Summary
El objetivo de este protocolo es llevar a cabo un ensayo de comportamiento tales como el conjunto de atención el cambio de tareas (AST) para evaluar la flexibilidad cognitiva corteza prefrontal mediada en ratones.
Introduction
El set atencional cambio de tareas (AST) se desarrolló como una medida de la atención y la flexibilidad cognitiva en ratas más de una década 1,2. AST es el modelo del componente intradimensional / extradimensional de la prueba de la batería neuropsicológica automatizada de Cambridge (CANTAB) que se utiliza para identificar la disfunción cognitiva en los seres humanos y los primates no humanos 3,4. Mientras que la capacidad de aprender reglas simples permanece intacta, los déficits en el aprendizaje para modificar una respuesta cuando las reglas han cambiado se encuentran en pacientes que sufren de una variedad de trastornos neuropsiquiátricos (es decir, la esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo, depresión), trastornos neurodegenerativos (es decir, la enfermedad de Parkinson) y en pacientes con lesiones de la corteza pre-frontal 5. Más en general, estos pacientes se describen como teniendo déficits en la flexibilidad cognitiva. Déficits análogos han demostrado en ambos primates no humanos y roedores cuando las lesiones camisetaso la corteza prefrontal se han inducido 1,6-8. Estos déficits indican un estado de falta de flexibilidad cognitiva o un deterioro de la capacidad de cambiar set atencional.
Un set atencional se forma cuando un sujeto se entera de que un conjunto de reglas se puede aplicar a estímulos complejos con el fin de diferenciar pertinente de las señales irrelevantes. Por ejemplo, en la AST, animales aprenderán a prestar atención y responder a la señal correspondiente (es decir, a medio excavar) e ignorar una señal irrelevante (es decir, olor), por el emparejamiento de un premio de comida con el medio. Esta asociación se refuerza luego en las tareas posteriores donde el tipo de excavación de medianas y olor cambios, pero la asociación emparejado entre el medio y la recompensa sigue siendo. Esta regla reforzada forma un conjunto cognitivo. Dos etapas dentro de los aspectos de protocolo AST medida de la flexibilidad cognitiva: la inversión y el cambio extra-dimensional. En la etapa de inversión, los estímulos previamente negativos dentro de una dimension (medio en este ejemplo) es ahora positivo, que desafía al animal a ignorar los estímulos positivos de la etapa anterior. Por ejemplo, si a medio cavar sentido fueron los estímulos positivos en la etapa anterior y papel fueron los estímulos negativos, ahora ocurre lo contrario. Esto desafía la flexibilidad del animal en que debe mantener el set atencional (es decir, el medio es la dimensión relevante), mientras que la alteración de la regla aprendida para el estímulo y el par de recompensa dentro de una dimensión. La formación de un conjunto atencional es desafiado en la etapa de cambio extra-dimensional, cuando la dimensión irrelevante (olor en este ejemplo) se convierte en la dimensión relevante. Una respuesta perseverative, como se indica por una selección continua usando la regla aprendida previamente, ya sea en fase refleja un déficit en la flexibilidad cognitiva.
Estudios de lesiones en ambos primates no humanos y roedores han demostrado regiones específicas de la corteza prefrontal se puede atribuir a la capacidad de Perform etapas particulares de la AST 1,9. Las lesiones en la corteza orbitofrontal (OFC), una subregión de la corteza prefrontal (PFC), han demostrado inducir déficits en la reversión de aprendizaje en el AST 8. Además, las lesiones en la corteza prefrontal (MPFC) plomo medial a dificultades específicas para realizar el turno extra-dimensional.
Aunque numerosos estudios utilizando el AST se han realizado en ratas y primates no humanos, relativamente pocos han utilizado AST como una medida de la función cognitiva en los ratones. Dada la facilidad de manipulación genética en ratones, y la necesidad crítica para medir la función de la corteza prefrontal en el estudio de una variedad de trastornos, adaptación y validación de esta medida de comportamiento en los ratones es una adición importante a la investigación sobre las enfermedades asociadas a la disfunción PFC. El protocolo se detalla aquí es una modificación del procedimiento por Birrell y Brown 1 que está optimizado para su aplicación en ratones y refleja muchos de ratón-específic adaptaciones que han sido reportados previamente 2,6,10-13.
