La Task attenzionale Set Shifting: una certa flessibilità cognitiva nei topi

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di effettuare un test comportamentale, come il set attenzionale spostamento compito (AST) per valutare prefrontale flessibilità cognitiva cortex-mediata nei topi.

Introduction

Il set attenzionale spostamento compito (AST) è stato sviluppato come una misura di attenzione e flessibilità cognitiva in ratti oltre un decennio fa ^1,2. AST è modellato il componente intradimensional / extradimensionale di Cambridge Neuropsychological prova Automated Battery (Cantab), che viene utilizzato per identificare disfunzioni cognitive negli esseri umani e primati non umani ^3,4. Mentre la capacità di imparare semplici regole rimane intatto, deficit di apprendimento di modificare una risposta quando le regole sono cambiate si trovano nei pazienti affetti da una serie di disturbi neuropsichiatrici (cioè, la schizofrenia, disturbo ossessivo-compulsivo, depressione), malattie neurodegenerative (ad esempio, morbo di Parkinson) e in pazienti con lesioni alla corteccia prefrontale ^5. Più in generale, questi pazienti sono descritti come aventi deficit nella flessibilità cognitiva. Deficit analoghe sono state esposte in entrambi i primati non umani e roditori quando le lesioni to la corteccia prefrontale sono stati indotti ^1,6-8. Questi deficit indicano uno stato di rigidità cognitiva o una compromissione della capacità di spostare set attenzionale.

Un set attentivo si forma quando un soggetto apprende che un insieme di regole può essere applicato a stimoli complessi per differenziare pertinente spunti irrilevanti. Ad esempio, nel AST, gli animali imparare a prestare attenzione e rispondere alla cue utile (cioè, media scavando) e ignorare un cue irrilevante (cioè, odore), accoppiando un premio alimentare con il mezzo. Questa associazione è poi rafforzato in attività successive in cui il tipo di scavare medie e odore cambia, ma l'associazione accoppiamento tra medio e ricompensa rimane. Questa regola rinforzato forma un set cognitivo. Due tappe all'interno degli aspetti misura protocollo AST di flessibilità cognitiva: inversione e il turno extra-dimensionale. Nella fase di inversione, gli stimoli precedentemente negativi all'interno di una dimension (media in questo esempio) è ora positivo, che sfida l'animale di ignorare gli stimoli positivi della fase precedente. Ad esempio, se a medio scavando sentito era stimoli positivi nella fase precedente e carta era stimoli negativi, ora è vero il contrario. Questa sfida flessibilità dell'animale in quanto deve mantenere il set attenzionale (cioè di media è la dimensione del caso), mentre alterando la regola appresa per stimolo e coppia di ricompensa in una dimensione. La formazione di un insieme attentivo è contestata nella fase turno extra-dimensionale, quando la dimensione irrilevante (odore in questo esempio) diventa la dimensione rilevante. Una risposta perseverative, come indicato da una scelta continua utilizzando la regola precedentemente appreso, sia a fase riflette un deficit di flessibilità cognitiva.

Studi lesione sia primati non umani e roditori hanno mostrato specifiche regioni della corteccia prefrontale può essere attribuito alla capacità di Perform particolari fasi della AST ^1,9. Lesioni della corteccia orbitofrontale (OFC), una subregione della corteccia prefrontale (PFC), hanno dimostrato di indurre deficit di inversione di apprendimento sul AST ^8. Inoltre, le lesioni alla corteccia prefrontale mediale (MPFC) portano a difficoltà specifiche di svolgimento del turno extra-dimensionale.

Mentre numerosi studi che utilizzano l'AST sono stati condotti su ratti e primati non umani, relativamente pochi hanno utilizzato AST come misura della funzione cognitiva nei topi. Data la facilità di manipolazione genetica nei topi, e la necessità critica per misurare la funzione della corteccia prefrontale in studio di una serie di disturbi, adattare e convalidare questa misura comportamentale nei topi è un'aggiunta importante per la ricerca sulle malattie associate a disfunzione PFC. Il protocollo qui descritto è una modifica della procedura da Birrell e Brown ^1, ottimizzato per applicazioni nei topi e riflette molti dei mouse specifiadattamenti c che sono stati precedentemente segnalati ^2,6,10-13.

