Introduction
Recettori del glutammato mediano la maggior parte della trasmissione sinaptica eccitatoria a livello delle sinapsi del sistema nervoso centrale. I due principali sottotipi di recettori ionotropici del glutammato localizzate alla testa dorso della membrana postsinaptica sono N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-ammino-3-idrossi-5-methylisoxazole-4-proprionic acido (AMPA) recettori. A riposo potenziali di membrana, i recettori AMPA portano la maggior parte della corrente post-sinaptica durante la trasmissione sinaptica. Nel ippocampo, il recettore NMDA svolge un ruolo chiave nello scatenare variazioni nel numero di recettori AMPA nella membrana postsinaptica: agendo come un "rivelatore coincidenza" 1 per avviare cambiamenti nella forza sinaptica 1, il recettore NMDA partecipa ai meccanismi sinaptici che si pensa di sostenere l'apprendimento e la memoria a livello subcellulare. In risposta alla depolarizzazione del neurone postsinaptico in parallelo con rilascio di neurotrasmettitore presinaptico, calcio entra attraverso l'NMDArecettore per avviare l'inserimento dei recettori AMPA o la rimozione 2. Queste dinamiche recettori sono alla base della plasticità sinaptica: un aumento della forza sinaptica è a lungo termine 2,3 potenziamento (LTP), mentre una diminuzione della forza sinaptica è la depressione a lungo termine 4 (LTD). Quindi il movimento del recettore AMPA è pensato per essere responsabile di espressione plasticità sinaptica, mentre i recettori NMDA sono pensati per controllare la sua induzione.
Determinare i precisi meccanismi alla base della trasmissione sinaptica e la plasticità è necessario studiare piccole popolazioni di sinapsi, idealmente singole sinapsi. Mentre alcune sinapsi sono molto adatti per lo studio a questo livello, ad esempio, il calice di Held 5, per le popolazioni più sinaptici questo è estremamente difficile a causa della natura piccola e diffusa delle connessioni sinaptiche. Due principali tecniche di elettrofisiologia sono state sviluppate per esaminare le connessioni sinaptiche singoli: il primo è la stimolazione minima, DOVe una fibra presinaptica si presume stimolata extracellulare. La seconda tecnica è accoppiato registrazioni, in cui si svolge due registrazioni di cellule intere simultanee da neuroni sinapticamente collegati. Un vantaggio importante di stimolazione minima è che è rapido e relativamente semplice da eseguire, coinvolgendo il posizionamento di un elettrodo di stimolazione extracellulare nel tratto assonale e contemporaneamente registrare da un neurone postsinaptico. La preoccupazione principale quando si utilizza questa tecnica è che la stimolazione affidabile di una singola cellula può raramente essere garantita prova dopo prova.
Negli ultimi quindici anni abbiamo abitualmente utilizzati accoppiato registrazioni whole-cell da due neuroni piramidali sinapticamente collegati 6-17. Il principale vantaggio di questa tecnica è che solo neurone presinaptico è coerente e affidabile stimolato. Inoltre permette non solo la caratterizzazione elettrofisiologica, ma anche la manipolazione farmacologica del neurone presinaptico 6,18 </ Sup>. Tuttavia, la probabilità di connettività sinaptica tra neuroni è basso, accoppiando collegati difficile ottenere 19. L'utilizzo di culture fetta cerebrale organotipica aggira questo ostacolo come connettività sinaptica può ristabilire in vitro ed inoltre la natura della connettività risultante è simile a quello nel tessuto cerebrale nativo 20. Inoltre, culture organotipiche esprimono LTP, LTD 7-10,12-15,21 e ulteriori forme di plasticità sinaptica a breve termine, tra cui la facilitazione paired-pulse (PPF) e depressione (PPD) 6,22,23, consentendo meccanismi di plasticità a essere studiato in coppie di neuroni. Qui si descrive la metodologia dettagliata coinvolti nel raggiungimento di successo registrazioni appaiati in questo sistema in vitro. Questa informazione può essere facilmente adattato ad altri sistemi sperimentali, tra cui fettine acute e altre regioni del cervello.
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Protocol
Etica Animale Dichiarazione:
I protocolli descritti in questo manoscritto seguono le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Università di Auckland e la Stanford University. P7 ratti sono stati sacrificati da una rapida decapitazione. Dissezione ippocampale viene quindi eseguita immediatamente come descritto di seguito.