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Protocol
NOTA: Los animales utilizados en este estudio son de sexo masculino C57BL / 6J entre los 4 y 6 meses de edad para obtener resultados óptimos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo luz de marcha atrás con el fin de probar convenientemente durante la fase activa (oscuro). Si la conducta se realiza en una habitación separada de la vivienda, los ratones se les permite por lo menos 1 hora de aclimatarse siguiente transporte a la sala de pruebas. Las pruebas de comportamiento se lleva a cabo bajo condiciones de luz roja minimizar la interrupción de la actividad normal de los ratones tan poco como sea posible mientras que todavía permite la iluminación adecuada experimentador controlar visualmente la sesión de prueba.
NOTA: Se llevaron todos los aspectos del procedimiento experimental descrito en el presente documento a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, octava edición (NRC) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.
- Llenar moldes de cerámica (no poroso; 1.5 "de profundidad x 2,5" de diámetro), con borde interno con la excavación medio (aproximadamente 1 "de la parte inferior); rondas de papel de filtro cortados por la mitad y pegadas en el interior de atrás de cazuela (Figura 1)
- Quiebre de cereales ligeramente dulce seco desayuno (premio de comida) - Honey Nut o variedades recubiertos de azúcar, en aproximadamente 20 piezas mg para las etapas de aclimatación, formación y las pruebas.
- Hacer una serie atencional cambio de tareas (AST) cámara (Figura 1B): Aclimatarse tren y probar cada ratón en cámaras individuales; recomendar la producción de al menos 8 cámaras.
- Construir una cámara AST 12 "x 8" x 7 "; paredes y puerta de salida hechas de acrílico blanco opaco que es fácil de limpiar con etanol al 70%. El estilo guillotina, puerta de salida extraíble separa la cámara en una sala de espera (5 "x 8") y zona de pruebas (7 "x 8").
- Incluya una Despejado 5221; x7 "partición desmontable que separa dos lados del área de pruebas de manera uniforme; Corte tres ¼ "agujeros de diámetro en la porción inferior de la partición para permitir la inhalación de acceso, espaciadas 1" aparte y 1 "de la parte delantera de la partición (Figura 1C).
2. Descripción general del procedimiento (Figura 2)
- Antes de AST, ratones domésticos individualmente y les permiten adaptarse a un ciclo de luz de marcha atrás durante al menos una semana.
- Aclimatarse, entrenar y probar cada animal en las cámaras de pruebas individuales. Asigne a cada cámara a un ratón y limpia con etanol al 70% después de terminar el último día de pruebas. Esto reducirá al mínimo el estrés durante la prueba, haciendo el olor cámara como "en casa-jaula" o "yo".
- Perfumar las macetas de ensayo 2 días antes de la prueba para permitir que el aroma se disipe; ratones no cavará en macetas que tienen un olor muy fuerte. Usando una jeringa con una aguja de 25 G, añadir aproximadamente 0,1 ml deaceite esencial para la parte superior del papel de filtro.
3. Manejo (días 1-8)
- Maneje ratones a partir 8 días antes del primer día de la restricción de alimentos. Esto reducirá el estrés asociado con el manejo durante la prueba.
- Pesar y pesos corporales récord cada día de manejo. Maneje cada ratón 2-3 minutos por día.
- Si varios experimentadores han de participar en la prueba de un grupo de ratones, asegurar que cada investigador participa en el proceso de manipulación de aumentar la familiaridad con los experimentadores y reducir el estrés y la ansiedad experimentados en el entrenamiento o los días de prueba.
- Continuar de manipulación y de grabación de los pesos a lo largo de la duración de la prueba.
4. La restricción alimenticia (Días 9-12)
- A partir de 4 días antes del inicio de la aclimatación, lugar ratones en una dieta restringida para mantener los ratones en el 80-85% de su peso corporal libre de alimentación. Dé 1 gramo de alimento por ratón por día. Si el peso del cuerpo cae por debajodel rango especificado dar 2 gramos por día hasta que regresen al rango apropiado.
- Coloque 2 moldes en la parte delantera de cada jaula con el fin de permitir que los ratones se aclimaten a las ollas de prueba. Estos son los mismos puntos utilizados para entrenar el ratón para excavar en busca de una recompensa de comida.
- Añadir 2 gramos de alimento y 1 pieza de recompensa de comida (la mitad de una pieza de cereal en cada uno) en los moldes cada día durante 4 días.