Protocol

NOTA: Gli animali utilizzati in questo studio sono di sesso maschile C57Bl / 6J tra i 4 ei 6 mesi di età per ottenere risultati ottimali. I topi vengono mantenuti in un ciclo luce di retromarcia per testarle comodamente durante la fase attiva (scuro). Se il comportamento viene eseguito in una stanza separata dal corpo, i topi sono ammessi almeno 1 ora per acclimatarsi dopo il trasporto a sala prove. Test comportamentale viene effettuata in condizioni di luce rossa minimizzare i disagi alla normale attività dei topi il meno possibile, pur consentendo lo sperimentatore adeguata illuminazione di monitorare visivamente la sessione di test.

NOTA: Tutti gli aspetti della procedura sperimentale qui descritta sono stati effettuati in accordo con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8 ° edizione (NRC) e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università del Texas Health Science Center at San Antonio.

1. Riempire stampini in ceramica (non-poroso; 1.5 "x 2.5 profondità 'di diametro), a bordo interno con scavo medio (circa 1" dal basso); turni di carta filtro taglia a metà e attaccata al suo interno posteriore del ramekin (Figura 1A)
2. Rompere leggermente zuccherato cereali secchi colazione (cibo ricompensa) - Honey Nut o varietà confetti, in circa 20 pezzi mg per le fasi di acclimatazione, di formazione e di prova.
3. Fare un set attenzionale spostamento compito (AST) camera (Figura 1B): Acclimatare treno e testare ogni mouse nelle singole camere; consiglia produzione di almeno 8 camere.
   1. Costruire un 12 "x 8" x 7 "camera di AST; pareti e cancelletto di partenza fatte opaco acrilico bianco che è facile da pulire con il 70% di etanolo. Lo stile ghigliottina, cancello partenza rimovibile separa camera in una zona di attesa (5 "x 8") e l'area di test (7 "x 8").
   2. Includere un Clear 5221; x7 "amovibile che separa due lati della zona di prova in modo uniforme; tagliare tre ¼ "diametro buca in parte inferiore del divisorio per consentire l'accesso fiuto, distanziati 1" a parte e 1 "dalla parte anteriore della partizione (Figura 1C).

2. Panoramica della procedura (Figura 2)

1. Prima di AST, topi casa individualmente e permettere loro di adattarsi a un ciclo di luce d'inversione per almeno una settimana.
2. Ambientarsi, treno e testare ogni animale in singole camere di test. Assegnare ciascuna camera ad un mouse e pulire con il 70% di etanolo dopo aver terminato l'ultimo giorno di test. Questo ridurrà al minimo lo stress durante i test, rendendo l'odore da camera come "casa-gabbia" o "auto".
3. Profumo le pentole test due giorni prima del test per permettere al profumo di dissipare; topi non scaverà in vasi che hanno un odore molto forte. Usando una siringa con un ago 25 G, aggiungere circa 0,1 ml diolio essenziale all'inizio della carta da filtro.

3. Gestione (Giorni 1-8)

1. Maneggiare topi a partire 8 giorni prima del primo giorno di restrizione alimentare. Ciò consentirà di ridurre lo stress associato con la gestione durante i test.
2. Pesare e peso corporeo registrare ogni giorno di trattamento. Maneggiare ogni mouse 2-3 minuti al giorno.
3. Se più sperimentatori devono essere coinvolti nella verifica di una serie di topi, in modo che ogni sperimentatore partecipa al processo di gestione per aumentare la familiarità con gli sperimentatori e ridurre lo stress e l'ansia con esperienza in materia di formazione o di giorni di test.
4. Continuare movimentazione e registrazione pesi tutta la durata della prova.

4. restrizione alimentare (Giorni 9-12)

1. Cominciando 4 giorni prima dell'inizio di acclimatazione, posto mouse su una dieta ristretta per mantenere i topi al 80-85% del loro peso corporeo alimentazione gratuito. Dare 1 grammo di alimento per topo al giorno. Se il peso corporeo scende al di sottol'intervallo specificato dare 2 grammi al giorno fino al ritorno alla gamma appropriata.
2. Mettere 2 stampini nella parte anteriore di ogni gabbia casa per consentire topi per acclimatarsi alle pentole di prova. Questi sono gli stessi punti utilizzati per addestrare il mouse per scavare per una ricompensa in cibo.
3. Aggiungere 2 grammi di cibo e 1 pezzo di ricompensa alimentare (metà un pezzo di cereali in ciascuna) negli stampini ogni giorno per 4 giorni.
4. Se il comportamento deve essere eseguita in una camera separata da quella in cui i topi sono alloggiati, a partire dal giorno 1 di restrizione alimentare, topi trasporto verso la camera di prova per almeno 1 ora al giorno prima di ritornare alla camera dell'alloggiamento per consentire loro di acclimatarsi alla sala prove.
5. L'ultimo giorno di restrizione alimentare, prima dell'inizio di acclimatazione, cambiare la biancheria da letto gabbia di casa. La biancheria da letto gabbia non sarà cambiato di nuovo fino a dopo la prova è completa per ridurre lo stress o l'ansia vissuta durante l'allenamento e test (se non assolutamente necessario).
6. Manteneretopi sulla restrizione alimentare fino alla fine del test. Nei giorni 13-17, dare da mangiare topi dopo acclimatazione, la formazione, o test sulla base di una stima della quantità di cibo consumato ricompensa (in genere <1 g di pellet alimentare).

