Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע assay התנהגות כגון סט קשב הסטת משימה (AST) כדי להעריך את גמישות מחשבתית prefrontal cortex בתיווך בעכברים.
Introduction
סט קשב הסטת משימה (AST) פותח כמדד לתשומת לב וגמישות קוגניטיבית בחולדות לפני למעלה מעשור 1,2. AST הוא מודל לאחר רכיב intradimensional / extradimensional של נוירופסיכולוגיים הבדיקה האוטומטית הסוללה קיימברידג '(CANTAB) שמשמש לזיהוי בעיות בתפקוד הקוגניטיבי בבני אדם ופרימטים שאינם בני אדם 3,4. בעוד היכולת ללמוד כללים פשוטים נותרה בשלמותה, גירעונות בלמידה לשנות תגובה כאשר הכללים השתנו נמצאים בחולים הסובלים ממגוון רחב של הפרעות נוירו-פסיכיאטריות (כלומר, סכיזופרניה, הפרעת אובססיבית כפייתית, דיכאון), הפרעות ניווניות (כלומר, מחלת פרקינסון) ובחולים עם נגעים לקליפת מוח קדם חזיתית 5. באופן כללי יותר, חולים אלו מתוארים כבעלי ליקויים בגמישות קוגניטיבית. גירעונות מקבילים הוכחו בשני קופים שאינם בני אדם ומכרסמים כאשר t נגעיםo קליפת מוח הקדם חזיתית כבר מושרה 1,6-8. גירעונות אלה מצביעים על מצב של חוסר גמישות קוגניטיבית או יכולת לקויה להעביר סט קשב.
סט קשב נוצרים כאשר נושא לומד כי מערכת של כללים יכולה להיות מיושמת לגירויים מורכבים על מנת לבדל רלוונטיים מרמזים לא רלוונטיים. לדוגמא, בAST, בעלי חיים ילמדו לשים לב ולהגיב לאות הרלוונטית (כלומר בינוני לחפור,) ולהתעלם מרמז רלוונטי (כלומר, ריח), על ידי זיווג גמול מזון עם המדיום. עמותה זו ולאחר מכן חיזקה במשימות הבאות שבו הסוג של חפירת שינויים בינוניים וריח, אבל העמותה לזווג בין בינוני וגמול נשארה. שלטון זה מהווה חיזוק מערך הקוגניטיבי. שני שלבים בהיבטי מידת פרוטוקול AST של גמישות קוגניטיבית: היפוך ושינוי נוסף-ממדי. בשלב ההיפוך, הגירויים השליליים בעבר בתוך dimensio אחדn (בינוני בדוגמא זו) היא החברה חיובית, אשר קורא תיגר על בעלי החיים להתעלם מהגירויים החיוביים מהשלב הקודם. לדוגמא, אם הרגשתי בינוני לחפור היה הגירויים החיוביים בשלב הקודם ונייר היה הגירויים השליליים, עכשיו ההפך הוא נכון. זה מאתגר את גמישותו של בעל החיים בכך שהיא חייבת לשמור על סט הקשב (כלומר, מדיום הוא הממד הרלוונטי) תוך שינוי הכלל שלמד לגירוי וזוג גמול בתוך ממד. ההיווצרות של סט קשב הוא קרא תיגר בשלב המשמרת הנוסף-ממדי, כאשר הממד לא רלוונטי (ריח בדוגמא זו) הופך את הממד הרלוונטי. תגובה עקשנית, כפי שצוין על ידי בחירת המשך באמצעות הכלל שלמד בעבר, בשני השלבים משקפת גירעון בגמישות קוגניטיבית.
מחקרי נגע בשני קופים ומכרסמים שאינם בני אדם הראו לאזורים ספציפיים של קליפת מוח הקדם חזיתית ניתן לייחס ליכולת PerfORM שלבים מסוימים של AST 1.9. נגעים לקליפת orbitofrontal (OFC), subregion של קליפת מוח הקדם חזיתית (PFC), הוכחו לגרום לגירעונות בהיפוך למידה על AST 8. בנוסף, נגעים להובלת קליפת מוח הקדם חזיתית (MPFC) המדיאלי לקשיים ספציפיים בביצוע השינוי נוסף-ממדי.
