Summary
Målet med detta protokoll är att utföra en beteendeanalys såsom uppmärksamhets uppsättningen skiftande uppdrag (AST) att bedöma prefrontala cortex-medierad kognitiv flexibilitet i möss.
Introduction
Den uppmärksamhets set skiftande uppdrag (AST) utvecklades som ett mått på uppmärksamhet och kognitiv flexibilitet hos råttor över ett decennium sedan 1,2. AST är modellerad efter intradimensional / extradimensional komponent i Cambridge Neuropsychological Test Automated Batteri (Cantab) som används för att identifiera kognitiv dysfunktion i människor och icke-mänskliga primater 3,4. Även om förmågan att lära sig enkla regler förblir intakt, att underskott i lärandet ändra ett svar när reglerna har ändrats påträffas hos patienter som lider av en mängd olika neuropsykiatriska störningar (dvs, schizofreni, tvångssyndrom, depression), neurodegenerativa sjukdomar (dvs, Parkinsons sjukdom) och hos patienter med lesioner till pre-frontala cortex 5. Mer allmänt är dessa patienter beskrivs ha underskott i kognitiv flexibilitet. Analoga underskott har visats i både icke-mänskliga primater och gnagare lesioner to prefrontala cortex har inducerats 1,6-8. Dessa underskott indikerar ett tillstånd av kognitiv stelbenthet eller en nedsatt förmåga att skifta uppmärksamhets set.
En uppmärksamhets set bildas när ett ämne får reda på att en uppsättning regler kan tillämpas på komplexa stimuli för att skilja relevanta ur irrelevanta ledtrådar. Till exempel, i AST, kommer djuren lära sig att uppmärksamma och svara på den relevanta cue (dvs., grävning medium) och ignorera en irrelevant cue (dvs., lukt), genom att para en matbelöning med mediet. Denna förening sedan förstärks i efterföljande uppgifter där typen av grävning medel och luktförändringar, men den parade association mellan medium och belöning kvar. Denna förstärkta regel bildar en kognitiv set. Två faser inom AST protokoll mäter aspekter av kognitiv flexibilitet: återföring och den extra-dimensionella skift. Vid återföring stadiet, tidigare negativa stimuli inom en Dimension (medium i detta exempel) är nu positivt, vilket utmanar djuret att ignorera de positiva stimuli från föregående steg. Till exempel, om kändes gräva mediet var de positiva stimuli i föregående steg och papper var de negativa stimuli, nu det omvända är sant. Detta utmanar djurets flexibilitet i att den är bunden av sitt uppmärksamhets set (dvs, är den relevanta dimensionen mediet) samtidigt förändra regeln omar för stimulans och belöning paret inom en dimension. Bildandet av en uppmärksamhets set utmanas vid extradimensionell skift skede då irrelevant dimensionen (lukt i detta exempel) blir aktuella dimensionen. En perseverative respons, vilket indikeras av en fortsatt val med hjälp av tidigare lärt regeln, antingen vid scenen speglar ett underskott i kognitiv flexibilitet.
Lesion studier i både icke-mänskliga primater och gnagare har visat specifika regioner i den prefrontala cortex kan tillskrivas förmågan att perfOrm särskilda stadier av AST 1,9. Lesioner till orbitofrontal cortex (OFC), en underregion av prefrontala cortex (PFC), har visat sig inducera underskott i återföring lärande på AST 8. Dessutom skador till den mediala prefrontala cortex (MPFC) leda till särskilda svårigheter i att utföra extra-dimensionella skift.