- Si el comportamiento se va a realizar en una habitación separada de aquel en el que se alojan los ratones, a partir del día 1 de la restricción de alimentos, los ratones de transporte a la sala de pruebas durante al menos 1 hr por día antes de volver a la sala de alojamiento para permitir ellos se aclimaten a la sala de pruebas.
- En el último día de la restricción de alimentos, antes del inicio de la aclimatación, cambiar la ropa de cama jaula. La ropa de cama jaula no se cambiará de nuevo hasta después de completar la prueba para reducir el estrés o la ansiedad experimentada durante el entrenamiento y las pruebas (a menos que sea absolutamente necesario).
- Mantenerratones en la restricción de alimentos hasta el final de la prueba. En los días de 13 a 17, dar de comer ratones después de la aclimatación, la formación, o las pruebas basadas en una estimación de la cantidad de recompensa alimentos consumidos (generalmente <1 g de bola de comida).
5. Aclimatación (días 13-14)
- A partir de 2 días antes del inicio de la formación, realizar la aclimatación durante el ciclo de oscuridad bajo la luz roja.
- Extender una pequeña cantidad de ropa sucia de la jaula en la cámara, esto reducirá el estrés de estar en un ambiente nuevo, introduciendo un familiar "casa-jaula" o "yo" olor a la cámara de pruebas (la misma cámara será utilizado para un solo ratón para la duración de la formación y las pruebas).
- Coloque una cazuela con agua limpia en la sala de espera de la cámara; ratones no tienden a comer si no tienen acceso al agua.
- Coloque los dos moldes que se han utilizado para la restricción de alimentos en la zona de pruebas con un premio de comida (~ 20pieza cereales mg) en cada uno.
- Coloque el ratón en el área de espera; quitar la puerta de salida y deje que el ratón para explorar la cámara durante 1 hora.
- Añadir continuamente recompensas de comida (~ 20 mg pieza cereales) a los moldes vacíos con el fin de animar a los ratones para explorar la zona de pruebas y las ollas con frecuencia.
- Asegúrese de que el ratón se puede ver el experimentador durante todo el periodo de aclimatación de modo que la presencia del experimentador no es un factor de estrés añadido durante la prueba.
6. Formación (Día 15)
- Coloque el ratón en el área de espera.
- Coloca los moldes vacíos, que contienen cada uno un premio de comida (~ 20 mg pieza de cereales), en la zona de pruebas y levantar la puerta de salida. Permita ratón 3 min para recuperar ambas recompensas de comida. Repita este paso varias veces.
- Añadir poco a poco las camas jaula aserrín / ratón para las ollas en ensayos posteriores. Permitir el ratón 3 minutos para recuperar la recompensa de comida de cada bote antes de terminar el trial. Una vez que el ratón se ha recuperado la recompensa de comida de cada bote, pasar a la siguiente prueba. Si el ratón no hace intentos de excavar una vez que el premio de comida está cubierta parcialmente, consejos pueden proporcionarse (es decir, espolvorear polvo de cereales en el área de la recompensa de comida, hacer una sangría en el aserrín en el área de la recompensa de comida, descubren parte de la recompensa de comida).
- Siga añadiendo serrín / juegos de cama después de cada ensayo hasta que el premio de comida está totalmente cubierto y el ratón fiable demuestra la capacidad de excavar en una olla llena de encontrar el premio de comida.
- Si un ratón no ha demostrado de forma fiable la capacidad de encontrar un premio de comida en una olla llena dentro de 2 horas del inicio de los entrenamientos, seguirá un segundo día de entrenamiento. Mantenga el ratón sobre la restricción de alimentos y repita este procedimiento al día siguiente.
- Si el ratón no excavar en busca de una recompensa de comida después de dos días sucesivos, excluirlo del resto del experimento, y anotar como un "fallo al cavar" en el expregistro erimental.
7. Exámenes (Días 16-17):
- En el primer día, probar la discriminación sencillo (SD), la discriminación compuesto (CD), la inversión (R1), y el desplazamiento intra-dimensional (IDS).
- En el segundo día, pruebe el desplazamiento intra-dimensional 2 (IDS2), desplazamiento intra-dimensional 3 (IDS3), la inversión de 2 (R2; opcional), turno extra-dimensional (EDS).
- Medios de par y aromas como se muestra en la Tabla 1.
- A la hora de manejar el día de la prueba, los ratones dar una recompensa de comida para evitar una falta de concentración durante la prueba a causa del hambre. Desde este punto hasta el final del día de la prueba, no podrá servir de alimento a excepción recompensas por decisiones correctas.