5. acclimatazione (Giorni 13-14)

1. Inizio 2 giorni prima dell'inizio della formazione, eseguire acclimatazione durante il ciclo di buio sotto una luce rossa.
2. Stendere una piccola quantità di biancheria sporca dalla gabbia di casa nella camera, questo ridurrà lo stress di essere in un nuovo ambiente, introducendo un familiare "casa-gabbia" o "sé" odore della camera di prova (stessa camera sarà utilizzato per un singolo mouse per la durata della formazione e test).
3. Posizionare un ramekin pulito con acqua nella sala d'attesa della camera; topi tendono a non mangiare se non hanno accesso all'acqua.
4. Posizionare le due stampini che sono stati utilizzati per la restrizione alimentare nell'area test con una ricompensa alimentare (~ 20piece cereali mg) in ciascuna.
5. Posizionare il mouse nell'area di attesa; rimuovere il cancelletto di partenza e lasciare il mouse per esplorare la camera per 1 ora.
6. Continuamente aggiungere ricompense alimentari (~ 20 mg pezzo di cereali) agli stampini vuoti al fine di incoraggiare i topi per esplorare la zona di prova e le pentole frequentemente.
7. Assicurarsi che il mouse può vedere sperimentatore tutto il periodo di acclimatazione modo che la presenza dello sperimentatore non è un fattore di stress aggiunto durante la prova.

6. Formazione (Giorno 15)

1. Posizionare il mouse nell'area di attesa.
2. Mettere gli stampini vuoti, ognuno contenente una ricompensa alimentare (~ 20 mg pezzo di cereali), nella zona di test e sollevare il cancelletto di partenza. Lasciare il mouse 3 min a recuperare entrambe le ricompense alimentari. Ripetere questa operazione più volte.
3. Aggiungere gradualmente assestamento gabbia segatura / mouse per le pentole in prove successive. Lasciare il mouse 3 min per recuperare la ricompensa cibo dal piatto prima di terminare la trial. Una volta che il mouse ha recuperato la ricompensa cibo dal piatto, procedere alla prova successiva. Se il mouse non fa tentativi di scavare una volta la ricompensa cibo è parzialmente coperto, suggerimenti possono essere previste (ad esempio, cospargere di polvere cereali su area della ricompensa alimentare, fare un rientro nella segatura sopra l'area di cibo ricompensa, scoprire una parte del ricompensa alimentare).
4. Continuare ad aggiungere segatura / assestamento dopo ogni prova fino a quando la ricompensa cibo è completamente coperto e il mouse dimostra affidabile la capacità di scavare in una pentola piena di trovare la ricompensa cibo.
5. Se un mouse non è affidabile dimostrato la capacità di trovare una ricompensa alimentare in una pentola piena in 2 ore di inizio della formazione, continuano ad una seconda giornata di formazione. Mantenere il mouse sulla restrizione alimentare e ripetere la procedura il giorno successivo.
6. Se il mouse non scavare un premio cibo dopo due giorni consecutivi, escluderlo dal resto dell'esperimento, e annotare come "impossibile scavare" nel exprecord di erimental.