Även ett stort antal studier som använder AST har utförts på råtta och primater, har relativt få utnyttjat AST som ett mått på kognitiv funktion hos möss. Med tanke på den enkla genetisk manipulation i möss, och den kritiska behovet av att mäta prefrontala cortex funktion i att studera en mängd olika sjukdomar, anpassa och validera denna beteende åtgärd i möss är ett viktigt tillskott till forskningen om sjukdomar som förknippas med PFC dysfunktion. Protokollet beskrivs här är en modifiering av förfarandet genom Birrell och Brown 1 som är optimerad för användning i möss och återspeglar många av mus-specific anpassningar som tidigare har rapporterats 2,6,10-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Djur som används i denna studie är C57BL / 6J-möss mellan fyra och sex månaders ålder för optimala resultat. Möss hålls på en omvänd ljus cykel för att bekvämt testa dem under den aktiva (mörkret) fas. Om beteendet utförs i ett rum separat från bostäder, möss ges minst 1 timme att acklimatisera efter transport till provningsrummet. Behavioral tester utförs under röda ljusförhållanden minimerar störningar i normala aktiviteten hos mössen så lite som möjligt och samtidigt tillåta försöks tillräcklig belysning för att visuellt övervaka testsession.
OBS: Alla aspekter av den experimentella proceduren som beskrivs häri utfördes i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur, 8: e upplagan (NRC) och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Texas Health Science Center på San Antonio.
- Fyll keramiska ramekins (icke-porös, 1.5 "djup x 2,5" diameter), till inre kant med grävning medium (ca 1 "från botten); filterpapper rundor skurna i halvor och tejpade till insidan baksida ramekin (Figur 1A)
- Bryt lätt sötad torra frukostflingor (livsmedel belöning) - Honey Nut eller sockerbelagda sorter, till cirka 20 mg stycken för acklimatisering utbildnings- och teststegen.
- Gör en uppmärksamhets set skiftande uppdrag (AST) kammare (Figur 1B): acklimatisera tåg och testa varje mus i individuella kammare; rekommenderar produktion av minst åtta kammare.
- Bygg en 12 "x 8" x 7 "AST kammare; väggar och startgrinden tillverkade av ogenomskinlig vit akryl som är lätt att rengöra med 70% etanol. Giljotinen-stil, separerar avtagbar startgrinden kammaren till ett väntområde (5 "x 8") och testområde (7 "x 8").
- Inkludera en Clear 5221; x7 "löstagbar skiljevägg som separerar två sidor av provområde jämnt; klippa tre ¼ "hål diameter i nedre delen av partition att tillåta sniffa tillgång, avstånd 1" från varandra och 1 "från framsidan av partitionen (Figur 1C).
2. Förfarande Översikt (Figur 2)
- Före AST, hus möss individuellt och ge dem möjlighet att anpassa sig till en omvänd ljus cykel i minst en vecka.
- Acklimatisera, tåg och testa varje djur i enskilda testkammare. Tilldela varje kammare till en mus och ren med 70% etanol efter avslutad den sista dagen av tester. Detta minimerar stress under testning genom att göra kammar luktar "hemma-bur" eller "jaget".
- Doft test krukor 2 dagar före testning att låta doften att avleda; möss kommer inte gräva i krukor som har en mycket stark lukt. Med hjälp av en spruta med en 25 G nål, tillsätt ca 0,1 mleterisk olja till toppen av filterpapper.
3. Hantering (Dagar 1-8)
- Handtag möss som börjar 8 dagar före den första dagen av mat begränsning. Detta kommer att minska stress i samband med hantering under testning.
- Väg och registrera kroppsvikter varje dag av hantering. Handtag varje mus 2-3 min per dag.
- Om flera praktiker är att vara med och testa en uppsättning möss, se till att varje försöks deltar i hanteringen för att öka kännedomen praktiker och minska stress och ångest upplevs på utbildning eller testdagar.
- Fortsätt hanterings- och inspelnings vikter under hela testningen.
4. Livsmedel begränsning (Dagar 9-12)
- Början 4 dagar före starten av acklimatisering, att placera möss på en begränsad kost hålla möss vid 80-85% av deras fria utfodring kroppsvikt. Ge 1 gram mat per mus per dag. Om kroppsvikten understigerdet angivna området ger 2 gram per dag tills de återvänder till det lämpliga intervall.
- Placera 2 ramekins på framsidan av varje buren så att möss anpassa sig till de testa krukor. Dessa är samma fläckar som används för att träna med musen för att gräva efter ett livsmedel belöning.
- Tillsätt 2 gram mat och 1 bit belöning mat (en halv bit av spannmål i varje) i formarna varje dag i 4 dagar.