בעוד מחקרים רבים באמצעות AST בוצעו בחולדות וקופים שאינם בני אדם, מעטים יחסית נצלו AST כמדד לתפקוד הקוגניטיבי בעכברים. בהתחשב בקלות מניפולציה גנטית בעכברים, ואת הצורך הקריטי למדידת תפקוד קליפת מוח הקדם חזיתית בלימוד מגוון רחב של הפרעות, התאמת והאימות של אמצעי התנהגות זו בעכברים הוא תוספת חשובה למחקר במחלות הקשורות לתפקוד לקוי של PFC. הפרוטוקול המפורט כאן הוא שינוי של ההליך על ידי Birrell ו -1 בראון כי הוא מותאם לשימוש בעכברים ומשקף רב של העכבר ספציפיעיבודי ג שכבר דיווחו בעבר 2,6,10-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בעלי חיים ששמשו במחקר זה הם C57Bl / 6J עכברי זכרים בין 4 ל 6 חודשים של גיל לתוצאות אופטימליות. עכברים נשמרים על מחזור אור הפוך כדי לבדוק אותם בנוחות בשלב הפעיל (הכהה). אם ההתנהגות מתבצעת בחדר נפרד מדיור, עכברים מותר שעה לפחות 1 להסתגל התחבורה הבאה לחדר הבדיקות. בדיקות התנהגותיות מבוצעות בתנאי אור אדומים למזער את הפרעה לפעילות הנורמלית של העכברים הקטנים ככל האפשר תוך מתן אפשרות לתאורה נאותה הנסיין חזותי לפקח על פגישת הבדיקות.
הערה: כל ההיבטים של ההליך ניסיוני שתואר לעיל בוצעו בקנה אחד עם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, מהדורה 8 (NRC) ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת למדעי בריאות טקסס מרכז בסן אנטוניו.
> 1. התקנה ניסיונית
- מלא ramekins קרמיקה (שאינו נקבובי; 1.5 "x קוטר עומק 2.5"), לשפה פנימית בחפירה בינונית (כ 1 "מלמטה); סיבובי נייר סינון לחתוך במחצית והדביק לבתוך אחורי של צלוחית (איור 1 א)
- לשבור דגנים ממותקים קל יבשים ארוחת בוקר (גמול מזון) - דבש עם אגוזים או זני סוכר מצופה, לכ -20 חתיכות מ"ג לשלבי הסתגלות, הדרכה ובחינות.
- הפוך סט קשב הסטת משימה (AST) קאמרי (איור 1): להסתגל רכבת ולבדוק כל עכבר בתאים בודדים; ממליץ ייצור של לפחות 8 תאים.
- לבנות חדר AST 12 "x 8" x 7 "; קירות ושער התחלה עשויים אקריליק לבן אטום שהוא קל לניקוי עם אתנול 70%. סגנון גיליוטינה, שער פתיחה נשלף מפריד חדר לאזור ההמתנה (5 "x 8") ואזור הבדיקה (7 "x 8").
- כולל 5 נקה221; "מחיצה נשלפת X7 שמפרידה בין שני צדדים של אזור הבדיקות באופן שווה; לחתוך שלושה ¼ "חורים בקוטר לחלק תחתון של מחיצה כדי לאפשר מרחרח גישה, במרווחי 1" לגזרים ו1 "מהחלק הקדמי של המחיצה (איור 1 ג).
2. נוהל סקירה (איור 2)
- לפני AST, עכברי בית בנפרד ולאפשר להם להסתגל למחזור אור הפוך לשבוע אחד לפחות.
- להסתגל, רכבת ולבדוק כל בעל חיים בתאי בדיקה בודדים. להקצות לכל תא לעכבר אחד ונקי עם אתנול 70% לאחר שסיים את היום האחרון של בדיקות. זה יהיה למזער את הלחץ במהלך בדיקה על ידי ביצוע הריח קאמרי כמו "כלוב הבית" או "עצמי".
- ריח סירי בדיקות 2 ימים לפני הבדיקה, כדי לאפשר את הריח להתפוגג; עכברים לא לחפור בעציצים שיש לו ריח חזק מאוד. באמצעות מזרק עם מחט 25 G, להוסיף כ 0.1 מיליליטר שלשמן אתרים לחלק העליון של נייר הסינון.
3. טיפול (ימי 1-8)
- ידית עכברים מתחילים 8 ימים לפני היום הראשון של הגבלת מזון. זה יקטין את הלחץ הקשורים בטיפול במהלך בדיקה.
- לשקול ומשקל גוף שיא בכל יום של טיפול. לטפל בכל דקות עכבר 2-3 ליום.
- אם הנסיינים מרובים הם להיות מעורבים בבדיקת קבוצה של עכברים, להבטיח כי כל ניסוי משתתף בתהליך הטיפול להגדלת היכרות עם הנסיינים ולהפחית את הלחץ והחרדה חוו באימונים או ימי בדיקה.
- המשך משקולות טיפול והקלטה בכל משך הזמן של בדיקות.
4. הגבלת מזון (9-12 ימים)
- החל מה -4 בימים שקדמו לתחילת הסתגלות, עכברי מקום בדיאטה מוגבלת כדי לשמור על עכברים ב80-85% ממשקל גוף האכלה החופשי שלהם. תן 1 גרם של מזון לכל עכבר ליום. אם משקל גוף יורד מתחת להטווח שצוין לתת 2 גרם ליום, עד שהם יחזרו לטווח המתאים.
- מקום 2 ramekins בחזית של כל כלוב בבית על מנת לאפשר לעכברים להסתגל לסירי בדיקות. אלה הם אותם הכתמים משמשים לאימון בעכבר כדי לחפור לתגמול מזון.