7. Testing (Giorni 16-17):

1. Il primo giorno, test di discriminazione semplice (SD), la discriminazione composto (CD), inversione (R1), e lo spostamento intra-dimensionali (IDS).
2. Il secondo giorno, prova lo spostamento intra-dimensionale 2 (IDS2), spostamento intra-dimensionale 3 (IDS3), inversione di 2 (R2, optional), cambio extra-dimensionale (EDS).
3. Coppia supporti e profumi come indicato nella tabella 1.
4. Al momento della movimentazione in giornata di test, i topi dare una ricompensa alimentare per evitare una mancanza di attenzione durante i test a causa della fame. Da questo punto fino alla fine della giornata test, non forniscono alcun cibo tranne ricompense per scelte corrette.
5. All'inizio del test, usando pinze (limita la diffusione di profumi tra pentole), inserire un pezzo di ricompensa cibo nel piatto che indica una scelta corretta. La ricompensa cibo deve essere completamente coperto dai media (vedi figura 3). Per evitare spunto profumo della ricompensa alimentare, cospargere di polvere o di cerealiver tutti pentole all'inizio della tappa.
6. Posizionare il mouse nella zona di attesa con il cancelletto di partenza chiuso. Posizionare i vasi su entrambi i lati della camera di prova. Il processo inizia quando il gate di partenza viene rimosso e il temporizzatore viene avviato. Consentire ogni mouse 3 min per prova a fare una scelta. Registrare la scelta (giusta o sbagliata) e tempo fino il mouse ha fatto una scelta per ogni prova.
   NOTA: A "scelta" è indicato da un tentativo di scavare in entrambi piatto. Un scavo viene registrata solo come una scelta se il mouse ha spostato i media e infilò il naso abbastanza lontano nello spazio che crea per trovare la ricompensa cibo o abbastanza sfollati del supporto per scoprire la ricompensa cibo. Se il mouse non ha fatto una scelta nel raggio di 3 min, questo viene registrato come scelta (non corretta).
7. Una volta scelta è stata fatta per entrambi pentola, togliere la pentola non è stato scelto dalla camera di prova. Se è stata effettuata una scelta corretta, permettere al mouse per terminare la ricompensa cibo prima di rimettere il mouse inl'area di attesa. Se si effettua una scelta errata, permettere al mouse per esplorare la pentola per dimostrare che non vi è alcuna ricompensa alimentare per questa scelta prima di restituire il mouse per la sala d'attesa.
8. Alla fine di ogni prova, posizionare il mouse posteriore nell'area di attesa e sostituire il gate di partenza.
9. Assicurarsi che il mouse soddisfa il criterio di 8 prove corrette consecutivamente per passare alla successiva fase di AST. Se il mouse non ottiene 8 scelte corrette consecutivamente in 50 prove, non riesce questa fase e non può passare per completare il test. 6 consecutivi non scelte (3 min senza scelta) è una mancata partecipazione e vieta il mouse da passare alla fase successiva.

Representative Results

La misura dipendente tipico in questa prova è il numero di prove per ogni fase per soddisfare il criterio (o 8 corrette scelte consecutive). La figura 4A mostra il numero medio di prove per soddisfare il criterio in ogni fase trattata C57BL / 6J utilizzando la AST. Come topi formano un insieme attentivo sulla dimensione cue rilevante (odore o media), prestazioni miglioreranno, come indicato da una riduzione in studi per soddisfare criteri in turni intradimensional successive, e le fasi di inversione e spostamento extradimensionale richiederà prove aggiuntive per soddisfare il criterio. È importante controbilanciare il numero di animali che inizia su ciascuna delle due dimensioni rilevanti (cioè, supporti o odore) abbiamo osservato una certa differenza nella semplice fase discriminazione riflette in un aumento del numero di prove per criterio se odore è pertinente cue (Figura 4B). Se le prove di raggiungere il criterio in fase di SD sono significativamente differenti tra the due dimensioni cue rilevanti (ad esempio, prestazioni migliori quando il supporto è rilevante come in Figura 4B), dati di performance per ogni mouse durante le fasi successive possono essere normalizzati alle sue prestazioni durante la semplice fase di discriminazione. Come illustrato nella Figura 4C, questo passaggio normalizzazione riduce variabilità associata con l'apprendimento della stecca inizialmente rilevante e migliora la visualizzazione di migliorare le prestazioni in fasi successive IDS. Anche se le dimensioni dei gruppi di ~ 20 topi saranno sufficienti a consentire l'analisi dei dati grezzi, senza la normalizzazione. È importante sottolineare che un aumento significativo nei processi per soddisfare criteri durante il turno extradimentional rispetto ai precedenti turni intradimentional indica è una misura importante controllo della validità di test (Figura 4D e 4E). Prima della fase di spostamento ED, topi imparano a prestare attenzione a una sola dimensione spunto rilevante (odore o media) al fine di individuare la ricompensa. Il passaggio a una new dimensione spunto rilevante, che in precedenza era irrilevante, dovrebbe richiedere più prove per raggiungere il criterio, con un conseguente spostamento ID / ED. È interessante notare che l'analisi dello spostamento ID / ED all'interno dei dati grezzi ha rivelato un aumento significativo nelle prove di raggiungere criterio tra IDS2 e ED (Figura 4D), e tendenza verso un aumento tra IDS3 e ED (dati non mostrati, p <0,1) e un aumento tra le prove medi raggiungere criterio IDS2 e IDS3 rispetto ED (dati non mostrati). È interessante notare che, un significativo spostamento ID / ED era evidente tra i due IDS2 e IDS3 rispetto ED quando i dati sono stati normalizzati per le prestazioni in fase di SD (figura 4E).

