Summary
Målet med denne protokollen er å utføre en atferdsanalyse som oppmerksomhets sett skiftende oppgave (AST) for å vurdere prefrontal cortex-mediert kognitiv fleksibilitet i mus.
Introduction
Oppmerksomheten sett skiftende oppgave (AST) ble utviklet som et mål på oppmerksomhet og kognitiv fleksibilitet hos rotter over et tiår siden 1,2. AST er modellert etter intradimensional / extradimensional komponent av Cambridge Neuropsykologisk Test Automated batteri (Cantab) som brukes til å identifisere kognitiv dysfunksjon hos mennesker og ikke-humane primater 3,4. Mens evnen til å lære enkle regler forblir intakt, til underskudd i læring modifisere et svar når reglene har endret seg er funnet hos pasienter som lider av en rekke nevropsykiatriske lidelser (dvs. schizofreni, tvangslidelser, depresjon), nevrodegenerative lidelser (dvs. Parkinsons sykdom) og hos pasienter med lesjoner i de forhånds frontal cortex 5. Mer generelt har disse pasientene er beskrevet som å ha underskudd i kognitiv fleksibilitet. Analoge underskudd har blitt vist i både ikke-menneskelige primater og gnagere når lesjoner to prefrontal cortex har blitt indusert 1,6-8. Disse underskuddene indikerer en tilstand av kognitiv fleksibilitet eller en svekket evne til å skifte oppmerksomhets sett.
En oppmerksomhets sett dannes når et emne får vite at et sett av regler kan brukes til komplekse stimuli for å skille relevant fra irrelevante signaler. For eksempel, i AST, vil dyrene lærer å ta hensyn og svare til den aktuelle køen (dvs. graving medium) og ignorere et irrelevant signalet (dvs. lukt), ved sammenkobling en mat belønning med mediet. Denne foreningen er deretter forsterket i senere oppgaver hvor den type grave- mellom og luktendringer, men den sammenkoblede sammenheng mellom medium og belønning gjenstår. Dette forsterket regel danner en kognitiv sett. To etapper innenfor AST protokoll måle aspekter av kognitiv fleksibilitet: reversering og ekstra-dimensjonale skift. Ved reversering scenen, de tidligere negative stimuli innen ett dimension (medium i dette eksemplet) nå er positivt, noe som utfordrer dyrets å ignorere de positive stimuli fra det foregående trinn. For eksempel, hvis følte grave medium var de positive stimuli i den forrige scenen og papir var de negative stimuli, nå er det omvendt. Dette utfordrer dyrets fleksibilitet i at det må opprettholde oppmerksomhets sett (dvs. er medium relevant dimensjon) mens endre regelen lært for stimulans og belønning par innenfor en dimensjon. Dannelsen av en oppmerksomhets sett er utfordret på den ekstra-dimensjonalt skift fasen, når irrelevant dimensjon (lukt i dette eksempel), blir den aktuelle dimensjon. En perseverative respons, som indikert av en fortsatt ønsker med tidligere lært regelen, enten scenen reflekterer et underskudd i kognitiv fleksibilitet.
Lesjon studier i både ikke-humane primater og gnagere har vist spesifikke regioner av prefrontale cortex kan tilskrives evnen til perform bestemte stadier av AST 1,9. Lesjoner til orbitofrontal cortex (OFC), en underregion av prefrontal cortex (PFC), har vist seg å indusere underskudd i reversering læring på AST 8. I tillegg lesjoner til medial prefrontal cortex (MPFC) føre til spesifikke vansker med å utføre den ekstra-dimensjonale skift.