1 Organotipica ippocampale Fetta Cultura
- Preparazione
- Preparare dissezione Media (utilizzato solo per sezionare il cervello). Unire 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 5 ml di soluzione tampone HEPES, 2 ml di soluzione 1 M Tris (pH 7,2), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro . Effettuare dissezione ippocampale in media dissezione ghiacciata.
- Raffreddare il medium dissezione. Posizionare il supporto di dissezione nel congelatore circa 1 ora prima di iniziare la dissezione fino a quando il liquido è molto freddo. Non permettere grandi cr ghiaccioystals per formare. Conservare in ghiaccio fino al momento.
- Preparare terreno di coltura (usato per tutto tranne la dissezione di ippocampi). Unire 100 ml Minimum Essential Medium, (concentrazione 1x, liquido) w / sali di Hank, w / L-glutammina, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (liquido, 10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 2,5 ml di HEPES 1 M tampone soluzione, 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank, 50 ml di siero di cavallo (definito, calore inattivato), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro.
- Preparare i piatti della cultura. Mettere 1 ml di coltura per 35 millimetri piatto di cultura, e aggiungere un inserto di membrana per ogni piatto. Mettere fino a sette di questi piatti in uno a 150 mm piastra di Petri (di seguito indicato come un 'piatto'). Porre la piastra in un incubatore CO 2 per almeno un'ora prima della dissezione inizia in modo che il terreno di coltura nei piatti raggiunge la giusta temperatura e pH.
- Dissezione del Hippocampi da Rat cuccioli a postnatale giorno 7 (P7)
- Pre-sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione sotto la luce UV prima della procedura.
- Dopo una rapida decapitazione, rimuovere il cervello e il luogo in media refrigerate in un piatto, e poi rimuoverlo per un pezzo di carta da filtro inumidita per la dissezione. Tease la corteccia dal mesencefalo utilizzando smussate spatole in plastica rivestita lisce in miniatura, esponendo l'ippocampo. Tagliare il fornice, e poi lavorare delicatamente la spatola sotto l'ippocampo per capovolgere fuori (Figura 1A).
NOTA: Riuscito culture fetta possono essere preparati utilizzando animali fino a P10. - Tagliare il ippocampo isolato dal resto del cervello. Trasferire il dell'ippocampo in un nuovo piatto contenente i media dissezione refrigerata utilizzando un pennello morbido inumidito (ad esempio, bianco sable # 4).
- Pulire la parte inferiore (cioè il lato piatto) dell'ippocampo del plesso coroideo durante la dissezione, in quanto tali, tessuti meninge-come spugnosi rendono difficile separare ippocampaleFette una dall'altra in seguito.
NOTA: Lasciare questi tessuti in atto se non possono essere presi in giro dolcemente. - Eseguire l'intero dissezione più rapidamente possibile senza danneggiare l'ippocampo.
NOTA: Un attento dissezione è più importante di un veloce, a patto che le condizioni sperimentali sono refrigerati. Affettare il ippocampi da tre ratti contemporaneamente. La salute fetta non è influenzata purché il tempo totale dall'inizio a quando le fette placcati vanno in incubatore è sotto 30 min.
- Affettare
- Affettare le dell'ippocampo trasversalmente in 400 micron sezioni utilizzando un'affettatrice manuale dei tessuti. Il metodo con cui il taglio è condotta non è importante, purché non sia troppo dannoso per il tessuto e produce fette di spessore costante con l'architettura laminare facilmente visibile (cioè corno di Ammon è facilmente visibile da conservare nel tessuto).
- Lie il dell'ippocampo sul palco del tessutochopper in cima a un triplo spessore di # 2 carta da filtro. Il ippocampi sono interamente a fette senza rimuovere alcun fette singolarmente (cioè l'intero ippocampo è lasciato sulla scena del chopper fino a quando sono stati fatti tutti i tagli, ma piuttosto come pagnotte di pane a fette, a questo punto, Figura 1B).
- Trasferire il ippocampi in mezzo dissezione con un pennello morbido di cui uno accanto ippocampo (bianco sable # 2). Spingere delicatamente ogni ippocampo di lato per rompere l'adesione tra l'ippocampo e la carta da filtro sottostante. Arrotolare la spazzola sotto ogni ippocampo a raccoglierla dal palco. Mettere tutti gli ippocampi nella stessa piastra da 35 mm di Petri di media dissezione refrigerata. Separare la ippocampi in singole sezioni agitando manualmente il piatto alternando movimenti in senso orario e antiorario.
