. 14, wie die Anzahl der Male eine falsche Wahl getroffen wurde nach drei oder mehr hintereinander richtigen Entscheidungen festgelegt. Eine erhöhte Anzahl von "Set-Verlust" Fehler können eine perseverative Verhalten zeigen. Zusätzlich Mäusen in der Regel ergänzen sich Testphase in weniger als 30 min (Abbildung 5), und die Dauer der Zeit, in jeder Stufe ausgegeben wird, eine Funktion der Studien zu Kriterium erreichen.
In einer früheren Studie mit einem ähnlichen Paradigma wie hier beschrieben, als neurotoxische Läsionen an den OFC oder mPFC bei Mäusen wurde gezeigt, dass die Leistung an den Umkehr und extra-dimensionalen Schaltstufen bzw. beeinträchtigen, die Validierung der Verwendung dieses Tests zu funktionellen Defiziten in der Bestimmung gleichen Regionen wie Ratten und nicht-menschlichen Primaten studies11. Während die Reihenfolge der Aufgaben in der oben erwähnten Studie vWidder leicht auf, das hier gezeigt ist, wird erwartet, dass Läsionen oder Defizite im OFC und mPFC wird auch zu einer Beeinträchtigung der Leistung bei R1 und EDS resultieren, wie durch einen Anstieg in der Anzahl der Versuche reflektiert die in den Phasen Kriterium. .
| Bühne | Relevant | Beispiele | Relevant | Beispiele | ||
| Einfache Diskriminierung (SD) | Medium | Filz (+) | Papier (-) | Geruch | Muskatnuss (+) | Rosemary (-) |
| Verbindung Diskriminierung (CD) | Medium | Filz (+) / Nutmeg | Papier (-) / Rosmarin | Geruch | Muskatnuss (+) / Felt | Rosemary (-) / Papier |
| Filz (+) / Rosemary | Papier (-) / Nutmeg | Muskatnuss (+) / Papier | Rosemary (-) / Felt | |||
| Auflösung 1 (R1) | Medium | Papier (+) / Rosmarin | Filz (-) / Nutmeg | Geruch | Rosemary (+) / Papier | Muskatnuss (-) / Felt |
| Papier (+) / Nutmeg | Filz (-) / Rosemary | Rosemary (+) / Felt | Muskatnuss (-) / Papier | |||
| Intradimensional Umschalttaste (IDS) | Medium | Pompoms | Pailletten (-) / Clove | Geruch </ Td> | Zimt (+) / Pompoms | Gewürznelke (-) / Pailletten |
| (+) / Zimt | ||||||
| Pompoms (+) / Clove | Pailletten (-) / Cinnamon | Cinnamon (+) / Pailletten | Gewürznelke (-) / Pompoms | |||
| IDS2 | Medium | Pipecleaners | Googly Augen (-) / Ginger | Geruch | Red Thymian (+) / Pipecleaners | Ginger (-) / Googly Augen |
| (+) / Roter Thymian | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ginger | Googly Augen (-) / Red Thymian | Red Thymian (+) / Googly Augen | Ingwer (-) | |||
| IDS3 | Medium | Ribbon (+) / Vanilla | Metallstreifen (-) / Lemon | Geruch | Vanilla (+) / Ribbon | Lemon (-) / Metallstreifen |
| Ribbon (+) / Lemon | Metallstreifen (-) / Vanille | Vanilla (+) / Metallstreifen | Lemon (-) / Ribbon | |||
| R2 | Medium | Metallstreifen (+) / Vanille | Ribbon (-) / Lemon | Geruch | Lemon (+) / Ribbon | Vanilla (-) / Metallic-Streifen |
| Metallstreifen (+) / Lemon | Ribbon (-) / Vanilla | Lemon (+) / Metal lic Streifen | Vanilla (-) / Ribbon | |||
| Extradimensionalen Umschalttaste (EDS) | Geruch | Citronella (+) / Bast | Anis (-) / Foam | Medium | Bast (+) / Citronella | Foam (-) / Anise |
| Citronella (+) / Foam | Anis (-) / Bast | Bast (+) / Anise | Foam (-) / Citronella | |||
Tabelle 1. Beispiel Kombinationen von Geruch und Graben Medium. Die Düfte und Graben Medien in diesen Kombinationen wurden in dieser Studie bestätigt. Verwendung dieser speziellen Kombinationen erhalten Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt.
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Abbildung 1. AST Prüfkammer. (A) Bild und Abmessungen Ramekin und Beispiel Filterpapier Platzierung. (B) Bild der AST Prüfkammer für Mäuse und (C) ein dreidimensionales Diagramm der Prüfkammer welche die Anordnung der Löcher in der Trennwand angepaßt ist.