- Al comienzo de las pruebas, el uso de fórceps (limita la propagación de olores entre ollas), coloque un pedazo de la recompensa de comida en la olla que indica una elección correcta. La recompensa de comida debe estar completamente cubierta por los medios de comunicación (ver Figura 3). Para evitar un taco aroma de la recompensa de comida, espolvorear polvo de cereales oVER todas las ollas en el inicio de la etapa.
- Coloque el ratón en el área de espera con la puerta de salida cerrada. Coloque las ollas a cada lado de la cámara de pruebas. La prueba comienza cuando se quita la puerta de salida y se inicia el temporizador. Permita que cada ratón de 3 min por juicio para tomar una decisión. Registre la elección (correcta o incorrecta) y el tiempo hasta que el ratón hizo una elección para cada ensayo.
NOTA: Una "opción" es indicado por un intento de excavar, ya sea en bote. Una excavación sólo se registra como una opción si el ratón ha desplazado a los medios de comunicación y asomó su nariz lo suficientemente lejos en el espacio que crea para encontrar el premio de comida o lo suficientemente desplazado de los medios de comunicación para descubrir la recompensa de comida. Si un ratón no ha tomado una decisión a menos de 3 minutos, este se registra como otra opción (incorrecto). - Una vez que una elección se ha hecho ya sea para olla, retire la olla que no fue elegido de la cámara de pruebas. Si se hizo una elección correcta, permitirá el ratón para finalizar la recompensa de comida antes de colocar el ratón de nuevo enla sala de espera. Si se hace una elección incorrecta, permitir el ratón para explorar la olla para mostrar que no hay recompensa de comida para que la elección antes de devolver el ratón a la zona de espera.
- Al final de cada ensayo, colocar el ratón de nuevo en la zona de espera y sustituir la puerta de salida.
- Asegúrese de que el ratón se encuentra con el criterio de 8 ensayos correctos consecutiva para hacer avanzar a la siguiente etapa de la AST. Si un ratón no obtiene 8 decisiones correctas consecutivamente dentro de 50 ensayos, no logra esa etapa y no puede pasar a completar la prueba. 6 consecutivos sin opciones (3 min sin elección) es una falta de participación y prohíbe el ratón de pasar a la siguiente etapa.
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Representative Results
La medida dependiente típica en esta prueba es el número de ensayos por etapa para satisfacer el criterio (o 8 opciones consecutivos correctos). La Figura 4A muestra el número medio de ensayos para satisfacer el criterio en cada etapa sin tratar ratones C57BL / 6J mediante el AST. Como los ratones forman un conjunto atencional en la dimensión de referencia correspondiente (olor o medios de comunicación), el rendimiento mejorará, como se indica por una reducción en los ensayos para cumplir con el criterio en sucesivos cambios intradimensional, y las etapas de inversión y el cambio extradimensional requerirá ensayos adicionales para satisfacer criterio. Es importante para contrarrestar el número de animales que se inician en cada uno de los dos dimensiones relevantes (es decir, los medios de comunicación o de olor) como hemos observado alguna diferencia en la fase de simple discriminación se refleja en un mayor número de ensayos con el criterio si el olor es el relevante cue (Figura 4B). Si los ensayos para cumplir con el criterio en la etapa SD son significativamente diferentes entre ésimoe dos dimensiones de referencia relevantes (es decir, un mejor rendimiento cuando los medios de comunicación es relevante como en la figura 4B), datos de rendimiento de cada ratón durante las etapas posteriores pueden normalizarse a su desempeño durante la etapa de la discriminación simple. Como se ilustra en la figura 4C, esta etapa de normalización reduce la variabilidad asociada con el aprendizaje de la señal inicialmente relevante y mejora la visualización de un mejor rendimiento en las etapas posteriores de IDS. Aunque el tamaño del grupo de ~ 20 ratones serán suficientes para permitir el análisis de los datos en bruto sin normalización. Es importante destacar que, un aumento significativo en los ensayos para cumplir con el criterio durante el turno de extradimentional relativa a los cambios intradimentional anteriores indica es una importante medida de control de la validez de la prueba (Figura 4D y 4E). Antes de la etapa de cambio de ED, los ratones aprenden a prestar atención a una sola dimensión de referencia correspondiente (olor o medios de comunicación) con el fin de localizar la recompensa. El cambio a una multaw dimensión cue correspondiente, que antes era irrelevante, debe exigir más ensayos para cumplir con el criterio, lo que resulta en un cambio de ID / ED. Curiosamente, el análisis del cambio de ID / ED dentro de los datos en bruto reveló un aumento significativo en los ensayos para llegar a criterio entre IDS2 y ED (Figura 4D), y la tendencia hacia un aumento de entre IDS3 y ED (datos no mostrados, p <0,1) y un aumento entre los ensayos medios para llegar a criterio de IDS2 y IDS3 comparación con ED (datos no mostrados). Curiosamente, un significativo cambio de ID / ED fue evidente entre ambos IDS2 y IDS3 en comparación con ED cuando los datos se normalizaron a un rendimiento en la etapa SD (Figura 4E).