- Ispezionare le fette sotto un microscopio da dissezione e scartare qualsiasi che vengono danneggiati, piccola, o che non possiedono cellule chiaramente visibilestrati del corpo.
NOTA: Sarà spesso il caso che non tutte le sezioni sono separate con successo dai loro fratelli in questo modo. In questo caso, essi possono essere separati da trasformandoli sul bordo e li incitamento con le punte di una pinza sottile. "Good" fette vengono poi trasferiti in un altro piatto di Petri pulita contenente medio dissezione refrigerata utilizzando un cut-off e il fuoco-lucidato pipetta Pasteur (Figure 1C-E).
- Conservazione
- Mettere le singole sezioni sugli inserti del filtro a membrana. Usando una pipetta Pasteur tagliato e fuoco lucido per dare un foro più grande, trasferire singolarmente fette agli inserti di cultura.
NOTA: La dimensione del foro creato durante il taglio e il fuoco lucidare la pipetta è importante. Troppo piccolo e le fette non sarà facile lasciare la pipetta per la membrana. Fluido troppo grande e l'eccesso è posto sulla superficie della membrana assieme alla fetta. Il miglior diametro del foro è di solito circa la metà del diametrotro del barile della pipetta. Durante il taglio, questo diametro può essere scelto tagliando al posto giusto sul cono della pipetta. - Fetta di trasferimento
- Riempire la pipetta con il mezzo prima, e poi aspirare una sola fetta con piccole forze di aspirazione. Ciò mantiene la fetta vicino all'apertura della pipetta e impedisce troppa medio espulsione nell'inserto per posizionare la fetta.
- Applicare una leggera pressione sul bulbo per formare un piccolo pensile goccia, consentono la fetta di stabilirsi in quella goccia, e poi toccare quella goccia alla membrana e lasciare la fetta "caduta" sulla membrana. Generalmente tre fette sono posizionati su ogni inserto di membrana.
NOTA: Se la gocciolina liquido è troppo grande, le goccioline delle tre fette tendono a fondersi sulla superficie della membrana, e le fette saranno quindi tutto raccogliere al centro della membrana, il che rende più difficile separarli per la registrazione elettrofisiologica tardi.
- Remov Fluidal
- Aspirare ogni eccesso di terreno dalla parte superiore dell'inserto piastra di coltura per tutte le sezioni di quel piatto (3 fette per inserto = 21 fette per piastra), in modo che le fette non sono immersi in o circondati da un pool di media dissezione.
- Eseguire questo è con un non tagliato, ma il fuoco lucidato pipetta Pasteur. Lasciare che la fetta di stabilirsi e di aderire alla membrana per un minuto prima di pipettaggio. Fare attenzione a non risucchiare la fetta alto nella pipetta. Eseguire la rimozione del liquido per gli inserti che sono placcati in primo luogo, per dare il tempo sufficiente per le fette di stabilirsi.
- Fetta di archiviazione
- Culture fetta Conservare in CO 2 incubatore 5,0% a 37 ° C. Osservare la disposizione finale delle culture in Figura 1E. Le singole sezioni poggiano su un inserto piastra di coltura che ha una membrana porosa per una parte inferiore, e questo inserto si inserisce all'interno di una capsula di Petri riempita con una piccola quantità di mezzo; in questo modo, le fette non sono immersi nel medium, ma ha accesso ad esso solo attraverso la membrana nella parte inferiore dell'inserto piastra di coltura.
- Facoltativamente, rimuovere le fette possono per motivi di studio o rimuovendo l'inserto piastra di coltura o tagliando fuori una sezione di membrana inserto contenente una fetta.
- Mettere le singole sezioni sugli inserti del filtro a membrana. Usando una pipetta Pasteur tagliato e fuoco lucido per dare un foro più grande, trasferire singolarmente fette agli inserti di cultura.
- Manutenzione
- Sostituire il mezzo in piastre di Petri il giorno dopo aver fatto le culture. Trasferire l'inserto piastra di coltura di una nuova capsula di Petri contenente 1 ml di terreno di coltura fresco che viene equilibrato in incubatrice per almeno un'ora prima del trasferimento.