Mens tallrike studier ved hjelp av AST er utført på rotter og ikke-humane primater, har relativt få utnyttet AST som et mål på kognitiv funksjon hos mus. Gitt den enkle genetisk manipulasjon i mus, og den kritiske behovet for å måle prefrontale cortex funksjon i å studere en rekke lidelser, tilpasning og validere denne atferds mål i mus er et viktig tillegg til forskning på sykdommer forbundet med PFC dysfunksjon. Protokollen beskrevet her er en modifikasjon av fremgangsmåten ved Birrell og Brown 1 som er optimalisert for anvendelse i mus og reflekterer mange av mus-spesific tilpasninger som tidligere har blitt rapportert 2,6,10-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dyr brukt i denne studien er mann C57Bl / 6J mus mellom 4 og 6 måneders alder for optimale resultater. Mus blir vedlikeholdt på en omvendt lys syklus for å enkelt teste dem under den aktive (mørk) fase. Dersom virkemåten blir utført i et rom som er atskilt fra huset, blir musene tillatt minst 1 time for å akklimatisere seg etter transport til testrommet. Atferds testing er utført under røde lysforhold minimere avbrudd i normal aktivitet av musene så lite som mulig samtidig gir eksperimentator tilstrekkelig belysning til visuelt overvåke testøkt.
MERK: Alle aspekter av den eksperimentelle prosedyren er beskrevet her ble utført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, 8. utgave (NRC) og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Texas Health Science senter på San Antonio.
- Fyll keramiske porsjonsformer (ikke-porøs, 1,5 "dybde x 2,5" diameter), til indre rim med graving medium (ca 1 "fra bunnen); filter papir runder halvert og tapet til inne bak ramekin (figur 1A)
- Bryte lett søtet tørr frokostblanding (mat belønning) - Honey Nut eller sukker belagt varianter, til ca 20 mg stykker for akklimatiseringen, opplæring og testing etapper.
- Gjør et oppmerksomhets sett skiftende oppgave (AST) kammer (Figur 1B): Akklimatisere tog og teste hver mus i enkelte kamre; anbefalt produksjonen av minst åtte kamre.
- Bygge en 12 "x 8" x 7 "AST kammeret; vegger og start gate laget av ugjennomsiktig hvit akryl som er lett å rengjøre med 70% etanol. Giljotinen-stil, skiller avtagbart start gate kammeret i et venteområde (5 "x 8") og testing område (7 "x 8").
- Inkluder en Clear 5221, x7 "flyttbar skillevegg som skiller to sider av testområdet jevnt; kutte tre ¼ "diameter hull i bunndelen av skilleveggen for å tillate tilgang sniffing, adskilt 1" fra hverandre og en "fra forsiden av skilleveggen (figur 1C).
2. Prosedyre Oversikt (figur 2)
- Før AST, huset musene individuelt og tillate dem å tilpasse seg en omvendt lyssyklus i minst en uke.
- Akklimatisere seg, trene og teste hvert dyr i enkelte testkamre. Tildele hvert kammer til en mus og ren med 70% etanol etter endt siste dagen av testing. Dette vil redusere stress under testing ved å gjøre kammeret lukter "hjemme-bur" eller "self".
- Duft test potter 2 dager før testing for å tillate duft å spre; mus vil ikke grave i potter som har en veldig sterk lukt. Ved hjelp av en sprøyte med en 25 G nål, tilsett ca 0,1 mleterisk olje til toppen av filterpapiret.
3. Håndtering (Days 1-8)
- Håndtere mus med start 8 dager før den første dagen av mat begrensning. Dette vil redusere stress forbundet med håndtering under testing.
- Veie og registrere kroppsvekt hver dag håndtering. Håndtere hver mus 2-3 min per dag.
- Hvis flere forskere er å være involvert i å teste et sett med mus, sikre at hver experimenter deltar i håndteringen prosess for å øke kjennskapen til forskere og redusere stress og angst opplevd på trening eller prøving dager.
- Fortsett håndtering og opptak vekter under hele testing.
4. Mat begrensning (Days 9-12)
- Begynnelsen 4 dager før starten av akklimatisering, for å plassere mus på en begrenset diett opprett mus på 80-85% av deres kroppsvekt mating. Gi 1 gram mat per mus per dag. Hvis kroppsvekten faller underdet angitte området gir 2 gram per dag inntil de returnerer til den aktuelle serien.
- Plasser to porsjonsformer på forsiden av hvert hjem bur for å tillate mus for å akklimatisere seg til testing potter. Dette er de samme stedene som brukes til å trene på musen for å grave etter en mat belønning.
- Tilsett 2 gram mat og en del av mat belønning (et halvt stykke kornblanding i hver) i formene hver dag i 4 dager.