Se espera que aproximadamente el 70-80% de los ratones de control completará toda la tarea (tasa de abandono 20-30%). Medidas dependientes alternativos incluyen latencia media para tomar una decisión, medida en cada etapa de la tarea (aunque hemos encontrado que esto es muy variable entre los ratones),número total de errores y el número de errores "set-loss" en la inversión y las etapas de cambio extra-dimensionales como se define por Lapiz-Bluhm et al. 14, como el número de veces que una elección errónea fue hecho después de tres o más consecutivos decisiones correctas. Un mayor número de errores "set-loss" puede indicar un comportamiento perseverante. Además, los ratones suelen completar cada etapa de la prueba en menos de 30 min (Figura 5), y la duración del tiempo de permanencia en cada etapa es una función de los ensayos para llegar criterio.
En un estudio anterior utilizando un paradigma similar como se detalla aquí, lesiones neurotóxicas a la OFC o la mPFC en ratones se muestra a perjudicar el rendimiento en las etapas de cambio de reversión y extra-dimensionales, respectivamente, validando el uso de esta prueba para determinar los déficits funcionales en el mismas regiones como rata y studies11 primate no humano. Aunque la secuencia de las tareas en el mencionado estudio vligeramente a la que se muestra aquí, se espera que las lesiones aries o déficit en la OFC y mPFC también resultar en un rendimiento deteriorado en R1 y EDS, como se refleja por un aumento en el número de ensayos con el criterio en esas etapas. .
| Etapa | Pertinente | Ejemplos | Pertinente | Ejemplos | ||
| Discriminación simple (SD) | Medio | Felt (+) | Papel (-) | Olor | Nuez moscada (+) | Romero (-) |
| Compuesto Discriminación (CD) | Medio | Felt (+) / Nuez moscada | Papel (-) / Romero | Olor | Nuez moscada (+) / Felt | Romero (-) / Papel |
| Felt (+) / Romero | Papel (-) / Nuez moscada | Nuez moscada (+) / Papel | Romero (-) / Felt | |||
| Reversión 1 (R1) | Medio | Papel (+) / Romero | Felt (-) / Nuez moscada | Olor | Romero (+) / Papel | Nuez moscada (-) / Felt |
| Papel (+) / Nuez moscada | Felt (-) / Romero | Romero (+) / Felt | Nuez moscada (-) / Papel | |||
| Shift intradimensional (IDS) | Medio | Pompones | Lentejuelas (-) / Clavo | Olor </ Td> | Canela (+) / Pompones | Clove (-) / lentejuelas |
| (+) / Cinnamon | ||||||
| Pompones (+) / Clavo | Lentejuelas (-) / Canela | Canela (+) / lentejuelas | Clove (-) / Pompones | |||
| IDS2 | Medio | Limpia pipas | Ojos saltones (-) / jengibre | Olor | Tomillo rojo (+) / limpia pipas | Jengibre (-) / ojos saltones |
| (+) / Tomillo Red | ||||||
| Limpia pipas (+) / jengibre | Ojos saltones (-) / tomillo rojo | Tomillo rojo (+) / ojos saltones | Jengibre (-) | |||
| IDS3 | Medio | La cinta (+) / Vanilla | Tiras metálicas (-) / Limón | Olor | Vanilla (+) / cinta | Limón (-) / tiras metálicas |
| La cinta (+) / Limón | Tiras metálicos (-) / Vanilla | Vainilla (+) / tiras metálicas | Limón (-) / cinta | |||
| R2 | Medio | Tiras metálicas (+) / Vanilla | Cinta (-) / Limón | Olor | Limón (+) / cinta | Vainilla (-) / tiras metálicas |
| Tiras metálicas (+) / Limón | Cinta (-) / Vanilla | Limón (+) / Metal tiras pú- | Vanilla (-) / cinta | |||
| Shift Extradimensional (EDS) | Olor | Citronella (+) / Rafia | Anís (-) / Espuma | Medio | Rafia (+) / Citronella | Espuma (-) / Anís |
| Citronella (+) / Espuma | Anís (-) / Rafia | Rafia (+) / Anís | Espuma (-) / Citronella | |||
Tabla 1. Ejemplos de combinaciones de olor y medio de excavación. Los olores y los medios de excavación en estas combinaciones se han validado en este estudio. Los resultados representativos obtenidos con estas combinaciones específicas se muestran en la Figura 2.