- הוסף 2 גרם של מזון וחתיכת גמול מזון (מחצית פיסת דגנים בכל אחת) 1 בramekins כל יום במשך 4 ימים.
- אם התנהגות היא שיש לבצע בחדר נפרד מזו שבה העכברים הם שוכנו, המתחילים ביום 1 בהגבלת מזון, עכברי תחבורה לבדיקת החדר למשך שעה לפחות 1 ליום לפני החזרה לחדר הדיור כדי לאפשר להם להסתגל לחדר הבדיקות.
- ביום האחרון של הגבלת מזון, לפני תחילת ההסתגלות, לשנות את מצעי כלוב בבית. מצעי הכלוב לא ישתנו שוב עד לאחר הבדיקה תושלם כדי להפחית את הלחץ או חרדה שחוותה במהלך אימון ובדיקה (אלא אם כן הכרחית).
- לשמור עלעכברים בהגבלת מזון עד סוף הבדיקה. בימים 13-17, לתת אוכל עכברים לאחר הסתגלות, הכשרה, או בדיקה המבוססת על אומדן הסכום של גמול מזון הנצרך (1G בדרך כלל <של גלולה מזון).
5. הסתגלות (ימים 13-14)
- החל 2 ימים לפני תחילת אימון, לבצע הסתגלות במהלך המחזור הכהה תחת אור אדום.
- מורחים כמות קטנה של מצע מלוכלך מהכלוב בבית בתא, זה יהיה להפחית את הלחץ של להיות בסביבה חדשה על ידי הכנסה "בית-כלוב" מוכר או ריח "עצמי" לתא הבדיקה (אותו התא יהיה משמש לעכבר אחת למשך הדרכה ובחינות).
- הנח צלוחית נקייה עם מים באזור ההמתנה של החדר; עכברים נוטים שלא לאכול אם אין להם גישה למים.
- מניחים שני ramekins שנוצל להגבלת מזון באזור הבדיקה עם גמול מזון (~ 20חתיכת מ"ג דגנים) בכל אחד.
- מניחים את העכבר באזור ההמתנה; להסיר את שער ההתחלה ולאפשר העכבר כדי לחקור את התא עבור שעה 1.
- ברציפות להוסיף פרסי מזון (~ חתיכת דגנים 20 מ"ג) לramekins הריק במטרה לעודד עכברים כדי לחקור את אזור הבדיקה וסירים בתדירות גבוהה.
- ודא שהעכבר יכול לראות את הנסיין לאורך כל תקופת ההסתגלות, כך שהנוכחות של הנסיין הוא לא לחץ נוסף במהלך בדיקה.
6. הדרכה (יום 15)
- מניחים את העכבר באזור ההמתנה.
- הנח את ramekins הריק, וכל אחד מן גמול מזון (~ חתיכת דגנים 20 מ"ג), לאזור הבדיקה ולהרים את שער ההתחלה. לאפשר עכבר 3 דקות כדי לאחזר שני פרסי המזון. חזור על פעולה זו מספר פעמים.
- מוסיף בהדרגה מצעי כלוב נסורת / עכבר לסירים בניסויים הבאים. אפשר העכבר 3 דקות כדי לאחזר את גמול מזון מכל סיר לפני הסיום תלתאל. לאחר העכבר החזיר את גמול מזון מכל סיר, להמשיך לניסוי הבא. אם העכבר לא עושה ניסיונות לחפור בעבר את הפרס המזון מכוסה חלקית, רמזים עשויים להיות מסופקים (כלומר, מפזרים אבק דגנים מעל האזור של גמול המזון, להפוך indention בנסורת על שטח של גמול מזון, לחשוף חלק מ מזון גמול).
- המשך הוספת נסורת / מצעים אחרי כל משפט עד גמול המזון מכוסה באופן מלא והעכבר אמין מדגים את היכולת לחפור בסיר מלא כדי למצוא את גמול מזון.
- אם עכבר לא הוכיח את היכולת למצוא פרסי מזון בסיר מלא בשעה 2 של תחילת אימונים באופן מהימן, ימשיך ביום שני של אימונים. שמור את העכבר על הגבלת מזון ולחזור על הליך זה ביום שלמחרת.
- אם העכבר לא מצליח לחפור לתגמול מזון לאחר שני ימים רצופים, להוציא אותו מהשאר של הניסוי, ויסמנו כ" לא הצליח לחפור "בexpשיא erimental.
7. בדיקה (ימים 16-17):
- ביום אחד, לבדוק אפליה פשוטה (SD), אפליה כפולה (CD), היפוך (R1), ושינוי פנים-ממדי (IDS).
- ביום שני, לבחון את שינוי פנים-ממדי 2 (IDS2), משמרת תוך 3 ממדים (IDS3), היפוך 2 (R2; אופציונאלי), משמרת נוספת-ממדית (EDS).
- תקשורת זוג וריחות, כפי שמוצגים בטבלה 1.