- Om beteendet skall utföras i ett separat rum än den där mössen är inhysta, med början på dag 1 av begränsning mat, transporter möss till testrummet i minst 1 timme per dag före att gå till bostadsrummet för att tillåta dem att anpassa sig till testrummet.
- På den sista dagen av begränsning mat, innan acklimatisering, ändra buren sängar. Buren strö ändras inte igen förrän efter provning är klar för att minska stress eller ångest upplevs under träning och testning (inte är absolut nödvändigt).
- Bibehållmöss på mat begränsning till slutet av testningen. På dagarna 13-17, ger möss mat efter acklimatisering, utbildning eller test baserat på en uppskattning av mängden mat belöning konsumeras (vanligen <1 g livsmedel pellets).
5. Acklimatisering (Dagar 13-14)
- Början 2 dagar före starten av utbildningen, utför acklimatisering under den mörka cykeln i rött ljus.
- Sprid en liten mängd smutsiga sängkläder från buren i kammaren, kommer detta att minska stressen av att vara i en ny miljö genom att införa ett välbekant "home-bur" eller "jaget" lukt till testkammaren (samma kammare blir används för en enda mus under hela utbildningen och testning).
- Placera en ren ramekin med vatten i området väntar i kammaren; möss tenderar att inte äta om de inte har tillgång till vatten.
- Placera de två formarna som har använts för mat begränsning i testområdet med ett livsmedel belöning (~ 20mg spannmål bit) i varje.
- Placera musen i området väntar; avlägsna startgrinden och gör musen att utforska kammaren under en timme.
- Kontinuerligt lägga mat belöningar (~ 20 mg spannmål bit) till de tomma ramekins för att uppmuntra mössen att utforska testområde och krukorna ofta.
- Kontrollera att musen kan se försöksledaren under acklimatiseringsperioden så att närvaron av den som utför experimentet inte är en extra stressfaktor under testning.
6. Utbildning (Dag 15)
- Placera musen i området väntar.
- Placera de tomma ramekins, var och en innehållande en livsmedels belöning (~ 20 mg spannmål bit), in i testområde och lyft startgrinden. Låt musen 3 min för att hämta både mat belöningar. Upprepa detta steg flera gånger.
- Till sågspån / mus bur strö till krukorna i efterföljande prövningar. Låt musen 3 minuter för att hämta maten belöning från varje pott innan du avslutar trial. När musen har hämtat livsmedel belöning från varje pott, gå vidare till nästa rättegång. Om musen inte gör försök att gräva när maten belöningen är delvis täckt, kan tips lämnas (dvs, strö spannmålsdamm över området livsmedel belöning, gör ett indrag i sågspån över området livsmedels belöning, avslöja en del av mat belöning).
- Fortsätt att lägga sågspån / sängkläder efter varje försök tills maten belöningen är helt täckt och musen visar tillförlitligt förmågan att gräva i en full pott för att hitta mat belöning.
- Om en mus inte tillförlitligt har visat förmåga att hitta ett livsmedel belöning i en full pott inom 2 timmar från början av utbildningen, fortsätter till en andra dag av utbildning. Behåll musen på mat begränsning och upprepa proceduren nästa dag.
- Om musen inte gräva efter en matbelöning efter två på varandra följande dagar, utesluta den från återstoden av experimentet, och kommentera som en "misslyckades med att gräva" i experimental rekord.
7. Provning (Dagar 16-17):
- På dag ett, testa enkla diskriminering (SD), förening diskriminering (CD), återföring (R1), och intra-dimensionell shift (IDS).
- Dag två, testa intra-dimensionell skift 2 (IDS2), intra-dimensionell skift 3 (IDS3), återföring 2 (R2, tillval), extra-dimensionell shift (EDS).
- Pair media och dofter som visas i tabell 1.
- Vid tidpunkten för hantering på att testa dag, ger möss en livsmedels belöning för att undvika brist på fokus under testar för att hunger. Från denna punkt fram till slutet av testdagen, inte ger någon mat förutom belöningar för riktiga val.