Abbildung 2. Graben Medium. Beispiele für das Graben mittlere Paare in diesem Protokoll als detaillierte in der Materialliste (II.-xi.) verwendet. Die Töpfe werden in etwa dem Innenrand mit Graben Medium gefüllt.
Abbildung 3. Timeline zum Testen.
Abbildung 4. C57BL / 6J Leistung in der AST. (A) Durchschnittliche Anzahl von Versuchen, um Kriterium bei der AST für männliche C57BL / 6J Mäusen erfüllen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM (n = 22 Mäuse / Gruppe), p = 0,013 für die Hauptwirkung der Bühne. (B) Durchschnittliche Anzahl von Versuchen, um Kriterium bei der SD-Bühne für verschiedene Anfangs entsprechenden Cue Dimensionen erreichen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM (n = 22 Mäuse / Gruppe), * p = 0,01. (C) normalisierte Daten als Prozentsatz des individuellen Leistung jedes Maus auf der SD-Bühne vertreten. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM (n = 22 Mäuse / Gruppe), p = 0,06 für die Hauptwirkung der Bühne. (D) ID / ED-Verschiebung in Studien zu Kriterium zwischen IDS2 und ED erreichen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM (n = 22 Mäuse / Gruppe), * p = 0,03. (E) ID / ED-Verschiebung in normalisierten Daten zwischen IDS3 und ED. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM (n = 22 Mäuse / Gruppe), * p = 0,012.
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Discussion
Defizite in der kognitiven Flexibilität durch die PFC vermittelt einen wesentlichen Behinderung mit einer Vielzahl von neurologischen und neuropsychiatrischen Störungen verbunden sind, und kann einen großen Einfluss auf die Ergebnisse und die Lebensqualität von Personen, die unter diesen Erkrankungen haben. Optimierung der AST für den Einsatz in Mäusen ist von entscheidender Bedeutung, um die Untersuchung der genetischen Grundlagen von Krankheiten verbunden ist, um kortikale vermittelte kognitive Dysfunktion präfrontale. Wir haben festgestellt, dass das oben beschriebene Verfahren ist ein zuverlässiges Maß für eine spezifische kognitive Defizit, kognitive Flexibilität und sehr nahe kommt, die unter Verwendung dieser Aufgabe in Ratten und nicht-menschlichen Primaten erhalten wurden. Das beschriebene Verfahren ist das Ergebnis einer umfangreichen Befragung der zuvor beschriebenen Protokolle bei Ratten und Mäusen als auch Beratung und Anleitung von Experten an unserer Hochschule.
In früheren Berichten mit ähnlichen Aufgaben in Mäusen haben die Anpassungsfähigkeit eines solchen Verhaltensmaßnahme nachgewiesen, wenn auch miteinige Fallstricke 2,6,11. Colacicco et al. Beschränkt die Anzahl der Diskriminierung getestet pro Tag bis 2, die Tests über einen Zeitraum von vier Tagen 11 verteilt. Dazu gehörten Wiederholungen zuvor gelernten Reize Paare an aufeinanderfolgenden Testtagen. Während wirksam ist, ist das Ziel der Entwicklung der hier vorgestellten Protokoll, um die Dauer der Testperiode zu minimieren und die Effizienz zu maximieren. Hier beschränken wir Tests auf einen Zeitraum von zwei Tagen und zu beseitigen Wiederholungen der zuvor gelernten Reize Paare. Frühere Forscher haben festgestellt, dass Mäuse, erfordern Übertraining, eine Aufmerksamkeitssatz zu bilden und weisen eine kleine "Fenster der Testbarkeit", in dem sie halten effortful reagiert. Unser Protokoll gehört auch bescheidenen Übertraining auf dem intradimensional Verschiebung innerhalb der zunächst relevante Cue Dimension. Insbesondere bei der Bewertung der normalisierten Daten in 4C, scheint es, dass Mäuse, kann eine stärkere Defizit duri zeigen in unserem Protokoll getestetng der zweiten intradimensional Umkehr (bezogen auf den unmittelbar vorhergehenden Stufe). Diese Beobachtung stimmt mit der Vorstellung von Übertraining, um die Bildung einer Aufmerksamkeitssatz zu gewährleisten, wie Mäuse zeigten auch eine ID / ED-Verschiebung. Eine Möglichkeit dafür, warum Mäusen aufrecht effortful Leistung in unserem Protokoll (Abbildung 5), die einen durchschnittlichen Sitzungsdauer von 2 h umfasst, kann durch die Nutzung eines Rückwärtslichtzyklus. Wir testeten das Verhalten in einer isolierten und engagierten Testraum unter roten Lichtverhältnissen während der ersten vier Stunden vor der Dunkelheit (wachen) Zyklus. Jedoch würde systematische Tests außerhalb des Umfangs dieses Verfahrens Manuskript erforderlich sein, um festzustellen, welche Faktoren für die Dauer, in dem Mäuse weiterhin die AST auszuführen, und wenn Defizite im olfaktorischen Diskriminierung vermutet werden, Vorschaltung kann vor dem Test als alternative gerechtfertigt sein geruchsfreie Methoden wurden beschrieben.