- בעת טיפול ביום בדיקה, לתת עכברי גמול מזון אחד, כדי למנוע חוסר המיקוד במהלך בדיקה בשל רעב. מנקודה עד לסופו של יום הבדיקה זו, לא מספק שום מזון פרט תגמולים לבחירות נכונות.
- בתחילת הבדיקה, באמצעות מלקחיים (מגביל את התפשטות ריחות בין סירים), במקום חתיכת פרסי המזון בסיר המצביע על בחירה נכונה. גמול המזון צריך להיות מכוסה באופן מלא על ידי תקשורת (ראה איור 3). כדי להימנע מאות ריח מגמול המזון, מפזרים o אבק דגניםVer כל הסירים בתחילת השלב.
- מניחים את העכבר באזור ההמתנה עם שער ההתחלה נסגר. מניחים את הסירים בכל צד של חדר הבדיקות. המשפט מתחיל כאשר שער ההתחלה מוסר ואת השעון הוא התחיל. לאפשר לכל עכבר 3 דקות לכל משפט לעשות בחירה. רשום את הבחירה (נכונה או שגויה) והזמן עד שהעכבר עשה בחירה לכל ניסוי.
הערה: "בחירה" הוא הצביע על ידי ניסיון לחפור בכל סיר. חפירה נרשמה רק כבחירה אם העכבר שנעקר התקשורת ודקר את האף שלה רחוק מספיק במרחב זה יוצר למצוא את גמול מזון או נעקר מספיק של התקשורת לחשוף את גמול מזון. אם עכבר לא עשה בחירה בתוך 3 דקות, זה נרשם כברירה (שגויה). - ברגע שבחירה נעשתה לאו סיר, להסיר את הסיר שלא נבחר מחדר הבדיקה. אם בחירה נכונה נעשתה, לאפשר העכבר כדי לסיים את גמול מזון לפני הצבת העכבר בחזרה באזור ההמתנה. אם בחירה שגויה, לאפשר העכבר כדי לחקור את הסיר כדי להראות שאין שכר מזון לבחירה שלפני החזרת העכבר לאזור ההמתנה.
- בסוף כל משפט, הנח את העכבר בחזרה באזור ההמתנה ולהחליף את שער ההתחלה.
- ודא שהעכבר עומד בקריטריון של 8 ניסויים נכונים ברציפות כדי להתקדם לשלב הבא של AST. אם עכבר לא לקבל 8 בחירות נכונות ברציפות בתוך 50 ניסויים, הוא נכשל בשלב זה ולא יכול לזוז על מנת להשלים את הבדיקה. 6 רצופות ללא בחירות (3 דקות בלי בחירה) היא כישלון להשתתף ואוסרת על העכבר מעבר לשלב הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המדד התלוי הטיפוסי במבחן הזה הוא מספר הניסויים לבמה כדי לעמוד בקריטריון (או 8 בחירות רצופות נכונות). איור 4 א מציג את המספר הממוצע של ניסויים כדי לעמוד בקריטריון בכל שלב בC57BL / 6J שלא טופל באמצעות AST. כמו עכברים ליצור סט קשב על ממד הרמז הרלוונטי (ריח או תקשורת), ביצועים ישתפרו, כפי שצוינו על ידי הפחתה בניסויים כדי לעמוד בקריטריון במשמרות intradimensional רצופות, ושלבי היפוך ושינוי extradimensional ידרשו ניסויים נוספים כדי לענות קריטריון. חשוב לאזן את מספר בעלי החיים שמתחילים בכל אחד משני הממדים הרלוונטיים (כלומר, תקשורת או ריח) כפי שנצפינו הבדל כלשהו בשלב האפליה הפשוט באו לידי ביטוי בגידול במספר הניסויים לקריטריון אם הריח הוא רלוונטי קיו (איור 4). אם הניסויים כדי להגיע לקריטריון בשלב SD שונה באופן משמעותי בין השני ממדי אות רלוונטיים דואר (כלומר, ביצועים טובים יותר כאשר התקשורת היא רלוונטית כמו באיור 4), נתוני ביצועים לכל עכבר בשלבים שלאחר מכן יכולים להיות מנורמלים הביצועים שלו בשלב האפליה הפשוט. כפי שמודגם באיור 4C, צעד נורמליזציה זה מפחית שונות הקשורים בלמידת האות תחילה רלוונטית ומשפר הדמיה של ביצועים משופרים בשלבי IDS שלאחר מכן. למרות גדלי קבוצה ~ 20 עכברים יהיו מספיק כדי לאפשר ניתוח של נתונים גולמיים ללא נורמליזציה. חשוב לציין, גידול משמעותי בניסויים כדי לעמוד בקריטריון במהלך extradimentional המשמרת ביחס למשמרות intradimentional הקודמות מצביעה הוא אמצעי שליטה חשוב של תוקף המבחן (איור 4D & 4E). לפני שלב משמרת ED, עכברים ללמוד לשים לב לממד רמז רלוונטי יחיד (ריח או תקשורת) על מנת לאתר את הפרס. המתג לnew ממד אות רלוונטי, שלא היה רלוונטי בעבר, צריך לדרוש יותר ניסויים כדי להגיע לקריטריון, וכתוצאה מכך שינוי הזהות / ED. מעניין, ניתוח של שינוי הזהות / ED בתוך הנתונים הגולמיים גילה גידול משמעותי בניסויים כדי להגיע לקריטריון בין IDS2 וED (איור 4D), ומגמת עלייה בין IDS3 וED (מידע לא מוצג, p <0.1) ועלייה בין הניסויים הממוצעים להגיע קריטריון של IDS2 וIDS3 לעומת ED (מידע לא מוצג). מעניין, שינוי הזהות / ED משמעותי היה, לכאורה, בין שני IDS2 וIDS3 לעומת ED כאשר הנתונים היו מנורמלות ביצועים בשלב SD (איור 4E).