- I början av försöket med hjälp pincett (begränsar spridningen av dofter mellan krukor), placera en bit av maten belöning i potten som indikerar ett korrekt val. Maten belöning ska vara helt täckta av media (se figur 3). För att undvika en doft cue från livsmedel belöning, strö spannmålsdamm over alla krukor i början av scenen.
- Placera musen i området väntar med startgrinden stängd. Placera krukorna på vardera sidan av testkammaren. Rättegången börjar när startgrinden avlägsnas och timern startas. Låt varje mus 3 min per rättegången att göra ett val. Spela valet (rätt eller fel) och tid tills musen gjorde ett val för varje försök.
ANMÄRKNING: En "val" indikeras av ett försök att gräva i endera kruka. En utgrävning registreras bara som ett val om musen har förskjutits media och petade näsan tillräckligt långt i utrymmet den skapar för att hitta mat belöning eller förskjuten nog av media för att avslöja maten belöning. Om en mus inte har gjort ett val inom 3 minuter, detta registreras som inget val (felaktig). - När ett val har gjorts för antingen potten, ta bort grytan som inte valdes från testkammaren. Om ett korrekt val gjordes, låta musen för att avsluta maten belöning innan du placerar musen tillbakaväntrummet. Om ett felaktigt val görs, låt musen för att utforska potten för att visa att det inte finns någon mat belöning för det valet innan han återvände musen till väntrummet.
- Vid slutet av varje försök, placera musen tillbaka i väntområdet och ersätta startgrinden.
- Se till att musen uppfyller kriteriet 8 korrekta rättegångar i följd för att gå vidare till nästa steg i AST. Om en mus inte erhåller åtta riktiga val i följd inom 50 försök, misslyckas det det stadiet och kan inte gå vidare för att slutföra testet. 6 på varandra följande inga val (3 min utan ett val) är ett misslyckande att delta och förbjuder musen från att gå vidare till nästa steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den typiska beroende mått i detta test är antalet försök per scenen för att möta kriteriet (eller 8 rätt följd val). Figur 4A visar det genomsnittliga antalet försök att möta kriteriet i varje steg i obehandlat C57BL / 6J använder AST. Som möss bildar en uppmärksamhets uppsättning på den relevanta cue dimensionen (lukt eller media), kommer prestanda förbättras, vilket indikeras av en minskning av försök att möta kriteriet i successiva intradimensional skift, och återföring stegen och extradimensional skiftet kommer att kräva ytterligare studier för att möta kriterium. Det är viktigt att balansera antalet djur som börjar på vardera av de två relevanta mått (dvs media eller lukt) som vi har observerat en viss skillnad på enkla diskriminering scenen återspeglas i ett ökat antal försök kriterium om lukten är den relevanta cue (Figur 4B). Om försöken att nå kriteriet vid SD stadiet är signifikant olika mellan the två relevanta cue mått (dvs, bättre prestanda när media är relevant som i figur 4B), uppgifter prestanda för varje mus under senare skeden kan normalis dess prestanda under enkla diskriminering stadiet. Som visas i figur 4C, minskar denna normalisering steg variabilitet i samband med att lära sig från början relevant cue och förbättrar visualisering av förbättrad prestanda på de efterföljande IDS stadierna. Även gruppstorlekar av ~ 20 möss kommer att vara tillräcklig för att möjliggöra analys av rådata utan normalisering. Viktigt att en betydande ökning i försöken möta kriteriet under extradimentional skift i förhållande till tidigare intradimentional skift indikerar är en viktig kontrollåtgärd av test validitet (Figur 4D & 4E). Före ED skiftstadiet, möss lära sig att uppmärksamma en enda relevant cue dimension (lukt eller media) för att lokalisera belöningen. Övergången till en new relevant cue dimension, var som tidigare irrelevant, bör kräva fler försök att nå kriteriet, vilket resulterar i ett ID / ED skift. Intressant analys av ID / ED skifte inom rådata visade en signifikant ökning i försöken att nå kriteriet mellan IDS2 och ED (Figur 4D), och trenden mot en ökning mellan IDS3 och ED (data visas ej, p <0,1) och en ökning mellan medel prövningar för att nå kriteriet IDS2 och IDS3 jämfört med ED (data ej visade). Intressant betydande ID / ED skift sågs mellan både IDS2 och IDS3 jämfört med ED då uppgifterna normaliserades till prestanda på SD stadiet (Figur 4E).