- Dersom virkemåten skal utføres i et annet rom enn den i hvilken musene er plassert, som begynner på dag 1 av mat begrensning, transport mus til testrommet i minst en time per dag før retur til boligrommet for å tillate dem til å akklimatisere seg til i testingen rommet.
- På den siste dagen av mat begrensning, før starten av akklimatisering, endre hjemme bur sengetøy. Buret sengetøy, vil ikke bli endret igjen før etter testingen er fullført for å redusere stress eller angst opplevde under trening og testing (med mindre det er absolutt nødvendig).
- Opprettholdmus på mat begrensning til slutten av testingen. På dager 13-17, gi mus mat etter akklimatisering, trening, eller testing basert på et anslag på hvor mye mat belønning konsumert (vanligvis <1 g av mat pellet).
5. akklimatisering (Days 13-14)
- Begynnelsen to dager før starten av treningen, utføre akklimatisering under den mørke syklus etter rødt lys.
- Spre en liten mengde av skitne sengetøy fra hjemmet buret i kammeret, vil dette redusere stresset av å være i et nytt miljø ved å innføre et kjent "hjemme-bur" eller "self" lukt til testkammeret (det samme kammeret vil være brukes for en enkelt mus for varigheten av trening og testing).
- Plasser en ren ramekin med vann i området venter av kammeret; mus pleier ikke å spise hvis de ikke har tilgang til vann.
- Plasser de to porsjonsformer som har blitt brukt for mat begrensning i testområdet med en mat belønning (~ 20mg frokostblanding stykke) i hver.
- Plasser musen i venteområdet; fjerner startporten og tillate musen til å utforske kammeret i 1 time.
- Kontinuerlig legge mat belønninger (~ 20 mg frokostblanding stykke) til de tomme porsjonsformer for å oppmuntre musene å utforske testing området og pottene ofte.
- Sørg for at musen kan se eksperimentator hele akklimatiseringsperiode slik at tilstedeværelsen av eksperimentator er ikke en ekstra stressor under testing.
6. Training (dag 15)
- Plasser musen i venteområdet.
- Plasser den tomme ramekins, som hver inneholder en mat belønning (~ 20 mg frokostblanding stykke), inn i testingen området og løft start gate. Tillate mus 3 min å hente både mat belønninger. Gjenta dette trinnet flere ganger.
- Legge gradvis sagflis / mus bur sengetøy til grytene i påfølgende forsøk. Tillate musen 3 min for å hente mat belønning fra hver pott før du avslutter trial. Når musen har hentet mat belønning fra hver pott, går du videre til neste rettssaken. Hvis musen ikke gjør forsøk på å grave når maten belønning er delvis dekket, kan hint gis (dvs. dryss frokostblanding støv over området av mat belønning, gjør et innrykk i sagmugg løpet område av mat belønning, avdekke en del av mat belønning).
- Fortsett å legge sagflis / sengetøy etter hvert forsøk før maten belønning er helt dekket og musen demonstrerer pålitelig evnen til å grave i en full pott for å finne mat belønning.
- Hvis en mus ikke har en pålitelig vist evne til å finne en mat belønning i en full pott innen 2 timer fra starten av treningen, fortsette til andre dag med trening. Opprett musen på mat begrensning og gjenta denne prosedyren neste dag.
- Hvis musen ikke klarer å grave etter en food belønning etter to påfølgende dager, fjerne den fra resten av forsøket, og kommentere som en "ikke klarte å grave" i experimental posten.
7. Testing (Days 16-17):
- På dag én, teste enkle diskriminering (SD), sammensatt diskriminering (CD), reversering (R1), og intra-dimensjonale shift (IDS).
- På dag to, teste intra-dimensjonale skiftet 2 (IDS2), intra-dimensjonale skiftet 3 (IDS3), reversering 2 (R2; valgfritt), ekstra-dimensjonale shift (EDS).
- Pair media og dufter som vist i tabell 1.
- På tidspunktet for håndtering på testing dag, gi mus én mat belønning for å unngå manglende fokus under testing på grunn av sult. Fra dette punktet til slutten av testingen dag, ikke gir noen mat unntatt belønning for riktige valg.