- Cambiare il mezzo nuovamente nello stesso modo il terzo giorno dopo aver culture. Il terzo giorno, il trasferimento delle culture di un incubatore a 34 ° C. Modificare il medio due volte alla settimana (ogni 3-4 giorni).
- Identificare le colture sane. Selezionare colture sane per le registrazioni di cellule intere appaiati.
NOTA: colture sane hanno un bordo ben definito e uno strato di cellule piramidali chiaramente definito. Culture with scuro (probabilmente necrotico) aree presenti o un aspetto vacuolato con bordi appiattiti vengono rifiutati. Utilizzando questi criteri, di solito due terzi delle culture fetta sono sufficientemente sani per la registrazione. - Utilizzare queste culture all'interno di una relativamente piccola finestra di tempo. Non tessuti utilizzati che sono coltivate per più di due settimane da quando i neuroni cominciano a mostrare un comportamento leggermente epilettiforme che peggiora lentamente nel tempo. Il limite superiore esatto della sopravvivenza neuronale non è noto, ma è possibile registrare dal funzionamento delle cellule piramidali più tardi di 16 settimane di cultura.
2. accoppiati Registrazioni a cellula intera
- ACSF e intracellulari Solutions
- Preparare la soluzione elettrodo presinaptica mescolando (in mm) 120 gluconato di potassio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolarità: 290 mOsm). Mentre la stessa soluzione elettrodo è utilizzato per i neuroni postsinaptici, gluconato di cesio (120 mM) È tipicamente utilizzato come il principale sale nella elettrodo postsinaptica, più 5 QX314 mM.
NOTA: Questo consente di bloccaggio tensione stabile a potenziali positivi per registrare NMDAR-mediata correnti postsinaptiche 8-10,13. Inoltre impedisce l'ipereccitabilità potassio indotta del neurone presinaptico dalla soluzione interna che scorre dall'elettrodo registrazione postsinaptica prima di un sigillo giga ohm è fatta. - Preparare la soluzione elettrodo postsinaptico comporre (in mm) 120 gluconato di cesio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7.2 con CsOH; osmolarità: 290 mOsm). Tirare microelettrodi di vetro 5-10 resistenza MW e riempire con soluzione interna filtrata.
- Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) composizione (in mm) 119 NaCl, KCl 2.4, 1.3 MgSO 4, 2.4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO 3, 11 glucosio, pH 7.4, saturato con il 95% O 2, 5 % di CO 2. NOTA: Se r Ampar-mediataesponses devono essere bloccate per l'esame di NMDAR EPSCs, includono 10 mM CNQX o NBQX nel ACSF.
- Preparare la soluzione elettrodo presinaptica mescolando (in mm) 120 gluconato di potassio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolarità: 290 mOsm). Mentre la stessa soluzione elettrodo è utilizzato per i neuroni postsinaptici, gluconato di cesio (120 mM) È tipicamente utilizzato come il principale sale nella elettrodo postsinaptica, più 5 QX314 mM.
- Ottenere accoppiati interi Recordings Cellulari
- Per esaminare la trasmissione sinaptica tra due neuroni individuali, designare un neurone in neurone presinaptico e tenere in pinza per indurre potenziali d'azione e di avviare la trasmissione sinaptica.
- Designare il secondo neurone, il neurone postsinaptico, e tenerlo in clamp corrente o tensione in relazione alla informazioni richieste dal ricercatore. Ottenere un esame dettagliato delle correnti glutamatergiche, con EPSCs Ampar-mediate esaminati a -65 mV e EPSCs NMDAR mediata esaminati a +30 mV 6-16 tenendo il neurone postsinaptico in morsetto di tensione
- Stabilire una registrazione accoppiato. Per stabilire una registrazione accoppiato, la registrazione intera cellula presinaptica è sempre ottenuta prima, consentendo molteplici neuroni postsinaptici sequenziali da ottenere fino a quello che è sinapticamente Connected è ottenuta. Se l'esecuzione di esperimenti di plasticità sinaptica, è particolarmente critico per ottenere il neurone presinaptico prima come l'induzione di LTP nel neurone postsinaptico deve essere avviata entro 10 min di ottenere l'intera registrazioni cellulari per evitare dilavamento dei fattori citoplasmatici necessari per la LTP 8,19.
- Evitare la perdita di cellule movimento-indotta. Una sfida importante quando si eseguono registrazioni di cellule intere appaiati è di evitare vibrazioni e disagi indotti dal movimento della prima registrazione cellula intera, mentre ottenere la seconda registrazione.