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Figura cámara de pruebas 1. AST. (A) Imagen y dimensiones de la cazuela y el ejemplo de la colocación de papel de filtro. (B) Imagen de la cámara de pruebas AST adaptadas para ratones y (C) un diagrama tridimensional de la cámara de ensayo ilustra la colocación de los agujeros dentro de la partición.
Figura 2. Excavar medio. Ejemplos de cavar pares medios utilizados en este protocolo como se detalla en la lista de materiales (II.-xi.). Ollas están llenos aproximadamente hasta el borde interior con la excavación de medio.
Figura 3. Línea de tiempo para la prueba.
Figura 4. C57BL / 6J rendimiento en la AST. (A) Número medio de ensayos para cumplir con el criterio de la AST para machos C57BL / 6J. Los datos representan la media ± SEM (n = 22 ratones / grupo), p = 0,013 para el efecto principal de la etapa. (B) Número medio de pruebas para cumplir con el criterio en la etapa SD para las dimensiones de referencia pertinentes iniciales distintas. Los datos representan la media ± SEM (n = 22 ratones / grupo), * p = 0,01. (C) Los datos normalizados representados como un porcentaje del rendimiento individual de cada ratón en la etapa de SD. Los datos representan la media ± SEM (n = 22 ratones / grupo), p = 0,06 para el efecto principal de la etapa. (D) de desplazamiento de ID / ED en los ensayos para llegar a criterio entre IDS2 y ED. Los datos representan la media ± SEM (n = 22 ratones / grupo), * p = 0.03. (E) cambio de ID / ED en datos normalizados entre IDS3 y ED. Los datos representan la media ± SEM (n = 22 ratones / grupo), * p = 0,012.
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Discussion
Los déficit en la flexibilidad cognitiva mediadas por el PFC representar una discapacidad significativa asociada con una variedad de trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, y pueden tener un impacto importante en los resultados y la calidad de vida de las personas que sufren de estos trastornos. Optimización de la AST para su uso en ratones es de vital importancia para la investigación de las bases genéticas de las enfermedades acoplados a prefrontal disfunción cognitiva mediada cortical. Hemos encontrado que el método descrito anteriormente es una medida fiable de un déficit cognitivo específico, la flexibilidad cognitiva, y se aproxima estrechamente los resultados obtenidos usando esta tarea en ratas y primates no humanos. El método descrito es el resultado de un amplio estudio de los protocolos descritos anteriormente en ratas y ratones, así como asesoramiento y orientación de expertos en nuestra institución.
En informes anteriores utilizando tareas similares en ratones han demostrado la capacidad de adaptación de una medida de este tipo de comportamiento, aunque convarias advertencias 2,6,11. Colacicco et al. Limitaba el número de discriminaciones probados por día para 2, que se extendió de pruebas durante un período de cuatro días 11. Esto incluyó repeticiones de pares de estímulos previamente aprendidos en los días de pruebas consecutivas. Aunque eficaz, el objetivo de desarrollar el protocolo presentado aquí es reducir al mínimo la duración del período de prueba y maximizar la eficiencia. Aquí, limitamos las pruebas para un período de dos días y eliminamos repeticiones de pares de estímulos previamente aprendidos. Los investigadores anteriores han observado que los ratones que requieren sobreentrenamiento para formar un conjunto de atención y exhibir una pequeña "ventana de la capacidad de prueba" en el que se mantendrán responder con esfuerzo. Nuestro protocolo también implica sobreentrenamiento modesto en el turno intradimensional dentro de la dimensión de referencia inicialmente relevante. En particular, cuando la evaluación de los datos normalizados en la Figura 4C, parece que los ratones probados en nuestro protocolo puede exhibir un duri déficit más pronunciadong de la segunda reversión intradimensional (en relación a la etapa inmediatamente anterior). Esta observación es consistente con la noción de sobreentrenamiento con el fin de asegurar la formación de un conjunto atencional, como los ratones también mostraron un cambio de ID / ED. Una posibilidad de por qué los ratones mantener el rendimiento effortful en nuestro protocolo (Figura 5), lo que implica una longitud media sesión de 2 hr, puede ser debido a la utilización de un ciclo de luz de marcha atrás. Hemos probado el comportamiento en un aislado y dedicado sala de pruebas bajo condiciones de iluminación en rojo durante las primeras cuatro horas de la (vigilia) oscuridad ciclo. Sin embargo, las pruebas sistemáticas fuera del ámbito de aplicación de este método manuscrito sería necesario para determinar qué factores contribuyen a la duración en el que los ratones continuarán para realizar la AST, y si se sospecha que los déficits en la discriminación olfativa, preselección puede estar justificada antes de la prueba, como suplente Se han reportado metodologías libres de olores.