Zusätzlich wird währendder ursprüngliche Methodenentwicklung, entdeckten wir, dass junge erwachsene Mäuse (8-12 Wochen alt) mit einer größeren Variabilität, die etwas ältere 4-6 Monate alten Mäusen durchgeführt. Wir vermuten, dass das Essen Einschränkung Protokoll betrifft wachsenden Mäusen anders als reifer Mäuse, und während im klassischen Sinn Entwicklung des Nervensystems, das Gehirn der Maus gilt als vollständig von 6 Wochen entwickelt, ist es möglich, dass der Übergang von Jugendlichen zu Erwachsenen Reife und frühen Erwachsenenalter synaptische Umbau im präfrontalen Kortex verwechseln AST Leistung in jüngeren Mäusen. Bleiben diese spannenden Fragen jedoch, erkundet zu werden.
Andere Variationen AST Protokolle in Mäusen wie "frei" Versuche, das heißt eine bestimmte Anzahl von Versuchen (typischerweise 4) zu Beginn jeder Stufe sind nicht erzielt, und man erlaubt dem Tier, beide Töpfe erforschen, bis die Belohnung wird abgerufen. Die hier aufgeführten Protokoll enthält keine "freie" Studien. Darüber hinaus setzen wir die requirements Kriterium strenger (8 nacheinander richtigen Studien Kriterium anstelle der zuvor beschriebenen 8/10 Studien zum Kriterium) zu treffen und haben festgestellt, dass es sich um ein wirksames Indikator dafür, ob das Tier wirklich gelernt, die Regel. Garner et al. hat gezeigt, dass ein Zeitraum von Übertraining nach einem IDS (dh Darstellung der zuvor relevante Reize für weitere 50 Versuche) deutlich erhöht die Prüfungen in der EDS 2 Kriterium. Hier sind wir mehrere inner dimensionale Verschiebungen, in dem Bemühen, "Übertraining" und sorgen für die Bildung einer Aufmerksamkeits Satz auf der entsprechenden Dimension im Einvernehmen mit Bissonette et al. 6. Zusätzlich Garner et al. begrenzte Testsitzungen auf etwa 1 h (oder, wenn die Maus nicht mehr reagiert) 2, wobei wir festgestellt haben, dass C57BL6 / J-Mäuse ausreichend und zuverlässig durch alle vier Phasen pro Tag innerhalb von etwa 2 Stunden-Zeitraum um sie Taetigkeitsbericht (für SteuerMäuse). Obwohl, Potentialunterschiede bei Kraftfähigkeit zwischen den Versuchsgruppen sollte bei der Interpretation Leistungs werden. Unser Verfahren schränkt die Zeit und Arbeit Investitionen zu 17 Tage für jedes Tier vom Beginn der Handhabung durch den Abschluss der Tests. Es wird empfohlen, dass ein einzelner Experimentator begrenzen die Anzahl der Mäuse in einem einzigen Tag getestet, um nicht mehr als 2, die eine einzige Experimentator die Fähigkeit, Tests auf mindestens 6 abschließen können (dies kann auf der Grundlage individueller Experimentator Fähigkeit und Erfahrung modifiziert werden) Mäuse pro Woche. Wenn der Motorfunktion leicht beeinträchtigt werden, kann die Länge der einzelnen Studien erhöht, als richtig reagiert, nicht die Geschwindigkeit der Reaktion, der Schlüssel abhängige Variable.
Visuelle Unterscheidung Paradigmen ähnlich denen, die verwendet wurden, um die kognitive Leistungsfähigkeit in nicht-menschlichen Primaten wurden kürzlich für die Verwendung in Nagetieren angepasst zu beurteilen, und kann als Alternative zu dem Geruch und Medium diskriminieru verwendet werdenn hier beschriebenen Aufgaben. Diese Vorgehensweise kann erforderlich sein, wenn erhebliche Unterschiede in olfaktorischen Diskriminierung zwischen experimentellen Gruppen von Mäusen vorhanden sind. Brigman et al. Haben gezeigt, dass Mäuse ohne weiteres erkennen, Verbindung visuelle Reize in einer ID und ED Verschiebung Paradigma 15. Während diese automatisierte Methode besser repräsentiert die eingesetzt werden, um präfrontalen Kortex Dysfunktion bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten zu untersuchen Test, um die Kosten für die operante Kammern und Touchscreens erforderlich führen Sie diesen automatisierten Test an Mäusen prohibitiv sein können.