- Ottenere la prima registrazione cellula intera e quindi spostare il microscopio lente 10-200 micron in asse x in modo che la registrazione stabilita si trova ai margini della zona visibile sul monitor (Figura 2A).
- Sollevare la lente del microscopio ~ 5-10 mm, garantendo nel contempo che il ACSF mantiene ancora il contatto con la lente. Montare il secondo elettrodo e guidare nel menisco liquido (Figura 2B
- Spostare l'elettrodo nel piano xy fino a quando non è direttamente sotto il percorso della luce attraverso l'obiettivo, ma ancora significativamente sopra l'elettrodo di registrazione stabilita. Una volta che l'elettrodo è visibile al microscopio, garantire la punta è al limite estremo del monitor lontano dal primo elettrodo.
- Spostare il secondo elettrodo nella sequenza con la messa a fuoco del microscopio fino a che entrambi gli elettrodi sono sullo stesso piano focale. E 'importante che il livello di pressione positiva è abbastanza forte per evitare punta blocco ma non troppo forte in modo da interrompere la prima registrazione cellula intera. Questo si traduce in pressione positiva inducendo movimento tra 2-3 neuroni dall'elettrodo quando entra per la prima fetta.
- Individuare un partner postsinaptico in un piano focale simile alla prima registrazione presinaptico (Figura 2C). La registrazione è generalmente associato ottenere registrazioni tra i neuroni piramidali CA3 seconda cella tutto da un neurone 0-200 mm della prima recording (Figure 2C, D).
NOTA: La trasmissione sinaptica tra coppie neuronali sono stabili su periodi di tempo fino a 3-4 ore quando si utilizzano queste tecniche intere standard di registrazione delle cellule.
- Plasticità sinaptica: Once Upon ottenere un paio di cellule piramidali sinapticamente-collegato di successo (3A figure, B), esaminare le caratteristiche di trasmissione e plasticità sinaptica.
- Induzione di LTP.
- Indurre LTP accoppiando potenziali d'azione presinaptico (1 Hz) con depolarizzazione postsinaptica a -10 a 0 mV per 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Avviare l'associazione entro 10 minuti di break-in al neurone postsinaptico.
NOTA: LTP può anche essere indotta con entrambi i neuroni tenutasi a pinza con l'associazione potenziali d'azione presinaptici e postsinaptici a 1 Hz per 1 min, con potenziali d'azione postsinaptici suscitato 10 msec dopo l'iniezione di corrente nel neurone presinaptico 8
- Indurre LTP accoppiando potenziali d'azione presinaptico (1 Hz) con depolarizzazione postsinaptica a -10 a 0 mV per 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Avviare l'associazione entro 10 minuti di break-in al neurone postsinaptico.
- Ulteriori indurre LTD dalla bassa frequenza di stimolazione (LFS) a 1 Hz combinata con una leggera depolarizzazione del neurone postsinaptico a -55 mV per 5-10 min (Figura 3C) 9.
- Induzione di LTP.
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Representative Results
Connettività Synaptic è evidente stimolando il neurone presinaptico a fuoco un potenziale d'azione passando un impulso di corrente depolarizzante (tipicamente 20-50 pA per 20 msec) tramite l'elettrodo di registrazione. La traccia corrente postsinaptica viene poi esaminato per la presenza di una EPSC monosinaptico evocata a breve (<5 msec) e latenze coerenti dopo il picco del potenziale d'azione presinaptico (Figura 3A). Nella maggior parte degli esperimenti più neuroni postsinaptici sono testati prima di un paio sinapticamente collegato può essere ottenuto. Nel complesso, ~ 1/3 celle CA3 presinaptici sono monosinaptica accoppiati alla cella CA3 postsinaptica da connessioni sinaptiche attive (Figura 3a), e circa il 20% dei neuroni CA3 sono collegati da tutto silenziose connessioni sinaptiche 6,8.