Adicionalmente, duranteel desarrollo inicial método, se descubrió que los ratones adultos jóvenes (de 8 a 12 semanas de edad) realizaron con mayor variabilidad que un poco mayores 4-6 meses de edad ratones. Especulamos que el protocolo de restricción de alimentos afecta a cada vez más los ratones de manera diferente que los ratones más maduros, y si bien, en un sentido clásico neurodesarrollo, el cerebro del ratón se considerará completamente desarrollado por 6 semanas, es posible que la transición de la adolescencia a la madurez adulta y la adultez temprana remodelación sináptica en el rendimiento AST confundir la corteza prefrontal en ratones más jóvenes. Sin embargo, estas preguntas fascinantes aún no se han explorado.
Otras variaciones de los protocolos de AST en ratones incluyen ensayos "libres", es decir, un número determinado de ensayos (normalmente 4) al comienzo de cada etapa no se puntúan, y se permite que el animal para explorar ambas ollas hasta que se recupera la recompensa. El protocolo se detalla aquí no incluye ningún ensayo "libres". Además, establecimos la requirements para satisfacer el criterio más riguroso (8 ensayos consecutivamente correctos al criterio en lugar del descrito anteriormente 8/10 ensayos para satisfacer el criterio) y han encontrado que esto es un indicador eficaz de si el animal ha aprendido verdaderamente la regla. Garner et al. mostró que un período de sobreentrenamiento después de un IDS (es decir, la presentación de los estímulos previamente pertinentes para un adicional de 50 ensayos) aumentó significativamente los ensayos con el criterio en el EDS 2. Aquí, incluimos varios turnos intra-dimensional, en un esfuerzo para "entrenarse" y asegurar la formación de un conjunto de atención en la dimensión correspondiente, de acuerdo con Bissonette et al. 6. Además, Garner et al. sesiones de pruebas limitadas de aproximadamente 1 hora (o cuando el ratón ya no respondió) 2, mientras que nosotros hemos encontrado que C57BL6 / J ratones adecuada y fiable progresan a través de las cuatro etapas que se les presentan cada día en un período aproximado de 2 horas (para el controlratones). Aunque, las posibles diferencias en la capacidad motora entre los grupos experimentales se deben considerar al interpretar el rendimiento. Nuestro procedimiento restringe el tiempo y el trabajo de inversión a 17 días para cada animal desde el inicio de la manipulación a través de la finalización de las pruebas. Se recomienda que un experimentador individuo limitar el número de ratones ensayados en un solo día a no más de 2 (esto puede ser modificado en base a la capacidad individual experimentador y la experiencia), que permite que un solo experimentador la capacidad de completar la prueba en al menos 6 ratones por semana. Si la función motora se deteriora ligeramente, la longitud de cada ensayo se puede aumentar, como respuesta correcta, no a la velocidad de respuesta, es la variable dependiente clave.
Discriminación visual paradigmas similares a los que se han utilizado para evaluar el rendimiento cognitivo en primates no humanos recientemente han sido adaptados para su uso en los roedores, y se puede utilizar como una alternativa a el olor y el medio discrimination tareas descritas aquí. Este enfoque puede ser necesario si diferencias significativas en la discriminación olfativa están presentes entre los grupos experimentales de ratones. Brigman et al., Han demostrado que los ratones discernir fácilmente estímulos visuales compuestas en una identificación y cambio de paradigma ED 15. Si bien este método automatizado representa mejor la prueba empleada para estudiar disfunción de la corteza prefrontal en los seres humanos y los primates no humanos, el costo de las cámaras y pantallas táctiles operantes necesarios para llevar a cabo esta prueba automatizado en ratones puede ser prohibitivo.