- Ved starten av testing, ved hjelp av pinsett (begrenser spredningen av dufter mellom potter), plasserer et stykke av mat belønning i potten som indikerer et riktig valg. Maten belønning bør være fullt dekket av media (se figur 3). For å unngå en duft signalet fra mat belønning, strø kornstøv over alle potter i starten av scenen.
- Plasser musen i området venter med starten gate stengt. Sette pottene på hver side av testkammeret. Rettssaken starter når startporten fjernes og tidtakeren er startet. Tillate hver mus 3 min per rettssaken å gjøre et valg. Spill valget (riktig eller gal) og tid til musen gjort et valg for hvert forsøk.
MERK: En "valg" er angitt med et forsøk på å grave i enten potten. En grave registreres bare som et valg om musen har fortrengt media og stakk nesen langt nok i rommet det skaper å finne mat belønning eller fortrengt nok av media for å avdekke maten belønning. Hvis en mus ikke har gjort et valg innen 3 min, er dette registrert som noe annet valg (feil). - Når et valg har blitt gjort for enten potten, fjerne potten som ikke ble valgt fra testkammeret. Hvis et riktig valg ble gjort, la musen til å fullføre maten belønning før du plasserer musepekeren tilbake iventeområdet. Hvis feil valg er gjort, lar musen til å utforske potten for å vise at det ikke er mat belønning for det valget før retur musen til venteområdet.
- På slutten av hvert forsøk, plasserer du muse tilbake i venteområdet og erstatte start gate.
- Sørg for at musen oppfyller kriteriet om åtte riktige prøvelser fortløpende for å gå videre til neste stadium av AST. Hvis en mus ikke får åtte riktige valg etter hverandre innen 50 forsøk, den svikter det stadiet og kan ikke flytte på å fullføre testen. 6 påfølgende ingen valg (3 min uten et valg) er en unnlatelse av å delta og forbyr musen fra du går videre til neste trinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den typiske avhengig tiltak i denne testen er antall forsøk pr stadium å tilfredsstille kriteriet (eller 8 riktige påfølgende valg). Figur 4A viser gjennomsnittlig antall forsøk for å møte kriteriet på hvert trinn i ubehandlet C57BL / 6J hjelp av AST. Som mus danner en oppmerksomhets sett på den aktuelle køen dimensjon (lukt eller media), vil ytelsen bedre, som indikert av en reduksjon i forsøk for å møte kriteriet i påfølgende intradimensional skift, og reversering etapper og den extradimensional skiftet vil kreve ytterligere studier for å møte kriterium. Det er viktig å motvirke antall dyr som starter på hver av de to relevante dimensjoner (dvs., media eller lukt) som vi har observert noen forskjell på det enkle diskriminering scenen gjenspeiles i en økning i antall forsøk til Criterion om lukt er det relevant cue (Figur 4B). Hvis forsøkene å nå kriterium på SD scenen er signifikant forskjellig mellom the to relevante cue dimensjoner (dvs. bedre ytelse når media er relevant som i figur 4B), ytelsesdata for hver mus i løpet av påfølgende stadier kan normaliseres til sin ytelse under det enkle diskriminering scenen. Som illustrert i figur 4C, reduserer denne normaliseringstrinn variabilitet forbundet med å lære den innledningsvis relevante signalet og forbedrer visualiseringen av forbedret ytelse på de etterfølgende trinn IDS. Selv om gruppestørrelser på ~ 20 mus vil være tilstrekkelig til å tillate analyse av rå-data uten normalisering. Viktigere, til en betydelig økning i forsøkene oppfyller kriterium under extradimentional forskyvning i forhold til de tidligere intradimentional skift indikerer en viktig kontroll mål på testen gyldighet (Figur 4D og 4E). Før ED skift scenen, mus lære å ta hensyn til en eneste relevant cue dimensjon (lukt eller media) for å finne belønning. Overgangen til en new relevant cue dimensjon, som tidligere var irrelevant, bør kreve flere forsøk for å nå kriterium, noe som resulterer i en ID / ED skift. Interessant analyse av ID / ED skifte innen rådata viste en signifikant økning i studiene for å nå kriterium mellom IDS2 og ED (Figur 4D), og trenden mot en økning mellom IDS3 og ED (data ikke vist, p <0,1) og en økning mellom middel forsøk for å oppnå kriteriet IDS2 og IDS3 forhold til ED (data ikke vist). Interessant, en betydelig ID / ED skift var tydelig mellom både IDS2 og IDS3 forhold til ED når dataene ble normalisert til ytelse på SD scenen (figur 4E).