Det förväntas att ca 70-80% av kontrollmöss kommer att slutföra hela uppgiften (20-30% drop out rate). Alternativa beroende åtgärder omfattar genomsnittlig latens för att göra ett val, mätt vid varje steg i uppgiften (även om vi har funnit att det är mycket varierande mellan möss),Totalt antal fel och antal "set-förlust" fel vid återföring och extra-dimensionella skiftsteg enligt definitionen Lapiz-Bluhm et al., 14 som antalet gånger ett felaktigt val gjordes efter tre eller fler i följd riktiga val. Ett ökat antal "set-förlust" fel kan indikera en perseverative beteende. Dessutom möss slutföra vanligtvis varje steg av tester på mindre än 30 minuter (Figur 5), och varaktigheten av tiden i varje steg är en funktion av försök att nå kriteriet.
I en tidigare studie med en liknande paradigm som beskrivs här, neurotoxiska skador till OFC eller mPFC i möss visat att försämra prestanda vid återföring och extradimensionella skiftsteg respektive validera användningen av detta test för att bestämma funktionella underskott i samma områden som råtta och icke-mänskliga primater studies11. Medan sekvensen av uppgifterna i ovannämnda studie varies något som visas här, förväntas det att skador eller underskott i OFC och mPFC också kommer att leda till försämrad prestanda vid R1 och EDS, vilket avspeglas i en ökning av antalet försök kriterium i de stadier. .
| Steg | Relevant | Exempel | Relevant | Exempel | ||
| Enkel Diskriminering (SD) | Medium | Filt (+) | Papper (-) | Lukt | Muskotnöt (+) | Rosmarin (-) |
| Förening Diskriminering (CD) | Medium | Filt (+) / Muskotnöt | Papper (-) / Rosmarin | Lukt | Muskotnöt (+) / filt | Rosemary (-) / Papper |
| Filt (+) / Rosmarin | Papper (-) / Muskotnöt | Muskotnöt (+) / Papper | Rosmarin (-) / filt | |||
| Återföring 1 (R1) | Medium | Papper (+) / Rosmarin | Filt (-) / Muskotnöt | Lukt | Rosemary (+) / Papper | Muskotnöt (-) / filt |
| Papper (+) / Muskotnöt | Filt (-) / Rosmarin | Rosmarin (+) / filt | Muskotnöt (-) / Papper | |||
| Intradimensional Shift (IDS) | Medium | Pompoms | Sequins (-) / kryddnejlika | Lukt </ Td> | Kanel (+) / Pompoms | Kryddnejlika (-) / Paljetter |
| (+) / Kanel | ||||||
| Pompoms (+) / kryddnejlika | Paljetter (-) / kanel | Kanel (+) / Paljetter | Kryddnejlika (-) / Pompoms | |||
| IDS2 | Medium | Pipecleaners | Googly ögon (-) / Ingefära | Lukt | Röd timjan (+) / Pipecleaners | Ingefära (-) / Googly ögon |
| (+) / Röd timjan | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ingefära | Googly ögon (-) / Röd timjan | Röd timjan (+) / Googly ögon | Ingefära (-) | |||
| IDS3 | Medium | Ribbon (+) / Vanilla | Metalliska remsor (-) / Citron | Lukt | Vanilj (+) / Ribbon | Citron (-) / Metalliska remsor |
| Ribbon (+) / Citron | Metalliska remsor (-) / vanilj | Vanilla (+) / Metalliska remsor | Citron (-) / band | |||
| R2 | Medium | Metalliska remsor (+) / Vanilj | Ribbon (-) / Citron | Lukt | Citron (+) / Ribbon | Vanilla (-) / Metallic Strips |
| Metalliska remsor (+) / Citron | Ribbon (-) / Vanilla | Citron (+) / Metall Lic remsor | Vanilj (-) / band | |||
| Extradimensional Shift (EDS) | Lukt | Citronella (+) / Raffia | Anis (-) / Skum | Medium | Raffia (+) / Citronella | Skum (-) / anis |
| Citronella (+) / Skum | Anis (-) / Raffia | Raffia (+) / anis | Skum (-) / Citronella | |||
Tabell 1. Exempel kombinationer av lukt och gräva medium. Dofterna och gräva medier i dessa kombinationer har validerats i denna studie. Representativa resultat som erhållits med användning av dessa specifika kombinationer visas i figur 2.