L'ampiezza della linea di base del recettore AMPA correnti mediate è variabile da prova a prova all'interno di una registrazione in coppia, e anche tra pai indipendenteregistrazioni rosso (Figura 3B) 6,8. Media ampiezza Ampar EPSC variava da <10 pA a> 800 pA, e probabilmente deriva da differenze nel numero di sinapsi funzionali tra le registrazioni appaiati. Le percentuali di fallimento sono stati osservati anche a variare in modo significativo tra le registrazioni accoppiate 6,7, che vanno dal 100% Ampar EPSC tassi di fallimento in sinapsi silenti, al 0-95% i tassi di fallimento a coppie collegate da sinapsi attive 6,7. All'interno di singole registrazioni appaiati, fallimenti sinaptiche si sono verificati, soprattutto in registrazioni con piccole ampiezze Ampar EPSC. La variabilità in Ampar EPSC ampiezza è evidente da prova a prova nei dati grezzi (Figura 3B) è probabilmente dovuto a fluttuazione numero quantico rilasciata da prova a prova, come avviene in altri sinapsi 6.
Registrazioni di cellule intere doppie forniscono anche l'accesso diretto sia al pre e il citoplasma neuronale postsinaptica, permettendo manipulat farmacologicaione di sia / sia le cellule presinaptici e postsinaptici attraverso gli elettrodi di registrazione 6. Tipicamente, manipolazioni farmacologiche presinaptici sono molto rapidi (entro 10 min). Questo non è limitata a piccole molecole (ad esempio, Bapta), come destrani fluorescente possono accedere terminali presinaptici ≤200 micron distanti l'elettrodo di registrazione. Pertanto un'analisi simile a quella eseguita presso il calamaro sinapsi gigante 25 potrebbe essere esteso agli studi di macchinari rilascio delle vescicole sinaptiche nella fetta dell'ippocampo. La posizione delle sinapsi specifiche misurate nelle registrazioni accoppiati non sono identificati nel processo di registrazione. Pertanto, il prossimale rispetto siti distali di sinapsi non può essere valutato come facilmente come la stimolazione locale con elettrodi stimolanti extracellulari o applicazione glutammato focale. Tuttavia, il riempimento tintura di ogni neurone durante la registrazione accoppiato può consentire la ricostruzione morfologica delle pergole assonale e potenziali siti sinaptici LTP e LTD sono affidabile indotte a livello delle sinapsi CA3-CA3 in questo sistema di coltura (Figura 3C), e entrambe le forme di plasticità scorso per la durata delle registrazioni cellula intera (oltre 2 ore). I paradigmi LTP e LTD induzione utilizzati sono identici a quelli effettuati in fettine acute e LTP e LTD mostra le proprietà di NMDAR-dipendenza, associatività e indipendenza percorso, e quindi questa combinazione di sistema di coltura e le registrazioni appaiati fornisce un modello di sistema prezioso per esaminare sinaptica plasticità 7. Eventi inibitori polisinaptici sono frequentemente osservati nelle registrazioni accoppiati tra coppie di cellule piramidali CA3 (Figura 3D). Noi non farmacologicamente bloccare questa inibizione GABAergica come questo produce iperattività altamente dirompente. Tuttavia, a causa della latenza di più di questi eventi inibitori polisinaptici, essi generalmente non impediscono misura della excitato monosinapticocorrente ry. Se sono stati osservati gli eventi inibitori polisinaptici di interferire con l'attuale monosinaptico, oscurando il picco della corrente monosinaptico, queste coppie devono essere esclusi dall'analisi. Connessioni eccitatorie polisinaptici sono talvolta osservati, ma sono molto meno comuni e anche sono esclusi dall'analisi. Raramente, una corrente sinaptica inibitoria monosinaptico si ottiene grazie al neurone presinaptico essere un interneurone inibitorio. Questo è facilmente identificata dalla mancanza di alloggi di azione potenziale cottura in risposta a lungo (1 sec) iniezione di corrente. Questo non è possibile nei neuroni postsinaptici in cui si basa-gluconato cesio soluzione interna. Tuttavia, come i neuroni sono identificati visivamente prima registrazione, nella nostra esperienza questa verifica <1% delle volte. Interneuroni all'interno di fettine di ippocampo organotipica sono facilmente identificabili visivamente dal loro corpo cellulare non piramidale, soprattutto nel radiatum falda e Oriens. Quindi questo preparation consente anche registrazioni di interneuroni eccitatori e correnti inibitorie. Tuttavia, si sa molto poco sulle reti inibitorie a fette organotipiche, e se mantengono la connettività simile a quella del cervello non è chiaro. 