Det er forventet at ca 70-80% av kontroll mus vil fullføre hele oppgaven (20-30% droppe ut rate). Alternative avhengige tiltak er gjennomsnittlig ventetid for å gjøre et valg som måles på hvert trinn av oppgaven (selv om vi har funnet dette å være svært variabel mellom mus),totale antall feil og antall "set-tap" feil ved reversering og ekstra-dimensjonale skift etapper som definert av Lapiz-Bluhm et al. 14 som antall ganger feil valg ble gjort etter tre eller flere etter hverandre riktige valg. Et økt antall "set-tap" feil kan indikere en perseverative oppførsel. I tillegg mus vanligvis fullføre hver scene av testing i mindre enn 30 min (figur 5), og varigheten av tid brukt på hvert trinn er en funksjon av forsøk for å nå kriterium.
I en tidligere studie ved hjelp av en tilsvarende paradigme som beskrevet her, nevrotoksiske lesjoner til OFC eller MPFC i mus ble vist å svekke ytelsen på reversering og ekstra-dimensjonale skift etapper henholdsvis validere bruk av denne testen for å bestemme funksjonelle underskudd i samme områdene som rotte og ikke-menneskelige primater studies11. Mens sekvensen av oppgavene i studien nevnte vVæren litt til det som vises her, er det forventet at lesjoner eller underskudd i OFC og MPFC vil også føre til svekket ytelse på R1 og EDS, som reflekteres av en økning i antall forsøk til Criterion på disse stadiene. .
| Stage | Relevant | Eksempler | Relevant | Eksempler | ||
| Enkelt diskriminering (SD) | Medium | Felt (+) | Papir (-) | Lukt | Muskat (+) | Rosmarin (-) |
| Sammensatte Diskriminering (CD) | Medium | Felt (+) / Nutmeg | Papir (-) / Rosemary | Lukt | Muskat (+) / Felt | Rosmarin (-) / papir |
| Felt (+) / Rosemary | Papir (-) / Nutmeg | Muskat (+) / papir | Rosmarin (-) / Felt | |||
| Reversering 1 (R1) | Medium | Papir (+) / Rosemary | Felt (-) / Nutmeg | Lukt | Rosmarin (+) / papir | Muskat (-) / Felt |
| Papir (+) / Nutmeg | Felt (-) / Rosemary | Rosmarin (+) / Felt | Muskat (-) / papir | |||
| Intradimensional Shift (IDS) | Medium | Pomponger | Paljetter (-) / Clove | Lukt </ Td> | Kanel (+) / Pompoms | Fedd (-) / paljetter |
| (+) / Cinnamon | ||||||
| Pomponger (+) / Clove | Paljetter (-) / Cinnamon | Kanel (+) / paljetter | Fedd (-) / Pompoms | |||
| IDS2 | Medium | Pipecleaners | Googly øyne (-) / Ginger | Lukt | Rød timian (+) / Pipecleaners | Ingefær (-) / Googly øyne |
| (+) / Red timian | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ginger | Googly øyne (-) / Rød timian | Rød timian (+) / Googly øyne | Ingefær (-) | |||
| IDS3 | Medium | Bånd (+) / Vanilla | Metalliske strimler (-) / Lemon | Lukt | Vanilla (+) / Ribbon | Sitron (-) / Metallic strips |
| Bånd (+) / Lemon | Metalliske strimler (-) / Vanilla | Vanilje (+) / Metallic strips | Sitron (-) / Ribbon | |||
| R2 | Medium | Metalliske strimler (+) / Vanilla | Bånd (-) / Lemon | Lukt | Sitron (+) / Ribbon | Vanilje (-) / Metallic Strips |
| Metalliske strimler (+) / Lemon | Bånd (-) / Vanilla | Sitron (+) / Metal lic strimler | Vanilla (-) / Ribbon | |||
| Extradimensional Shift (EDS) | Lukt | Citronella (+) / Kurv | Anis (-) / Skum | Medium | Raffia (+) / Citronella | Skum (-) / Anis |
| Citronella (+) / Skum | Anis (-) / Kurv | Raffia (+) / Anis | Skum (-) / Citronella | |||
Tabell 1. Eksempel kombinasjoner av lukt og graving medium. Luktene og grave media i disse kombinasjonene er validert i denne studien. Representative resultater oppnådd ved anvendelse av disse spesielle kombinasjoner er vist i figur 2.