צפוי כי כ 70-80% מעכברי שליטה ישלימו את כל המשימות (20-30% שיעור נשירה). אמצעים תלויים אלטרנטיביים כוללים השהיה ממוצעת לעשות בחירה, כפי שנמדדו בכל שלב של המשימה (אם כי מצאנו את זה כדי להיות משתנה מאוד בין עכברים),מספר כולל של שגיאות ומספר השגיאות "הגדרת אובדן" בהיפוך ושלבי משמרת נוסף-ממדיים כהגדרתו על ידי et Lapiz-בלום אל. 14 כמספר פעמים בחירה שגויה התקבלה בעקבות שלוש או יותר ברציפות בחירות נכונות. מספר גדל של טעויות "הגדרת אובדן" עשוי להצביע על התנהגות עקשנית. בנוסף, עכברים בדרך כלל להשלים כל שלב של בדיקות בפחות מ -30 דקות (איור 5), וכן את משך זמן מושקע בכל שלב הוא פונקציה של ניסויים כדי להגיע לקריטריון.
במחקר קודם באמצעות פרדיגמה דומה כמפורט כאן, נגעים רעילים לOFC או mPFC בעכברים הראו לפגוע בביצועים בשלבי שינוי ההיפוך וחוץ-ממדי בהתאמה, תיקוף השימוש בבדיקה זו כדי לקבוע גירעונות תפקודיים ב אותו אזורים כעכברוש וstudies11 הפרימטים שאינם בני אדם. בעוד הרצף של המשימות בv המחקר האמורaries מעט שמוצג כאן, צפוי כי נגעים או גירעונות בOFC וmPFC גם לגרום לביצועים לקויים בR1 וEDS, כפי שמשתקפים בעלייה במספר הניסויים לקריטריון בשלבים אלה. .
| שלב | רלוונטי | דוגמאות | רלוונטי | דוגמאות | ||
| אפליה פשוטה (SD) | בינוני | הרגיש (+) | נייר (-) | ריח | מוסקט (+) | רוזמרין (-) |
| מתחם אפליה (CD) | בינוני | הרגיש (+) / מוסקט | נייר (-) / רוזמרין | ריח | מוסקט (+) / Felt | רוזמרין (-) / נייר |
| הרגיש (+) / רוזמרין | נייר (-) / מוסקט | מוסקט (+) / נייר | הרוזמרין (-) / Felt | |||
| היפוך 1 (R1) | בינוני | נייר (+) / רוזמרין | הרגיש (-) / מוסקט | ריח | רוזמרין (+) / נייר | מוסקט (-) / Felt |
| נייר (+) / מוסקט | הרגיש (-) / רוזמרין | רוזמרין (+) / Felt | מוסקט (-) / נייר | |||
| Shift Intradimensional (IDS) | בינוני | Pompoms | פאייטים (-) / ציפורן | ריח </ Td> | קינמון (+) / pompoms | ציפורן (-) / פאייטים |
| (+) / קינמון | ||||||
| Pompoms (+) / ציפורן | פאייטים (-) / קינמון | קינמון (+) / פאייטים | ציפורן (-) / pompoms | |||
| IDS2 | בינוני | Pipecleaners | עיני googly (-) / ג'ינג'ר | ריח | קורנית אדומה (+) / Pipecleaners | ג'ינג'ר (-) / עיני googly |
| / תימין אדום (+) | ||||||
| Pipecleaners (+) / ג'ינג'ר | עיני googly (-) / תימין אדום | קורנית אדומה (+) / עיני googly | ג'ינג'ר (-) | |||
| IDS3 | בינוני | סרט (+) / וניל | רצועות מתכת (-) / לימון | ריח | וניל (+) / רצועת כלים | לימון (-) / רצועות מתכתי |
| סרט (+) / לימון | רצועות מתכת (-) / וניל | וניל (+) / רצועות מתכתי | לימון (-) / רצועת כלים | |||
| R2 | בינוני | רצועות מתכת (+) / וניל | סרט (-) / לימון | ריח | לימון (+) / רצועת כלים | וניל (-) / רצועות מתכתי |
| רצועות מתכת (+) / לימון | סרט (-) / וניל | לימון (+) / מתכת רצועות Lic | וניל (-) / רצועת כלים | |||
| Shift Extradimensional (EDS) | ריח | לימונית (+) / רפיה | אניס (-) / קצף | בינוני | רפיה (+) / לימונית | קצף (-) / אניס |
| לימונית (+) / קצף | אניס (-) / רפיה | רפיה (+) / אניס | קצף (-) / לימונית | |||
טבלת 1. שילובי דוגמא של ריח ובינוני לחפור. הריחות ותקשורת לחפור בשילובים אלה אומתו במחקר זה. נציגי תוצאות שהושגו באמצעות שילובים ספציפיים אלה מוצגות באיור 2.