Figura 1 Preparazione di organotipica culture fetta dell'ippocampo. (A) L'ippocampo, in situ, delineato dalla linea tratteggiata. Per rimuovere l'ippocampo, i collegamenti al fornice sono separabili e l'ippocampo delicatamente il roll-out del cervello. (B) ippocampi sono posizionati sul palco del affettatrice sulla parte superiore di carta da filtro. (C) fettine di ippocampo sono trasferiti tramite la vasta foro di una pipetta Pasteur per evitare danni. (D) Esempi di 'buoni' contro fette 'cattivo'.(E) del fumetto di installazione fetta su membrane. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2. Come ottenere accoppiato registrazioni integrali delle cellule dai neuroni CA3 dell'ippocampo. Immagini sequenziali di raggiungere una registrazione accoppiato, mostrando elettrodo ottimale e posizionamento neuronale. (A) Dopo aver ottenuto la prima cellula intera registrazione del microscopio viene spostato 10-200 mm nelle direzioni x asse in modo che la registrazione fissato (freccia) si trova ai margini della zona visibile sul monitor. Scala bar:. 25 micron (B) Per consentire camera per il secondo elettrodo, la lente del microscopio viene poi sollevato ~ 5-10 mm, assicurando che il ACSF mantiene ancora contatti conla lente. Per assicurare il secondo elettrodo non urtare l'altro elettrodo di registrazione, il secondo elettrodo viene spostato in asse x fino a quando non è direttamente sotto il percorso della luce attraverso l'obiettivo, ma ancora significativamente sopra l'elettrodo di registrazione stabilita. (C) Stabilito che mostra la registrazione abbinato entrambi gli elettrodi (frecce) nello stesso piano focale. Scala bar:. 25 micron (D) la registrazione accoppiati da neuroni CA3 adiacenti in un animale transgenico, mostrando i neuroni EGFP-positivi sul RHS. Scala bar.: 20 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3 La trasmissione sinaptica e plasticità tra CA3-CA3 coppie di cellule piramidali. (A) Esempio di pri e tracce post-sinaptici da una registrazione accoppiamento tra due neuroni piramidali CA3. In risposta ad un impulso di corrente di 20 sec per indurre presinaptico potenziale d'azione di tiro, il postsinaptica Ampar-mediata corrente (registrato a -65 mV) si verifica in risposta diretta al potenziale d'azione (B) A sinistra:. L'ampiezza di EPSCs Ampar-mediate varia non solo tra le registrazioni accoppiate, ma anche da prova-a-prova all'interno di una registrazione accoppiato. Ogni prova rappresenta l'ampiezza della EPSC misurato a 0.1 Hz. In questo esempio, Ampar EPSC ampiezza oscilla da 5 pA a> 60 pA. Destra: NMDAR EPSC ampiezze valutate al +40 mV in presenza di 10 mM CNQX. Ampiezze NMDAR EPSC sono in genere significativamente minore in ampiezza che Ampar EPSCs, ma mostrano ancora significativa variabilità. NMDAR EPSC ampiezza tipicamente in media tra i 10-20 pA nelle registrazioni appaiate tra le cellule piramidali CA3, rendendo fallimenti prontamente identificabile (C) A sinistra:. CA3 coppie di cellule piramidali esprimere LTP che persiste per la durata della registrazione accoppiato. LTP è facilmente evidente da un aumento dell'ampiezza di Ampar EPSCs. Variabilità significativa prova-a-processo in ampiezza Ampar EPSC rimane dopo l'induzione di LTP. A destra: Espressione di depressione a lungo termine (LTD) tra i neuroni piramidali CA3. Si noti la diminuzione dell'ampiezza media del Ampar EPSC e concomitante diminuzione nel processo di variabilità di ampiezza di prova. (D) Esempio di correnti post-sinaptiche inibitorie polisinaptici, che si verificano in una latenza più lunga rispetto al monosinaptico Ampar EPSC. Quando il neurone postsinaptico è tensione serrato a -65 mV, le correnti polisinaptici sono visibili come un secondo picco a una latenza di> 5 msec dopo il picco del potenziale d'azione presinaptico. Tenendo il neurone postsinaptico a -30 mV conferma che l'attuale polisinaptici è inibitorio dovuto alla inversione della direzione della corrente.ES.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 
Tabella 1. problemi potenziali derivanti registrazioni accoppiati e preparazione di culture fetta organotipica. Questo elenca i potenziali problemi comuni che si verificano con abbinati registrazioni di cellule intere culture fetta organotipica. Inoltre, si consiglia, inoltre, che è necessario molto tempo per essere spesi 'guidare' l'impostazione di elettrofisiologia per le registrazioni appaiati, come la maggior parte dei problemi sono legati alle interruzioni di movimento che possono essere facilmente visualizzati e rettificato.