hres.jpg "/>
Figur 1. AST testkammare. (A) Bild och dimensioner ramekin och exempel på filterpapper placering. (B) Bild av AST-testkammaren anpassad för möss och (C) en tredimensionell diagram av testkammaren som illustrerar placeringen av hål inom partitionen.
Figur 2. Grävmedium. Exempel på gräva medel par som används i detta protokoll så detaljerad i listan material (II.-xi.). Krukor fylls ungefär till den inre kanten med gräva medium.
Figur 3. Tidslinje för testning.
Figur 4. C57Bl / 6J prestanda i AST. (A) Genomsnittligt antal försök att möta kriteriet i AST för manliga C57BL / 6J möss. Data representerar medelvärde ± SEM (n = 22 möss / grupp), p = 0,013 för huvudsakliga effekten av scenen. (B) Genomsnittligt antal försök att nå kriteriet vid SD stadiet för distinkta initiala relevanta cue dimensioner. Data representerar medelvärde ± SEM (n = 22 möss / grupp), * p = 0,01. (C) Normaliserade data som representeras som en procentsats av varje mus individuella prestation vid SD-stadiet. Data representerar medelvärde ± SEM (n = 22 möss / grupp), p = 0,06 för huvudsakliga effekten av scenen. (D) ID / ED skift i försök att nå kriteriet mellan IDS2 och ED. Data representerar medelvärde ± SEM (n = 22 möss / grupp), * p = 0,03. (E) ID / ED skifte i normaliserade data mellan IDS3 och ED. Data representerar medelvärde ± SEM (n = 22 möss / grupp), * p = 0,012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Underskott i kognitiv flexibilitet förmedlade av PFC utgöra en betydande funktionshinder i samband med en rad olika neurologiska och neuropsykiatriska störningar, och kan ha en stor inverkan på utfall och livskvalitet för personer som lider av dessa sjukdomar. Optimering av AST för användning i möss är viktigt att undersöka de genetiska underbyggnad vid sjukdomar kopplade till prefrontala kortikala medierad kognitiv dysfunktion. Vi har funnit att den ovan beskrivna metoden är ett tillförlitligt mått på en specifik kognitiv brist, kognitiv flexibilitet, och nära approximerar de resultat som erhölls med användning av denna uppgift i råttor och icke-humana primater. Den beskrivna metoden är resultatet av en omfattande kartläggning av tidigare beskrivna protokoll i råttor och möss samt råd och vägledning av experter på vår institution.
Tidigare rapporter använder liknande arbetsuppgifter på möss har visat att anpassningsförmåga sådan beteende åtgärd, om än medflera förbehåll 2,6,11. Colacicco et al., Begränsat antalet diskriminering testade per dag till 2, vilket spred testning under fyra dygn 11. Detta inkluderade upprepningar av tidigare inlärda stimuli par på varandra följande testdagar. Medan effektiva, är målet att utveckla protokollet presenteras här för att minimera längden på testperioden och maximera effektiviteten. Här begränsar vi testa till en två dagars period och eliminera upprepningar av tidigare inlärda stimuli par. Tidigare forskare har noterat att möss kräver överträning för att bilda en uppmärksamhets set och uppvisar ett litet "fönster för testbarhet" där de kommer att behålla effortful svara. Vår protokoll innebär också blygsam överträning på intradimensional skifte inom den initialt relevant cue dimension. Särskilt när man utvärderar de normaliserade data i Figur 4C, framgår det att möss testas i våra protokoll kan uppvisa en mer uttalad underskott during den andra intradimensional återföring (relativt den omedelbart föregående steget). Denna observation är i överensstämmelse med uppfattningen av överträning i syfte att säkerställa bildandet av en uppmärksamhets uppsättning, som möss uppvisade också ett ID / ED skift. En möjlighet till varför möss upprätthålla effortful prestanda i våra protokoll (Figur 5), vilket innebär en genomsnittlig sessionslängd på 2 timmar, kan bero på användning av en omvänd ljus cykel. Vi testade beteende i en isolerad och engagerad testrum i röda ljusförhållanden under de första fyra timmarna av mörker (vakna) cykel. Dock skulle krävas systematiska tester utanför ramen för denna metod manuskript för att avgöra vilka faktorer som bidrar till hur länge där möss kommer att fortsätta att utföra AST, och om underskott i lukt diskriminering misstänks, kan prescreening vara motiverad före testning som suppleant luktfria metoder har rapporterats.