hres.jpg "/>
חדר בדיקות 1. AST איור. תמונה () וממדים של צלוחית ודוגמה למיקום נייר סינון. תמונה (B) של חדר בדיקות AST המותאם לעכברים ושלושה תרשים ממדי של חדר הבדיקות הממחיש מיקום של חורים במחיצה (C).
איור 2. חפירה בינונית. דוגמאות לחפירת זוגות בינוניים בשימוש בפרוטוקול זה כמפורט ברשימת החומרים (ii.-xi.). סירים מלאים כ לשפה הפנימית בחפירה בינונית.
איור 3. ציר זמן לבדיקה.
איור 4. C57Bl / 6J ביצועים בAST. (א) מספר הממוצע של ניסויים כדי לעמוד בקריטריון בAST לזכר עכברי C57BL / 6-י. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 22 עכברים / קבוצה), p = 0.013 להשפעה העיקרית של שלב. המספר הממוצע של ניסויים כדי להגיע לקריטריון בשלב SD לממדי אות ברורים ראשוניים רלוונטיים (B). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 22 עכברים / קבוצה), * p = 0.01. נתונים מנורמלים (C) המיוצגים כאחוז מביצועים האישיים של כל עכבר בשלב SD. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 22 עכברים / קבוצה), p = 0.06 להשפעה העיקרית של שלב. שינוי הזהות / ED (ד ') בניסויים כדי להגיע לקריטריון בין IDS2 וED. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 22 עכברים / קבוצה), * p = 0.03. שינוי הזהות / ED (E) בנתונים מנורמלים בין IDS3 וED. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 22 עכברים / קבוצה), * p = 0.012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גירעונות בגמישות קוגניטיבית בתיווכו של PFC מייצגים נכות משמעותית קשורה עם מגוון של הפרעות נוירולוגיות ונוירו-פסיכיאטריות, ויכולים להיות השפעה גדולה על תוצאות ואיכות חיים של אנשים הסובלים מהפרעות אלה. אופטימיזציה של AST לשימוש בעכברים היא חיונית לחקירת הבסיס הגנטי במחלות מצמידים את המוח הקדם חזיתית תפקוד הקוגניטיבי בתיווך בקליפת המוח. מצאנו כי השיטה שתוארה לעיל היא מדד אמין של גירעון קוגניטיבית ספציפי, גמישות קוגניטיבית, וקרוב מאוד לתוצאות שהושגו באמצעות משימה זו בחולדות וקופים שאינם בני אדם. השיטה המתוארת היא התוצאה של סקר מקיף של פרוטוקולים שתוארו קודם לכן בחולדות ועכברים, כמו גם ייעוץ והכוונה של מומחים במוסד שלנו.
דיווחים קודמים באמצעות משימות דומות בעכברים הראו את יכולת ההתאמה של מידה התנהגותיות כגון, אם כי בכמה אזהרות 2,6,11. Colacicco et al. הגביל את מספר ההבחנות נבדקו ליום ל 2, שהתפשטו בדיקה על פני תקופה של ארבעה ימים 11. זה כלל חזרות של זוגות גירויים למדו בעבר בימי בדיקה רצופים. בעוד יעיל, במטרה לפתח הפרוטוקול המובא כאן היא למזער את משך תקופת הבדיקות ולמקסם את היעילות. הנה, אנחנו מגבילים את הבדיקה לתקופה של יומיים ולחסל חזרות של זוגות גירויים למדו בעבר. חוקרים קודמים ציינו כי עכברים דורשים לגרום לאימון יתר כדי ליצור סט קשב ולהפגין "חלון של בחינות" קטן שבו הם יהיו לשמור להגיב מאומצים. הפרוטוקול שלנו כרוך גם באימון יתר צנוע במשמרת intradimensional בתוך ממד האות תחילה הרלוונטי. במיוחד כאשר בוחנים את הנתונים מנורמלים באיור 4C, נראה עכברים שנבדקו בפרוטוקול שלנו, עשוי להציג גירעון duri בולט יותרng ההיפוך השני intradimensional (יחסית לשלב הקודם באופן מיידי). תצפית זו עולה בקנה אחד עם הרעיון של לגרום לאימון יתר כדי להבטיח היווצרות סט קשב, כמו עכברים גם הציגו שינוי הזהות / ED. אפשרות אחת, מדוע עכברים לקיים ביצועים מאומצים בפרוטוקול שלנו (איור 5), הכולל אורך חיבור ממוצע של 2 שעות, יכולה להיות בגלל ניצול של מחזור אור הפוך. בדקנו התנהגות בחדר בדיקות מבודדת וייעודי בתנאי תאורה אדומים בארבע השעות הראשונות של המחזור הכהה (הער). עם זאת, בדיקה שיטתית מחוץ להיקף של כתב יד בשיטה זו תהיה צורך לקבוע מה גורמים תורמים לזמן שבו עכברים ימשיכו לבצע AST, ואם גירעונות באפלית חוש הריח חשודים, prescreening עשוי להיות מוצדק לפני הבדיקה כחלופית מתודולוגיות נטולות ריח כבר דיווחו.