Se recomienda que la conducta se realizará manera más coherente posible para cada ratón, es decir, la habituación, la formación y las pruebas deben realizarse en el mismo momento del día para cada animal. Además, la sala de comportamiento debe permanecer sin cambios durante todo el experimento, por lo que el uso de espacio compartido / comunidad problemática debido al flujo de tráfico incontrolable, olor introducción, etc. Si los animales se van a transportarde una habitación de una vivienda a una habitación comportamiento a distancia (como es el caso aquí), la misma ruta se debe tomar cada vez. La sala de comportamiento debe estar en un área donde no se verá afectado el experimentador y los animales durante el procedimiento de prueba. Si varios experimentadores están realizando la tarea en la misma sala, la entrada y salida de la sala debe ser lo más limitado posible para evitar los ruidos fuertes o interrupción que pueden aumentar el estrés o la ansiedad del animal durante la prueba. Además, los experimentadores deben tener cuidado en la eliminación y sustitución de la puerta de salida, así como las ollas dentro y fuera de la cámara a fin de crear el menor ruido y la interrupción como sea posible. Los experimentos realizados en ratas han demostrado que el rendimiento AST puede ser interrumpido por diversos factores de estrés.
Que sospecha de las macetas se debe realizar cada semana y en el mismo día cada semana, por lo menos 2 días antes del primer día de pruebas. Se recomienda que las ollas son perfumadas en un pozo de ventilaciónárea ilated fuera del área donde la prueba se va a realizar (por ejemplo, laboratorio separada, vestíbulo, campana de extracción). Esto ayudará a evitar la contaminación cruzada de los olores y evitar confundir a los ratones con olores que no son parte de la prueba. Además, antes y durante la prueba, los olores fuertes que pueden distraer al animal de la discriminación (es decir, el consumo de chicles o café inmediatamente antes de la prueba, el perfume fuerte / desodorante, etc.) deben ser evitados por la razón antes mencionada. En caso de experimentadores deseo de utilizar medio de excavación alternativa de lo que se describe en este protocolo, se recomienda que el medio sea de densidad similar y peso a la descrita aquí (peso excesivo / densidad hace que sea difícil para el ratón para cavar adecuadamente). Por ejemplo, hemos encontrado que las pequeñas bolas de plástico no eran adecuados porque eran difícil para los ratones para empujar a un lado. Además, cualquier medio de comunicación con un olor muy fuerte (por ejemplo., Tiras de goma y algunos plastmaterial de ic) no es adecuado ya que puede interferir con la capacidad de detectar los aromas están probando.
Formación y las pruebas de un ratón individual deben ser realizadas por un solo experimentador, sin embargo aclimatación se puede hacer por cualquier experimentador siempre que han participado en el manejo. Todas las macetas para ser utilizados en las cuatro etapas realizadas cada día debe estar dentro de alcance a fin de limitar la cantidad de tiempo que el animal se encuentra en la zona de espera entre las etapas. Esto ayudará a mantener la atención del ratón en cada tarea. Además, una vez que ha comenzado la prueba, es importante que no se detendrá hasta la finalización de las tareas de ese día de la prueba (es decir, los 4 etapas para cada día de la prueba deben ser completados en la serie).
En conclusión, el protocolo descrito aquí proporciona instrucciones metodológicas detalladas para la utilización eficaz de la AST para medir la función cognitiva cortical dependiente prefrontal en ratones, incluyendo la descripciónde análisis de datos y advertencias potenciales. Una variedad de métodos de AST ratón se reportan en la literatura primaria, cada uno con su propia detalle procedimental distinto. El acoplamiento único tanto de la información basada en texto y visual será particularmente útil para los investigadores tratando de incorporar este poderoso ensayo de conducta en su repertorio científico.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones R01-MH090127, P30-MH089868 del Instituto Nacional de Salud Mental y el número de premios UL1TR001120 del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de la NIMH o NCATS. Además, nos gustaría reconocer y agradecer el Dr. David Morilak por su valiosa experiencia en guiar el desarrollo de métodos temprano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
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| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
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| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
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- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
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- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
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- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
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- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