Dessutom, underden första metoden utveckling, upptäckte vi att unga vuxna möss (8-12 veckor gamla) som utförs med större variabilitet som lite äldre 4-6 månader gamla möss. Vi spekulerar att begränsningen livsmedels protokollet påverkar växande möss annorlunda än mer mogna möss och samtidigt, i en klassisk neuroutvecklingssjukdomar bemärkelse, är musen hjärnan anses fullt utvecklad av 6 veckor, är det möjligt att övergången från ungdom till vuxen mognad och tidig vuxen ålder synaptiska ombyggnad inom prefrontala cortex FÖRVÄXLA AST prestanda i yngre möss. Men dessa fascinerande frågor återstår att utforskas.
Andra varianter av AST protokoll i möss inkluderar "gratis" försök, vilket innebär en utsedd antal försök (vanligtvis 4) vid början av varje steg är inte gjort mål, och djuret tillåts utforska både krukor tills belöningen hämtas. Protokollet beskrivs här inkluderar inte några "gratis" försök. Dessutom sätter vi requiremeNTS att möta kriteriet strängare (8 konsekutivt korrekta rättegångar kriterium i stället för den tidigare beskrivna 8/10 försök att möta kriteriet) och har funnit att detta är en effektiv indikator på om djuret verkligen har lärt sig regeln. Garner et al. visade att en period av överträning efter en IDS (dvs, presentation av tidigare relevanta stimuli för ytterligare 50 försök) ökade kraftigt försöken kriterium i EDS 2. Här, vi inkludera flera intra-dimensionell skift, i ett försök att "overtrain" och se till bildandet av en uppmärksamhets uppsättning på den relevanta dimensionen, i samförstånd med Bissonette et al. 6. Dessutom Garner et al. begränsade testsessioner till ca 1 timme (eller när musen inte längre svarade) 2, medan vi har funnit att C57BL6 / J möss adekvat och tillförlitligt framsteg genom alla fyra etapper som presenteras för dem varje dag inom ungefär en 2 tim period (för styrningmöss). Även eventuella skillnader i motoriken mellan experimentella grupper bör beaktas vid tolkningen prestanda. Vår förfarande begränsar den tid och arbetskraft investeringar till 17 dagar för varje djur från början att hantera genom att fylla i testningen. Det rekommenderas att en enskild försöks begränsa antalet möss som testades i en enda dag till högst 2 (detta kan ändras utifrån individuella försöks förmåga och erfarenhet), vilket gör att en enda försöks förmåga att slutföra tester på minst 6 möss per vecka. Om motorik är lindrigt nedsatt, kan ökas längden på varje försök, korrekta svara, inte hastighet svarar, är nyckeln beroende variabeln.
Visuell diskriminering paradigm som liknar dem som har använts för att utvärdera kognitiva prestanda i icke-humana primater har nyligen anpassats för användning i gnagare, och kan användas som ett alternativ till den lukt och mediet discrimination arbetsuppgifter som beskrivs här. Detta tillvägagångssätt kan vara nödvändigt om signifikanta skillnader i lukt diskriminering före mellan experimentella grupper av möss. Brigman et al., Har visat att möss urskilja lätt sammansatta visuella stimuli i ett ID och ED skift paradigm 15. Även om detta automatiserade metod bättre återspeglar det test som används för att studera prefrontala cortex dysfunktion hos människor och icke-mänskliga primater, till kostnaden för operant kamrarna och pekskärmar krävs utföra denna automatiserade test i möss kan vara oöverkomliga.