hres.jpg "/>
Figur 1. AST testing kammeret. (A) Bilde og dimensjoner av ramekin og eksempel filterpapir plassering. (B) Bilde av AST testkammer tilpasset for mus og (C) et tredimensjonalt diagram av testkammeret som illustrerer plassering av hull i skilleveggen.
Figur 2. Digging medium. Eksempler på graving middels parene som brukes i denne protokollen som detaljert i listen materialer (ii.-xi.). Pottene fylles omtrent til den indre kant med grave medium.
Figur 3. Tidslinje for testing.
Figur 4. C57Bl / 6J ytelse i AST. (A) Gjennomsnittlig antall forsøk å møte kriterium i AST for mannlige C57BL / 6J mus. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 22 mus / gruppe), p = 0,013 for viktigste effekten av scenen. (B) Gjennomsnittlig antall forsøk å nå kriterium på SD scenen for forskjellige innledende relevante cue dimensjoner. Data representerer middelverdi ± SEM (n = 22 mus / gruppe), * p = 0,01. (C) normaliserte data som er representert som en prosentandel av hver mus individuelle ytelse på SD-stadiet. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 22 mus / gruppe), p = 0,06 for viktigste effekten av scenen. (D) ID / ED skift i forsøk for å nå kriterium mellom IDS2 og ED. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 22 mus / gruppe), * p = 0,03. (E) ID / ED skifte i normaliserte data mellom IDS3 og ED. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 22 mus / gruppe), * p = 0,012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Underskudd i kognitiv fleksibilitet mediert av PFC representere et betydelig handikap forbundet med en rekke nevrologiske og nevropsykiatriske lidelser, og kan ha stor innvirkning på utfall og livskvalitet for personer som lider av disse lidelsene. Optimalisering av AST for bruk i mus er viktig å undersøke genetiske grunnlaget ved sykdommer koblet til prefrontale hjernebarken mediert kognitiv dysfunksjon. Vi har funnet at den ovenfor beskrevne metode er et pålitelig mål på et bestemt kognitive underskudd, kognitiv fleksibilitet og tett tilnærmet resultatene som ble oppnådd ved hjelp av denne oppgave i rotter og ikke-humane primater. Metoden som er beskrevet er et resultat av en omfattende undersøkelse av tidligere beskrevet protokoller i rotter og mus, samt råd og veiledning av eksperter på vår institusjon.
Tidligere rapporter med lignende oppgaver i mus har vist omstillingsevne av en slik atferdsregulerende tiltak, om enn medflere begrensninger 2,6,11. Colacicco et al. Begrenset antall diskriminering testet per dag til 2, som spredte testing over en fire dagers periode 11. Dette inkluderte repetisjoner av tidligere lært stimuli parene på påfølgende testing dager. Mens effektive, er det formål å utvikle protokollen presentert her for å minimere varigheten av testperioden og maksimere effektiviteten. Her begrenser vi testing til en to dagers periode og eliminere gjentakelser av tidligere lært stimuli parene. Tidligere forskere har registrert at mus krever trening for å danne en oppmerksomhets sett og viser en liten "vindu av testbarhet" der de vil opprettholde effortful svare. Vår protokollen innebærer også beskjeden overtrening på intradimensional skifte innen utgangspunktet relevant cue dimensjon. Spesielt ved evaluering de normaliserte data i figur 4C, ser det ut til at musene testet i vår protokoll kan oppvise en mer uttalt underskudd during den andre intradimensional reversering (i forhold til den umiddelbart foregående trinn). Denne observasjonen er forenlig med tanken om overtrening for å sikre dannelsen av en oppmerksomhets sett, som mus også utstilt en ID / ED skift. En mulighet til hvorfor mus opprett effortful ytelse i vår protokoll (figur 5), noe som innebærer en gjennomsnittlig sesjon lengde på 2 timer, kan skyldes utnyttelse av en omvendt lyssyklus. Vi testet atferd i et isolert og dedikert testing rom under røde lysforhold i løpet av de første fire timene av mørke (våken) syklus. Imidlertid ville systematisk testing utenfor omfanget av denne metoden manuskript for å fastlå hvilke faktorer som bidrar til varigheten der mus vil fortsette å gjennomføre AST, og hvis underskudd i olfactory diskriminering er mistenkt, kan screening være berettiget før testing som alternativ luktfrie metoder har blitt rapportert.