בנוסף, במהלךפיתוח השיטה הראשוני, גילו שעכברים צעירים למבוגרים (8-12 בן שבוע) הופיעו עם שונות גדולות יותר שעכברים ישנים 4-6 חודש מעט מבוגרים. אנו משערים כי פרוטוקול הגבלת מזון משפיע על גידול עכברים שונים מעכברים בוגרים יותר, ובזמן, במובן קלאסי התפתחות נוירולוגית, מוח העכבר נחשב מפותח על ידי 6 שבועות, ייתכן שהמעבר מגיל ההתבגרות לבגרות מבוגרת והבגרות המוקדמת שיפוץ הסינפטי בביצועי AST לבלבל קליפת מוח הקדם חזיתית בעכברים צעירים. עם זאת, שאלות המרתקות אלה יישארו כדי להיחקר.
וריאציות אחרות של פרוטוקולי AST בעכברים כוללות ניסויים "חופשיים", כלומר למספר מוגדר של ניסויים (בדרך כלל 4) בתחילת כל שלב לא כבש, ובעלי החיים מותר לחקור את שני הסירים עד הגמול מאוחזר. הפרוטוקול המפורט כאן אינו כולל כל ניסויים "חופשיים". בנוסף, אנו קובעים את requiremeNTS לפגוש (8 ניסויים נכונים ברציפות לקריטריון במקום שתואר קודם לכן 8/10 ניסויים כדי לעמוד בקריטריון) קריטריון מחמירים יותר ומצאו כי מדובר באינדיקטור יעיל אם את החיה באמת למדה את הכלל. גארנר et al. הראה כי תקופה של אימון יתר הבא IDS (כלומר, הצגה של הגירויים הרלוונטיים בעבר עבור 50 ניסויים נוספים) גדלה באופן משמעותי את הניסויים לקריטריון בEDS 2. כאן, אנו כוללים משמרות פנים-ממדיות מרובות, במאמץ "overtrain" ולהבטיח את הקמתה של קבוצת קשב בממד הרלוונטי, בהסכם עם et al Bissonette. 6. בנוסף, גארנר et al. הפעלות בדיקה מוגבלות לכ 1 שעות (או כאשר העכבר לא הגיב) 2, ואילו מצאנו כי עכברי C57BL6 / J כראוי ובאופן אמין להתקדם דרך כל ארבעת השלבים שהוצגו בפניהם בכל יום בכ תקופת שעה 2 (לשליטהעכברים). אמנם, הבדלים אפשריים ביכולת המוטורית בין קבוצות ניסוי יש לשקול בעת לפרש את הביצועים. ההליך שלנו מגביל את הזמן ועבודת ההשקעה ל -17 ימים עבור כל חיה מההתחלה של טיפול באמצעות השלמת הבדיקה. מומלץ כי הנסיין פרט להגביל את מספר העכברים שנבדקו ביום אחד ללא יותר מ 2 (זה יכול להיות שונה המבוסס על יכולת אישית הנסיין וניסיון), המאפשר לניסוי יחיד היכולת להשלים בדיקות על לפחות 6 עכברים בשבוע. אם התפקוד מוטורי הנו פגום במקצת, את אורכו של כל ניסוי יכול להיות מוגבר, כנכון להגיב, לא מהירות של תגובה, הוא המשתנה התלוי מפתח.
אפליה חזותית פרדיגמות דומות לאלה שהיו בשימוש על מנת להעריך את הביצועים קוגניטיביים בפרימטים לא אנושיים לאחרונה הותאמו לשימוש במכרסמים, והוא יכול לשמש כתחליף לריח וdiscriminatio הבינוניn משימות שתוארו כאן. גישה זו עשויה להיות נחוצה אם הבדלים משמעותיים באפלית חוש הריח נמצאים בין קבוצות ניסוי של עכברים. Brigman et al. הראה כי עכברים בקלות להבחין בגירויים חזותיים מתחם בפרדיגמה זהות ושינוי ED 15. למרות ששיטה זו טובה יותר אוטומטית מייצגת את המבחן המועסק ללמוד תפקוד קליפת מוח הקדם חזיתית בבני אדם ופרימטים שאינם בני אדם, את העלות של תאים אופרנטית ומסכי מגע הנדרשים לביצוע בדיקה אוטומטית זה בעכברים יכולה להיות מונעת.