Det rekommenderas att beteendet utförs så konsekvent som möjligt för varje mus, dvs, tillvänjning, träning och testning bör utföras vid samma tid på dagen för varje djur. Vidare bör beteendet rummet förblir oförändrade under hela experimentet, vilket gör användningen av delade / gemensamma utrymme problematisk på grund av okontrollerbar trafikflöde, lukt introduktion, etc. Om djuren ska transporterasfrån ett bostadsrummet till en avlägsen beteende rum (vilket är fallet här), bör samma väg tas varje gång. Beteendet rummet bör vara i ett område där laboratoriet och djuren inte blir störd under testförfarandet. Om flera praktiker utför uppgiften i samma rum, inresa och utresa från rummet bör vara så begränsad som möjligt för att undvika höga ljud eller störningar som kan öka stress eller ångest av djuret under testning. Dessutom bör praktiker vara försiktig i att ta bort och ersätta startgrinden liksom krukorna in i och ut ur kammaren för att skapa så lite buller och störningar som möjligt. Experiment utförda på råttor har visat att AST prestanda kan störas av olika stressfaktorer.
Doftsättning av krukorna bör utföras varje vecka och på samma dag varje vecka, minst 2 dagar före den första testdagen. Det rekommenderas att krukorna är parfymerade i ett väl ventilated område utanför det område där testet skall utföras (t.ex. separat laboratorium, hall, dragskåp). Detta kommer att bidra till att undvika korskontaminering av dofter och kommer att undvika att förvirra mössen med dofter som inte ingår i testet. Dessutom före och under testet, starka dofter som kan distrahera djuret från diskriminering (dvs, konsumtionen av tuggummi eller kaffe omedelbart före provningen, stark parfym / deodorant, etc.) bör undvikas av nyss nämnda skäl. Bör experimentatorerna önskar använda alternativa gräv medium än vad som beskrivs i detta protokoll, rekommenderas att mediet är av liknande densitet och vikt det som beskrivs här (övervikt / densitet gör det svårt för musen för att gräva ett tillfredsställande). Till exempel, fann vi att små plastpärlor inte var lämpliga eftersom de var svårt för mössen att skjuta undan. Dessutom alla medier med en mycket stark doft (t.ex.., Gummilister och vissa plastic material) är inte lämpligt eftersom det kan störa förmågan att upptäcka dofter som testas.
Utbildning och testning av en enskild mus bör utföras av ett enda försöks, kan dock acklimatisering göras av någon försöks så länge som de har deltagit i hanteringen. Alla krukor som ska användas i de fyra stegen som utförs varje dag bör vara inom räckhåll för att begränsa den tid djuret är i området väntar mellan stegen. Detta kommer att bidra till att upprätthålla uppmärksamhet musen på varje uppgift. Dessutom är det en gång testning har börjat viktigt att inte sluta förrän slutförandet av uppgifterna för den dagen av tester (dvs, måste alla 4 faser för varje test dag fyllas i följd).
Sammanfattningsvis protokollet beskrivs här ger detaljerade metodologiska instruktioner för effektivt utnyttjande av AST att mäta prefrontala kortikala beroende kognitiv funktion hos möss, inklusive beskrivningav dataanalys och potentiella varningar. En mängd mus AST metoder redovisas i den primära litteraturen, alla med sin egen distinkta processuella detalj. Den unika kopplingen av både textbaserad och visuell information kommer att vara särskilt användbart för forskare försöker införliva denna kraftfulla beteendeanalys i sin vetenskapliga repertoar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag R01-MH090127, P30-MH089868 från National Institute of Mental Health och utmärkelse nummer UL1TR001120 från National Center för Advancing Translation Sciences. Innehållet är ensamt ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIMH eller NCATS. Dessutom vill vi tacksamt erkänna Dr David Morilak för hans värdefull kompetens i att vägleda den tidiga metodutveckling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