I tillegg, i løpetden innledende metodeutvikling, oppdaget vi at unge voksne mus (8-12 uker gamle) utført med større variabilitet at litt eldre 4-6 måneder gamle mus. Vi spekulerer i at maten begrensning protokollen påvirker voksende mus annerledes enn mer modne mus og stund, i en klassisk neurodevelopment forstand, er musen hjernen anses fullt utviklet av seks uker, er det mulig at overgangen fra ungdom til voksen modenhet og tidlig voksen alder synaptiske ombygging innenfor prefrontal cortex forvirre AST ytelse i yngre mus. , Forblir imidlertid disse fascinerende spørsmålene for å bli utforsket.
Andre varianter av AST protokoller i mus inkluderer "gratis" prøvelser, noe som betyr et bestemt antall forsøk (vanligvis fire) i begynnelsen av hver etappe er ikke scoret, og dyret er lov til å utforske både potter før belønningen hentes. Protokollen detaljert her inkluderer ikke noen "gratis" prøvelser. I tillegg setter vi requirements å møte kriteriet strengere (8 fortløpende riktige forsøk for å kriterium i stedet for den tidligere beskrevne 8/10 forsøk for å oppfylle kriterium), og har funnet at dette er en effektiv indikator på hvorvidt dyret har virkelig lært regelen. Garner et al. viste at en periode med overtrening etter en IDS (dvs. presentasjon av tidligere relevante stimuli for ytterligere 50 forsøk) betydelig økt forsøkene til Criterion i EDS to. Her tar vi med flere intra-dimensjonale skift, i et forsøk på å "overtrener" og sikre dannelsen av en oppmerksomhets sett på den aktuelle dimensjon, i samråd med Bissonette et al. 6. I tillegg Garner et al. fastsatte testsesjoner til omtrent 1 time (eller når musen ikke lenger reagerte) 2, mens det er funnet at C57BL6 / J-mus tilstrekkelig og pålitelig går gjennom alle fire stadier presenteres for dem hver dag i løpet av omtrent en 2-timersperiode (for kontrollmus). Selv om potensielle forskjeller i motorisk evne mellom eksperimentelle grupper bør vurderes når man tolker resultatene. Vår fremgangsmåte begrenser tid og arbeidsinnsats til 17 dager for hvert dyr fra starten av å håndtere ved gjennomføring av tester. Det anbefales at en individuell experimenter begrense antallet mus testet på en enkelt dag til ikke mer enn to (dette kan modifiseres basert på individuell experimenter evne og erfaring), som gjør det mulig for en enkelt experimenter evnen til å gjennomføre testing på minst 6 mus per uke. Hvis motorisk funksjon er mildt svekket, kan lengden på hver prøve økes, som riktig å reagere, ikke hastigheten på å svare, er nøkkelen avhengig variabel.
Visuell skjel paradigmer lik de som er blitt anvendt for å vurdere kognitiv ytelse i ikke-humane primater har nylig blitt tilpasset for bruk i gnagere, og kan brukes som et alternativ til lukt og mellom discrimination oppgaver beskrevet her. En slik tilnærming kan være nødvendig dersom signifikante forskjeller i olfaktorisk diskriminering er til stede mellom eksperimentelle grupper av mus. Brigman et al. Har vist at mus lett skjelne sammensatte visuelle stimuli i en ID og ED skift paradigme 15. Mens dette automatisert metode bedre representerer testen anvendt for å studere prefrontale cortex dysfunksjon hos mennesker og ikke-humane primater, til kostnaden av driftsavdelingene og berøringsskjermer som kreves utføre denne automatisert test hos mus kan være uoverkommelige.