Es wird empfohlen, dass das Verhalten für jede Maus, dh Gewöhnung Ausbildung so konsequent wie möglich durchgeführt, und der Test sollte zur gleichen Tageszeit für jedes Tier durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte das Verhalten Raum unverändert während des gesamten Versuchs bleiben, so dass die Nutzung von Shared / Gemeinschaftsraum problematisch aufgrund unkontrollierbarer Verkehrsfluss, Geruch Einführung usw. Wenn Tiere transportiert werden sollenaus einem Gehäuseraum mit einem Remote Verhalten Raum (wie es hier der Fall ist), sollte die gleiche Strecke jedesmal entnommen werden. Das Verhalten Raum sollte in einem Bereich, wo der Experimentator und die Tiere nicht während des Prüfvorgangs gestört werden können. Wenn mehrere Experimentatoren sind Erfüllung der Aufgabe in einem Zimmer, Ein- und Aussteigen aus dem Raum sollte so begrenzt wie möglich, irgendwelche laute Geräusche oder Störungen, die den Stress oder Angst des Tieres während des Tests zu erhöhen können, zu vermeiden. Darüber hinaus sollten Experimentatoren vorsichtig entfernen und wieder die Startrampe sowie die Töpfe in die und aus der Kammer, um so wenig Lärm und Störungen wie möglich zu schaffen. Versuche an Ratten haben gezeigt, dass AST Leistung kann durch verschiedene Stressfaktoren gestört werden.
Beduftung von den Töpfen sollte jede Woche am gleichen Tag in der Woche, mindestens 2 Tage vor dem ersten Testtag durchgeführt werden, und. Es wird empfohlen, daß die Töpfe in einem gut Entlüftungsduftfert Bereich außerhalb der Bereich, in dem der Test durchgeführt werden soll (zB getrennte Labor, Diele, Dunstabzug). Dies wird helfen, um eine Kreuzkontamination der Düfte zu vermeiden und nicht zu verwirren die Mäuse mit Düften, die nicht Teil der Prüfung sind. Zusätzlich, vor und während des Tests, starke Gerüche, die das Tier aus der Diskriminierung ablenken kann (dh, den Verbrauch von Kaugummi oder Kaffee unmittelbar vor der Prüfung, starker Duftstoff / Deodorant usw.) sollten für den genannten Gründen vermieden werden. Sollte Experimentatoren Wunsch alternativen Grabmedium als das, was in diesem Protokoll beschrieben verwenden, ist es empfehlenswert, dass das Medium mit ähnlicher Dichte und Gewicht, um die hier beschriebene (Übergewicht / Dichte macht es schwierig für die Maus ausreichend graben) sein. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die kleinen Kunststoffkügelchen waren nicht geeignet, da sie waren schwierig für die Mäuse, um zur Seite zu schieben. Darüber hinaus sind alle Medien mit einer sehr starken Duft (z. B. Gummistreifen und einige plastic) ist nicht geeignet, da es mit der Fähigkeit zu erkennen, die Düfte getestet stören.
Training und Test eines einzelnen Maus durch ein einziges Experimentator durchgeführt werden, kann aber durch irgendeine Akklimatisierung Experimentator, solange sie in der Handhabung teilgenommen haben erfolgen. Alle Töpfe, die in den vier Stufen täglich durchgeführt werden sollte erreichbar sein, um die Menge an Zeit ist das Tier in den Wartebereich zwischen den Stufen zu begrenzen. Dies wird Ihnen helfen die Aufmerksamkeit der Maus auf jede Aufgabe zu erhalten. Außerdem, sobald der Test begonnen hat ist es wichtig, nicht bis zum Abschluss der Aufgaben für den Tag der Prüfung (dh müssen alle 4 Stufen für jeden Testtag in Folge abgeschlossen werden) zu stoppen.
Im Ergebnis ist die hier beschriebene Protokoll bietet ausführliche methodische Anweisungen für die effektive Nutzung der AST um präfrontalen kortikalen abhängige kognitive Funktion bei Mäusen, einschließlich Beschreibung messenDatenanalyse und mögliche Einschränkungen. Eine Vielzahl von Maus-AST Verfahren sind in der Primärliteratur berichtet, jeder mit seinem eigenen unterschiedlichen Verfahrens Detail. Die einzigartige Verbindung von Text-basierten und visuellen Informationen werden als besonders hilfreich für Forscher versucht, diese mächtige Verhaltenstest in ihrer wissenschaftlichen Repertoire integrieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse R01-MH090127, P30-MH089868 vom National Institute of Mental Health und Verleihungsnummer UL1TR001120 vom National Center for Advancing Translational Sciences unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIMH oder NCATS. Darüber hinaus möchten wir danken Dr. David Morilak für seine wertvolle Know-how bei der Führung des frühen Methodenentwicklung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
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| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
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- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
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- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
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- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
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