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Discussion
Qui abbiamo descritto i requisiti per la creazione di successo registrazioni di cellule intere associati nel organotipica culture fetta dell'ippocampo. Registrazioni accoppiati possono essere eseguite in diverse preparazioni, tra cui fettine acute e sistemi di colture dissociate 26,27. Mentre il fuoco qui è stato sul induzione di forme di plasticità sinaptica (LTP e LTD cioè) più lunghi, è importante sottolineare che le coppie di registrazioni di cellule intere in organotipica, fetta acuta e dissociato preparazioni cellulari hanno fornito importanti informazioni in formato quantale, breve plasticità-termine, la funzione presinaptica, così come LTP e LTD 2,4,8,26,27.
Il principale vantaggio del sistema fetta organotipica è l'aumento della connettività tra i neuroni. Connettività Synaptic nella preparazione acuto fetta è il basso a causa della rottura delle connessioni assonali durante la preparazione fetta. Nella nostra esperienza, le registrazioni da sinapticamente Connecte abbinatod neuroni CA3 in fettine acute erano possibili solo ~ 5% delle registrazioni accoppiati ottenuti. Cioè, il 95% delle registrazioni accoppiati erano scollegati. Un'alternativa è quella di utilizzare primario dissociato culture ippocampo dove la connettività sinaptica è significativamente più alto 26. Tuttavia, con le preparazioni coltivate dissociate venire questioni relative all'identità neurone e se le loro proprietà sono simili a quelle delle sinapsi mature in tessuto nativo. L'utilizzo di culture fetta dell'ippocampo organotipica migliora in parte queste preoccupazioni, perché sottotipi neuronali possono essere facilmente identificati da, e le cellule mantengono la morfologia e la connettività che sono simili al tessuto cerebrale nativo 20. Tuttavia, come fette sono mantenute in vitro per più di una settimana, è importante notare che una significativa crescita assonale si verifica durante questo periodo. Il conseguente aumento della connettività è notevolmente vantaggioso per l'esecuzione di registrazioni coppie che esaminano funzione sinaptica e la plasticità, ma dovrebbeessere notato che gli studi che esaminano la connettività di rete potrebbero non essere adatti per questa preparazione.
Mentre la maggior parte delle nostre registrazioni appaiati sono stati condotti su CA3-CA3 coppie di celle piramidale, questa tecnica può essere facilmente adattato a CA3-CA1 e giro dentato-CA3 abbinato registrazioni. L'incidenza della connettività sinaptica tra il giro dentato e CA3 piramidali neuroni in questo sistema è notevolmente inferiore. Tuttavia, monosinaptici connessioni eccitatorie tra CA3 e CA1 in questo sistema sono stati segnalati per essere alto come il 76% 28.
Inoltre, abbinati registrazioni intero cellulari sono regolarmente eseguite in tessuto topo ippocampale, tra cui topi transgenici (Figura 2D) 29-31. La tecnica può essere ulteriormente raffinato per registrare la trasmissione e plasticità sinaptica tra i neuroni con l'espressione genica mosaico 30. Etichettatura di GFP wild-type neuroni permette mirato abbinato registrazioni integrali delle cellule in neuroni of noto genotipo. Questi esperimenti hanno identificato alterazioni della connettività sinaptica tra i singoli neuroni, tra cui iper-o asimmetrica funzione presinaptica 30,31 che possono contribuire a deficit comportamentali osservate in questi animali.
In sintesi, abbinati registrazioni intero cellulari aumentano la capacità di interpretare le proprietà elettrofisiologiche e sinaptiche per determinare i meccanismi subcellulari che i neuroni utilizzano per cambiare la forza sinaptica. Utilizzando questa tecnica ha permesso le previsioni dei modelli pre e post-sinaptici di plasticità sinaptica da testare direttamente. Inoltre, il fenotipo delle sinapsi silenti, e ruoli specifici di attiva-zone e le proteine PSD sono anche stati descritti in questa preparazione 6-16. Inoltre, ha consentito la scoperta che esistono sinapsi in diversi stati di elettrofisiologicamente-definiti, e che durante le sinapsi di plasticità sinaptica si muovono tra questi stati 9,17.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
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