Det anbefales at atferd utføres så konsekvent som mulig for hver mus, dvs. habituering, opplæring og testing bør utføres på samme tid på døgnet for hvert dyr. Videre bør atferden rom forblir uendret gjennom hele forsøket, noe som gjør bruk av felles / samfunnet plass problematisk på grunn av ukontrollerbar trafikkflyt, lukt introduksjon, etc. Hvis dyr skal transporteresfra et boligrommet til en ekstern adferd rom (som er tilfellet her), bør den samme ruten tas hver gang. Oppførselen rommet skal være i et område der eksperimentator og dyrene ikke vil bli forstyrret i løpet av testprosedyre. Hvis flere forskere utfører oppgaven i samme rom, inn- og utkjøring fra rommet bør være så begrenset som mulig for å unngå eventuelle høye lyder eller avbrudd som kan øke stress eller angst for dyret under testing. I tillegg bør experimenters være forsiktig i å fjerne og erstatte start gate samt pottene inn i og ut av kammeret, slik som å lage så lite støy og forstyrrelser som mulig. Eksperimenter utført på rotter har vist at AST ytelse kan bli forstyrret av ulike stressfaktorer.
Scenting av potter bør utføres hver uke og på samme dag hver uke, minst to dager før den første testing dagen. Det anbefales at pottene er parfymert i en brønn-ventilated området utenfor området hvor testen skal utføres (f.eks eget laboratorium, gang, avtrekksskap). Dette vil bidra til å unngå smitte av luktene og vil unngå forvirrende musene med dufter som ikke er en del av testen. I tillegg, før og under testing, sterke lukter som kan avlede dyret fra diskriminering (dvs. forbruk av tyggegummi eller kaffe umiddelbart før testing, sterk parfyme / deodorant, etc.) bør unngås for den nevnte grunn. Skulle experimenters ønske å bruke alternative grave medium enn det som er beskrevet i denne protokollen, er det anbefalt at mediet være av lignende tetthet og vekt til det som er beskrevet her (dreven vekt / densitet gjør det vanskelig for musen til å grave tilstrekkelig). For eksempel har vi funnet at små plastkuler var ikke egnet fordi de var vanskelig for musene for å skyve til side. I tillegg, noe media med en veldig sterk duft (f.eks., Gummilister og noen plastic materiale) er ikke egnet da den kan interferere med evnen til å detektere luktene som testes.
Opplæring og testing av et individ mus bør utføres av en enkelt eksperimentator, Imidlertid akklimatisering gjøres av noen eksperimentator så lenge de har deltatt i håndteringen. Alle potter som skal brukes i de fire trinnene som utføres hver dag bør være innen rekkevidde for derved å begrense mengden av tid dyret er i venteområdet mellom trinnene. Dette vil bidra til å opprettholde oppmerksomheten til musen på hver oppgave. Videre, når testing har begynt er det viktig ikke å stoppe før ferdigstillelse av oppgavene for den dagen av testing (dvs., må alle fire etapper for hver dag testing være ferdig i rekkefølge).
I konklusjonen, protokollen som er beskrevet her gir detaljerte metodiske instruksjoner for effektiv utnyttelse av AST å måle prefrontal kortikal avhengig kognitiv funksjon i mus, inkludert beskrivelseav dataanalyse og potensielle begrensninger. En rekke muse AST metoder er rapportert i primærlitteraturen, hver med sin egen distinkte prosessuelle detalj. Den unike kobling av begge tekstbasert og visuell informasjon vil være spesielt nyttig for forskere forsøkt å innlemme denne kraftige adferdsanalysen i deres vitenskapelige repertoar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet med tilskudd R01-MH090127, P30-MH089868 fra National Institute of Mental Health og pris nummer UL1TR001120 fra Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle utsikt over NIMH eller NCATS. I tillegg ønsker vi å takke for Dr. David Morilak for hans verdifull kompetanse i guiding tidlig metodeutvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