Si prevede che circa il 70-80% dei topi di controllo completerà l'intera attività (drop out tasso 20-30%). Misure dipendenti alternative includono latenza media di fare una scelta misurata in ogni fase del compito (anche se abbiamo trovato che questo è molto variabile tra i topi),numero totale di errori e il numero di errori "set-perdita" al rovesciamento e le fasi di spostamento extra-dimensionali come definito da Lapiz-Bluhm et al. ¹⁴ come il numero di volte che una scelta non corretta è stata fatta a seguito di tre o più consecutivamente scelte corrette. Un numero crescente di errori "set-perdita" può indicare un comportamento perseverative. Inoltre, i topi tipicamente completano ogni fase di test in meno di 30 minuti (figura 5), e la durata del tempo trascorso in ciascuna fase è una funzione di prove per raggiungere criteri.

In uno studio precedente utilizzando un paradigma simile come dettagliato qui, lesioni neurotossiche alla OFC o mPFC nei topi hanno mostrato rispettivamente compromettere le prestazioni nelle fasi di spostamento inversione ed extra-dimensionali, convalida l'uso di questo test per determinare deficit funzionali nella stesse regioni come ratto e studies11 primate non umano. Mentre la sequenza dei compiti nello studio citato varies leggermente a quella mostrata qui, si prevede che lesioni o deficit nella OFC e mPFC anche causare prestazioni alterata a R1 e EDS, come risulta da un aumento del numero di prove al criterio nelle fasi. .

Fase	Pertinente	Esempi		Pertinente	Esempi
Semplice Discriminazione (SD)	Medio	Felt (+)	Paper (-)	Odore	Noce moscata (+)	Rosemary (-)
Compound Discriminazione (CD)	Medio	Felt (+) / Nutmeg	Paper (-) / Rosemary	Odore	Noce moscata (+) / Feltri	Rosemary (-) / Paper
		Felt (+) / Rosemary	Paper (-) / Nutmeg		Noce moscata (+) / Paper	Rosemary (-) / Feltri
Inversione 1 (R1)	Medio	Paper (+) / Rosemary	Felt (-) / Nutmeg	Odore	Rosemary (+) / Paper	Noce moscata (-) / Feltri
		Paper (+) / Nutmeg	Felt (-) / Rosemary		Rosemary (+) / Feltri	Noce moscata (-) / Paper
Spostamento Intradimensional (IDS)	Medio	Pompoms	Paillettes (-) / Clove	Odore </ Td>	Cannella (+) / Pompoms	Clove (-) / Paillettes
		(+) / Cannella
		Pompoms (+) / Clove	Paillettes (-) / Cannella		Cannella (+) / Paillettes	Clove (-) / Pompoms
IDS2	Medio	Pipecleaners	Occhi finti (-) / Ginger	Odore	Timo rosso (+) / Pipecleaners	Ginger (-) / fuori orbita
		(+) / Timo rosso
		Pipecleaners (+) / Ginger	Occhi finti (-) / timo rosso		Timo rosso (+) / fuori orbita	Ginger (-)
IDS3	Medio	Vanilla Ribbon (+) /	Strisce metalliche (-) / Lemon	Odore	Vanilla (+) / Ribbon	Lemon (-) / strisce metalliche
		Lemon Ribbon (+) /	Strisce metalliche (-) / Vanilla		Vanilla (+) / strisce metalliche	Lemon (-) / Ribbon
R2	Medio	Strisce metalliche (+) / Vanilla	Lemon / - Ribbon ()	Odore	Lemon (+) / Ribbon	Vanilla (-) / metallici strisce
		Strisce metalliche (+) / Lemon	Vanilla / - Ribbon ()		Lemon (+) / Metal strisce lic	Vanilla (-) / Ribbon
Spostamento extradimensionale (EDS)	Odore	Citronella (+) / Raffia	Anice (-) / schiuma	Medio	Rafia (+) / Citronella	Foam (-) / Anice
		Citronella (+) / Foam	Anice (-) / Rafia		Rafia (+) / Anice	Foam (-) / Citronella

Tabella 1. combinazioni Esempio di odore e medie scavare. I profumi ei media che scavano in queste combinazioni sono stati convalidati in questo studio. Risultati rappresentativi ottenuti con queste combinazioni specifiche sono mostrati nella Figura 2.

hres.jpg "/>
Figura 1. AST camera di prova. (A) Immagine e dimensioni e ramekin esempio di posizionamento carta da filtro. (B) Immagine della camera di prova AST adattato per topi e (C) un diagramma tridimensionale della camera di prova che illustra la posizione dei fori all'interno della partizione.