מומלץ כי ההתנהגות להתבצע באופן עקבי ככל האפשר לכל עכבר, כלומר, התרגלות, הכשרה ובדיקה צריכה להתבצע באותו הזמן של יום עבור כל בעלי חיים. יתר על כן, חדר ההתנהגות צריך להישאר ללא שינוי לאורך כל הניסוי, מה שהופך את השימוש בחלל משותף / קהילה בעייתית עקב זרימה בלתי נשלטת תנועה, מבוא ריח, וכו 'אם בעלי חיים הם להיות מועבריםמחדר דיור לחדר התנהגות מרוחק (כמו במקרה כאן), באותו המסלול יש לנקוט בכל פעם. חדר ההתנהגות צריך להיות באזור שבו הנסיין ובעלי החיים לא יפריעו במהלך הליך הבדיקה. אם הנסיינים מרובים מבצעים את המשימה באותו החדר, כניסה ויציאה מהחדר צריך להיות מוגבל ככל האפשר כדי להימנע מכל רעשים חזקים או שיבוש שעלול להגביר את המתח או החרדה של בעלי החיים במהלך בדיקה. בנוסף, הנסיינים צריכים להיות זהירים בהסרת והחלפת שער ההתחלה, כמו גם את הסירים לתוך ומחוץ לתא כדי ליצור רעש קטן כמו ושיבוש אפשרי. ניסויים שבוצעו בחולדות הראו כי ביצועי AST יכולים להיות מופרים על ידי גורמי לחץ שונים.
ריחות של הסירים צריכים להתבצע בכל שבוע ובו ביום בכל שבוע, לפחות 2 ימים לפני יום הבדיקה הראשון. מומלץ הסירים ריחניים בבאר-ventאזור ilated מחוץ לאזור שבו הבדיקה היא שיש לבצע (למשל מעבדה נפרדת, מסדרון, מנדף). זה יעזור למנוע זיהום צולב של הריחות ונמנע מלבלבל את העכברים עם ריחות שהם לא חלק מהמבחן. בנוסף, לפני ובמהלך הבדיקה, ריחות חזקים שעלול להסיח את דעת בעלי החיים מהאפליה (כלומר, הצריכה של מסטיק או קפה בסמוך למועד בדיקה, בושם חזק / דאודורנט, וכו ') יש להימנע מהסיבה הנ"ל. צריכים הנסיינים רוצים להשתמש במדיום חפירה חלופי ממה שמתואר בפרוטוקול זה, מומלץ שיהיה בינוני של צפיפות דומה ומשקל לזה שתואר כאן (משקל / צפיפות מוגזמת מקשה על העכבר כדי לחפור במידה מספקת). לדוגמא, מצאנו כי חרוזי פלסטיק קטנים לא היו מתאימים, כי הם היו קשים לעכברים לדחוף הצידה. בנוסף, בכל מדיה עם ריח חזק מאוד (לדוגמא., רצועות גומי וחלק plastחומר ic) אינו מתאים מכיוון שהוא עלול להפריע ליכולת לזהות את הריחות שנבדקו.
הדרכה ובדיקה של עכבר בודד צריכה להתבצע על ידי הנסיין אחת, עם זאת הסתגלות יכולה להיעשות על ידי כל ניסוי, כל עוד הם השתתפו בטיפול. כל הסירים לשימוש בארבעה השלבים שבוצעו בכל יום צריך להיות בהישג יד כדי להגביל את כמות זמן החיה באזור ההמתנה בין שלבים. זה יעזור לשמור על תשומת הלב של העכבר על כל משימה. יתר על כן, ברגע שהחלו בדיקות חשוב לא להפסיק עד להשלמת המשימות לאותו יום של בדיקה (כלומר, כל 4 שלבים בכל יום בדיקה יש להשלים ברציפות).
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות מפורטות למתודולוגיים ניצול יעיל של AST למדוד תפקוד המוח הקדם חזיתית בקליפת המוח תלויה קוגניטיבית בעכברים, ובם תיאורניתוח נתונים ואזהרות פוטנציאליות. מגוון רחב של שיטות AST עכבר מדווחים בספרות העיקרית, כל אחד עם פירוט פרוצדורליים השונה משלו. הצימוד הייחודי של שני המידע מבוסס הטקסט ויזואלי יהיה מועיל במיוחד עבור חוקרים המנסים לשלב assay התנהגות זו העוצמה לתוך הרפרטואר המדעי שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקי R01-MH090127, P30-MH089868 מהמכון הלאומי לבריאות נפש ומספר הפרסים UL1TR001120 מהמרכז הארצי לקידום מדעי Translational. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIMH או NCATS. בנוסף, ברצוננו להודות ד"ר דוד Morilak בהכרת תודה למומחיות רב הערך שלו הבמנחה את פיתוח השיטה המוקדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