Figura 2. Scavo medio. Esempi di scavare coppie medie utilizzati in questo protocollo, come dettagliati nella lista dei materiali (ii.-xi.). Vasi sono riempiti approssimativamente al bordo interno con scavo medie.

Figura 3. Timeline per il test.

Figura 4. C57BL / 6J prestazioni nel AST. (A) Numero medio di prove per soddisfare il criterio della AST per maschi C57BL / 6J. I dati rappresentano media ± SEM (n = 22 topi / gruppo), p = 0.013 per effetto principale della scena. (B) Numero medio di prove per raggiungere il criterio in fase di SD per distinti rilevanti dimensioni iniziali cue. I dati rappresentano media ± SEM (n = 22 topi / gruppo), * p = 0.01. (C) dati normalizzati rappresentati come percentuale della performance individuale di ciascun topo allo stadio SD. I dati rappresentano media ± SEM (n = 22 topi / gruppo), p = 0,06 per effetto principale della scena. (D) spostamento ID / ED in prove per raggiungere il criterio tra IDS2 e ED. I dati rappresentano media ± SEM (n = 22 topi / gruppo), * p = 0,03. (E) spostamento ID / DE dati normalizzati tra IDS3 e ED. I dati rappresentano media ± SEM (n = 22 topi / gruppo), * p = 0.012.

Discussion

I deficit di flessibilità cognitiva mediati dal PFC rappresentare un handicap significativo associato con una varietà di disturbi neurologici e neuropsichiatrici, e possono avere un impatto significativo sui risultati e la qualità della vita delle persone che soffrono di questi disturbi. Ottimizzazione della AST per l'uso nei topi è di vitale importanza per indagare le basi genetiche di malattie accoppiati a prefrontali disfunzione cognitiva corticale mediata. Abbiamo trovato che il metodo sopra descritto è una misura affidabile di un deficit cognitivo specifica, flessibilità cognitiva, e approssima strettamente i risultati ottenuti usando questo compito nei ratti e primati non umani. Il metodo descritto è il risultato di una vasta indagine di protocolli precedentemente descritte in ratti e topi, nonché consulenza e guida di esperti presso il nostro istituto.

I rapporti precedenti con compiti simili a topi hanno dimostrato la capacità di adattamento di tale misura comportamentale, anche se condiversi avvertimenti ^2,6,11. Colacicco et al. Limita il numero di discriminazione testati al giorno per 2, che si estendono test su un periodo di quattro giorni ^11. Questo includeva ripetizioni di coppie stimoli precedentemente apprese in giorni di test consecutivi. Mentre efficace, al fine di sviluppare il protocollo qui presentata è quello di minimizzare la durata del periodo di prova e massimizzare l'efficienza. Qui ci limitiamo test per un periodo di due giorni ed eliminare le ripetizioni di coppie stimoli precedentemente apprese. I precedenti ricercatori hanno osservato che i topi richiedono sovrallenamento per formare un insieme di attenzione e mostrare una piccola "finestra di testabilità" in cui si manterranno rispondere faticoso. Il nostro protocollo prevede anche modesto sovrallenamento del turno intradimensional all'interno della dimensione spunto inizialmente rilevante. Soprattutto quando si valutano i dati normalizzati in figura 4C, sembra che i topi testati nel nostro protocollo può presentare un deficit duri più pronunciatong la seconda inversione intradimensional (rispetto alla fase immediatamente precedente). Questa osservazione è coerente con la nozione di sovrallenamento per garantire la formazione di un insieme attentivo, come topi esposti anche uno spostamento ID / ED. Una possibilità per spiegare perché i topi sostenere prestazioni effortful nel nostro protocollo (Figura 5), che comporta una lunghezza media della sessione di 2 ore, può essere dovuto all'utilizzo di un ciclo luce retromarcia. Abbiamo testato il comportamento in una stanza isolata e dedicato test in condizioni di luce rossa durante le prime quattro ore di (vigile) ciclo scuro. Tuttavia, i test sistematici di fuori del campo di applicazione di questo metodo manoscritto sarebbe necessario per determinare quali fattori contribuiscono alla durata in cui i topi continuano a svolgere la AST, e se si sospetta deficit nella discriminazione olfattiva, prescreening può essere giustificata prima della prova come alternativa Sono stati riportati metodologie inodori.

Inoltre, durantelo sviluppo iniziale metodo, abbiamo scoperto che i giovani topi adulti (8-12 settimane di età) eseguiti con maggiore variabilità che leggermente più vecchie 4-6 mesi di età i topi. Ipotizziamo che il protocollo restrizione alimentare colpisce sempre più i topi in modo diverso rispetto ai topi più mature, e mentre, in un certo senso classico neurosviluppo, il cervello del mouse è considerato pienamente sviluppato entro 6 settimane, è possibile che il passaggio dalla adolescenza alla maturità adulta e prima età adulta rimodellamento sinaptico all'interno della corteccia prefrontale prestazioni confondere AST nei topi più giovani. Tuttavia, questi affascinanti interrogativi restano da esplorare.

Altre variazioni di protocolli AST nei topi sono prove "libere", che significa un determinato numero di prove (in genere 4) all'inizio di ogni fase non sono segnato, e l'animale è permesso di esplorare sia pentole fino a quando il premio viene recuperato. Il protocollo qui descritto non comprende le prove "libere". Inoltre, abbiamo impostato il REQUISITINTS per soddisfare criterio più severo (8 studi consecutivamente corrette al criterio anziché precedentemente descritte 8/10 prove per soddisfare il criterio) e hanno trovato che questo è un indicatore efficace se l'animale è davvero imparato la regola. Garner et al. ha dimostrato che un periodo di sovrallenamento a seguito di un IDS (cioè, la presentazione degli stimoli in precedenza rilevanti per altri 50 studi) ha aumentato significativamente le prove al criterio in EDS ^2. Qui, includiamo più turni intra-dimensionale, nel tentativo di "overtrain" e garantire la formazione di un insieme attentivo sulla dimensione rilevante, in accordo con Bissonette et al. ^6. Inoltre, Garner et al. sessioni di test limitato a circa 1 ora (o quando il mouse risposto più) ^2, che abbiamo trovato che C57BL6 / J topi adeguatamente e affidabile progredire attraverso tutte le quattro fasi di cui è ogni giorno entro un periodo di circa 2 ore (per il controllotopi). Anche se, i potenziali differenze nella capacità del motore tra i gruppi sperimentali devono essere considerati quando si interpretano le prestazioni. La procedura limita il tempo e manodopera investimenti a 17 giorni per ciascun animale dall'inizio del trattamento attraverso il completamento del test. Si raccomanda che un individuo sperimentatore limitare il numero di topi testati in un solo giorno a non più di 2 (questo può essere modificato in base a capacità individuale sperimentatore ed esperienza), che consente un singolo sperimentatore la capacità di completare test su almeno 6 topi a settimana. Se la funzione motore è lievemente compromessa, la lunghezza di ogni prova può essere aumentata, come risposta corretta, non la velocità di risposta, è la variabile dipendente chiave.

Discriminazione visiva paradigmi simili a quelli che sono stati utilizzati per valutare le prestazioni cognitive nei primati non umani sono stati recentemente adattati per roditori, e può essere utilizzata come alternativa al odore e medie discrimination compiti descritti qui. Questo approccio può essere necessario se sono presenti tra i gruppi sperimentali di topi significative differenze di discriminazione olfattiva. Brigman et al. Hanno dimostrato che i topi facilmente discernere stimoli visivi composti in un ID e cambio di paradigma ED ^15. Anche se questo metodo automatizzato rappresenta meglio il test impiegato per studiare prefrontale disfunzione della corteccia negli esseri umani e primati non umani, il costo delle camere e operante touchscreen necessari per eseguire questo test automatizzato nei topi può essere proibitivo.

Si raccomanda di comportamento potrebbe essere eseguita nel modo più coerente possibile per ogni mouse, cioè, assuefazione, la formazione e la sperimentazione deve essere eseguita alla stessa ora del giorno per ogni animale. Inoltre, la camera comportamento dovrebbe rimanere invariato per tutto l'esperimento, rendendo l'uso di comune / spazio comunitario problematico a causa del flusso di traffico incontrollabile, introduzione odore, ecc Se gli animali devono essere trasportatida una stanza alloggiamento in una camera comportamento remota (come è il caso qui), lo stesso percorso dovrebbe essere presa ogni volta. La camera comportamento dovrebbe essere in una zona dove non saranno disturbati sperimentatore e gli animali durante la procedura di prova. Se più sperimentatori stanno effettuando l'operazione nella stessa stanza, l'ingresso e l'uscita dalla stanza deve essere quanto più limitato possibile per evitare rumori forti o interruzioni che possono aumentare lo stress o ansia dell'animale durante il test. Inoltre, sperimentatori devono fare attenzione nel rimuovere e sostituire il gate di partenza e le pentole dentro e fuori della camera in modo da creare il minor rumore e disturbo possibile. Esperimenti condotti su ratti hanno dimostrato che le prestazioni AST può essere disturbato da vari fattori di stress.

Profumazione delle pentole deve essere eseguita ogni settimana e lo stesso giorno ogni settimana, almeno 2 giorni prima del primo giorno di test. Si raccomanda che i vasi sono profumati in un pozzo-ventzona ilated al di fuori della zona in cui il test deve essere eseguito (ad esempio laboratorio separato, disimpegno, cappa aspirante). Ciò contribuirà ad evitare la contaminazione incrociata dei profumi e verrà evitare di confondere i topi con profumi che non fanno parte del test. Inoltre, prima e durante la prova, forti profumi che può distrarre l'animale dalla discriminazione (cioè, il consumo di gomma o caffè immediatamente prima della prova, forte profumo / deodorante, ecc) dovrebbero essere evitati per la ragione sopra. Qualora sperimentatori desiderio di utilizzare media di scavo alternativo rispetto a quanto descritto in questo protocollo, si raccomanda che il mezzo sia di densità simile e il peso a quello descritto qui (eccessivo peso / densità rende difficile per il mouse per scavare in modo adeguato). Ad esempio, abbiamo scoperto che le piccole sfere di plastica non erano adatte perché erano difficili per i topi a mettere da parte. Inoltre, qualsiasi supporto con un forte profumo (ad es., Strisce di gomma e alcuni plastmateriale ic) non è adatto perché può interferire con la capacità di rilevare i profumi testati.

Formazione e test di un individuo topo devono essere eseguite da un unico sperimentatore, tuttavia acclimatazione può essere fatto da qualsiasi sperimentatore purché hanno partecipato movimentazione. Tutti i vasi da utilizzare nelle quattro fasi eseguite ogni giorno dovrebbe essere a portata di mano in modo da limitare la quantità di tempo l'animale è nell'area di attesa tra le fasi. Ciò contribuirà a mantenere l'attenzione del mouse su ogni attività. Inoltre, una volta che il test è iniziato, è importante non fermarsi fino al completamento dei compiti per quel giorno di test (ad esempio, tutte le 4 fasi per ogni giornata di test devono essere compilati in successione).

In conclusione, il protocollo qui descritto fornisce indicazioni metodologiche dettagliate per l'utilizzo efficace della AST per misurare la funzione cognitiva cortico-dipendente prefrontale nei topi, compresa la descrizionedi analisi dei dati e potenziali caveat. Una varietà di metodi AST topo sono riportati in letteratura primaria, ciascuno con la propria dettaglio procedurale distinti. L'accoppiamento unica di informazioni di testo-base e visivo sarà particolarmente utile per i ricercatori di tentare di integrare questo potente analisi comportamentale nel loro repertorio scientifico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Testing Chamber			Fabricated in-house, specifications can be found in protocol
3 oz. Ramekins	BIA Cordon Bleu	900002S12	Purchased on amazon.com
Essential Oils:	Fronteir Natural Products Co-Op		Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo
Clove Bud		191114
Red Thyme		191140
Lemon		190810
Cinnamon Leaf		191111
Rosemary		191133
Citronella Java		191112
Vanilla in jojoba oil		191231
Anise Seed		191102
Ginger		191121
Nutmeg		191161
Filter Paper, 9.0 cm diameter	VWR International	28310-048	Purchased on https://us.vwr.com/
Digging Media
Raffia	Ashland 8 oz Raffia		Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips
Green Felt	Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in		Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares
Brown foam	Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan)		Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles
Crepe paper (yellow)	Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo		Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips
Ribbon (turqoise)	Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester		Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares
Metallic	Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz		Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips
Googly Eyes, 4 mm		ME4144	Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php
Black Sequins, 3 mm		8780BK
Pink Pom Poms, 1/4 inch		1018221
Pipe Cleaners, red		108430
Bedding material/sawdust			Obtained from in-house animal resources
Timer	Control Company	5000	Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm
Lightly sweetened dry breakfast cereal loops	HEB		Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended