Introduction
Glutamaat receptoren bemiddelen de meerderheid van prikkelende synaptische transmissie in het centrale zenuwstelsel synapsen. De twee belangrijkste subtypes van ionotrope glutamaatreceptoren gelokaliseerd aan het hoofd van de wervelkolom postsynaptische membraan N-methyl-D-aspartaat (NMDA) en α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazool-4-proprioniczuur (AMPA) receptoren. Bij rust membraanpotentialen, AMPA receptoren dragen meeste postsynaptische stroom tijdens synaptische transmissie. In de hippocampus, het NMDA receptor speelt een belangrijke rol bij het ontstaan van veranderingen in het aantal AMPA-receptoren in het postsynaptische membraan: door als "koincidentiedetektor" 1 tot veranderingen in synaptische sterkte 1 initiëren de NMDA receptor deelneemt aan de synaptische mechanismen die worden verondersteld om te leren en het geheugen ondersteunen op een subcellulaire niveau. In reactie op depolarisatie van het postsynaptische neuron parallel aan presynaptische afgifte van transmitter, calcium komt via de NMDAreceptor AMPA receptor inbrengen of verwijderen 2 initiëren. Deze receptor dynamiek ten grondslag liggen synaps plasticiteit: een toename van de synaptische kracht is op lange termijn potentiëring 2,3 (LTP), terwijl een afname in synaptische kracht is op lange termijn depressie 4 (LTD). Daarom AMPA receptor beweging wordt verantwoordelijk geacht voor synaptische plasticiteit expressie, terwijl NMDA-receptoren wordt gedacht dat de inductie controleren.
Het bepalen van de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische transmissie en plasticiteit vereist het bestuderen van kleine populaties van synapsen, idealiter enkele synapsen. Terwijl sommige synapsen zeer geschikt voor onderzoek op dit niveau, bijvoorbeeld de calyx van Held 5 voor de meeste synaptische populaties is uiterst moeilijk door de kleine en diffuse aard van de synaptische verbindingen. Twee belangrijke elektrofysiologie technieken ontwikkeld enkelvoudige synaptische verbindingen onderzocht: het eerste is minimaal stimulatie, where een presynaptische vezel wordt verondersteld gestimuleerd extracellulair. De tweede techniek is gekoppeld opnamen, waarbij twee simultane gehele cellen opnames van synaptisch verbonden neuronen wordt uitgevoerd. Een groot voordeel van minimale stimulatie is dat het snel en relatief eenvoudig uit te voeren, waarbij de plaatsing van een extracellulair stimulerende elektrode in de axonale kanaal tegelijkertijd opnemen van een postsynaptische neuron. De primaire zorg bij het gebruik van deze techniek is dat betrouwbare stimulatie van een enkele cel zelden worden gegarandeerd proef na proef.
In de afgelopen vijftien jaar hebben we routinematig gebruikt gepaarde whole-cell opnames van twee synaptically verbonden piramidale neuronen 6-17. Het grote voordeel van deze techniek is dat slechts een presynaptische neuron consistent en betrouwbaar wordt gestimuleerd. Ook kan niet alleen elektrofysiologische karakterisering maar ook farmacologische manipulatie van het presynaptische neuron 6,18 </ Sup>. De waarschijnlijkheid van synaptische verbindingen tussen neuronen is laag, waardoor verbonden paren moeilijk te verkrijgen 19. Het gebruik van organotypische brain slice cultures omzeilt het obstakel als synaptische connectiviteit kan herstellen in vitro en bovendien de aard van de resulterende verbinding is vergelijkbaar met die van natief hersenweefsel 20. Bovendien organotypische kweken drukken LTP, LTD 7-10,12-15,21 en andere vormen van kortdurende synaptische plasticiteit inbegrip gepaarde puls facilitatie (PPF) en depressie (PPD) 6,22,23, waardoor plasticiteit mechanismen bestudeerd in paren neuronen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie betrokken succes bereiken gekoppeld opnamen in dit in vitro systeem. Deze informatie kan gemakkelijk worden aangepast aan andere experimentele systemen, waaronder acute segmenten en andere hersengebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Ethics Verklaring:
De in dit manuscript beschreven protocollen volgen de verzorging van dieren richtlijnen opgesteld door de Universiteit van Auckland en Stanford University. P7 rat pups werden gedood door snelle onthoofding. Hippocampale dissectie wordt onmiddellijk uitgevoerd zoals hieronder beschreven.
1 Organotypische hippocampus Slice Cultuur
- Voorbereiding
- Bereid dissectie Medium (alleen gebruikt voor het ontleden van de hersenen). Combineer 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml penicilline-streptomycine oplossing (10.000 eenheden elk in 0,85% NaCl), 5 ml HEPES bufferoplossing, 2 ml 1 M Tris voorraadoplossing (pH 7,2), en filter steriliseren met 0,22 urn filter . Voeren hippocampus dissectie in ijskoud dissectie medium.
- Koel de dissectie medium. Plaats de dissectie media in de vriezer ongeveer 1 uur voor het begin van de dissectie tot de vloeistof koud. Laat geen grote ijs crystals te vormen. Bewaar op ijs tot vereist.
- Bereid kweekmedium (gebruikt voor alles behalve dissectie van de hippocampus). Combineer 100 ml Minimum Essential Medium (1x concentratie vloeistof) w / Hank's zouten, w / L-glutamine, 2 ml penicilline-streptomycine oplossing (vloeistof, 10.000 eenheden van elk, in 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M buffer oplossing, 50 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing, 50 ml Paard Serum (gedefinieerd, hitte geïnactiveerd) en filter steriliseren met 0,22 um filter.
- Bereid de cultuur gerechten. Plaats 1 ml van de cultuur media per 35 mm cultuur schotel en voeg een membraan insert bij elk gerecht. Zet maximaal zeven van deze gerechten in een 150 mm petrischaal (hierna aangeduid als een 'plaatje'). Plaats de plaat in een CO 2 incubator voor ten minste een uur voor de dissectie begint, zodat het kweekmedium in de gerechten bereikt de juiste temperatuur en pH.
- Dissectie van de hippocampus van jonge ratten op postnatale dag 7 (P7)
- Pre-steriliseren alle dissectie-instrumenten onder UV-licht voor de ingreep.
- Na een snelle onthoofding, verwijder de hersenen en de plaats in gekoelde medium in een schotel, en verwijder deze vervolgens naar een stukje vochtig filtreerpapier voor de dissectie. Plagen de cortex weg van de middenhersenen met stompe gladde kunststof gecoate miniatuur spatels, het blootstellen van de hippocampus. Snijd de fornix, en dan zachtjes werken de spatel onder de hippocampus te flippen (Figuur 1A).
OPMERKING: Succesvolle slice culturen kan worden bereid met behulp van dieren tot P10. - Knip de geïsoleerde hippocampus van de rest van de hersenen. Breng de hippocampus in een nieuwe schotel met gekoelde dissectie media met behulp van een vochtige zachte kwast (bv wit sable # 4).
- Reinig de onderzijde (de vlakkere kant) van de hippocampus van choroid plexus tijdens dissectie, omdat deze sponsachtige, meninge-achtige weefsels bemoeilijkt hippocampale scheidenplakjes van elkaar later.
OPMERKING: Laat deze weefsels in de plaats als ze niet voorzichtig kan worden geplaagd weg. - Voer de gehele dissectie zo snel mogelijk zonder beschadiging van de hippocampus.
OPMERKING: Een zorgvuldige dissectie is belangrijker dan een snel, zolang de experimentele omstandigheden worden gekoeld. Snijd de hippocampus van ratten drie tegelijk. Het segment gezondheid niet zolang de totale tijd vanaf start beïnvloed wanneer de geïllustreerde schijfjes gaan in de incubator onder 30 minuten.
- Slicing
- Snijd de hippocampus in de dwarsrichting in 400 micrometer doorsnede met behulp van een handleiding weefsel snijmachine. De wijze waarop het snijden wordt uitgevoerd is niet belangrijk, zolang het niet overdreven schadelijk voor het weefsel en produceert plakjes constante dikte van gemakkelijk toegankelijk laminaire architectuur (dwz Ammon's hoorn wordt gemakkelijk gezien worden bewaard in het weefsel).
- Liggen de hippocampus op het podium van het weefselchopper op een drievoudige dikte van # 2 filtreerpapier. De hippocampus zijn geheel gesneden zonder enige plakjes individueel verwijderen (dat wil zeggen de gehele hippocampus is links op het podium van de helikopter totdat alle bezuinigingen zijn gemaakt, maar veeleer als broden van gesneden brood op dit punt; Figuur 1B).
- Breng de hippocampus in dissectie medium met behulp van een ontspannen naast elkaar hippocampus zacht penseel (wit sable 2 #). Schuif dan ieder hippocampus naar de zijkant om de hechting tussen de hippocampus en de onderliggende filterpapier breken. Rol de borstel onder elk hippocampus om het op te rapen van het podium af. Plaats alle hippocampus in dezelfde 35 mm petrischaal van gekoelde dissectie medium. Scheiden de hippocampus in de afzonderlijke segmenten van de hand schudden van de schotel in afwisselend met de klok mee en tegen de klok in bewegingen.
- Inspecteer de plakjes onder een dissectie microscoop en gooi elke die beschadigd, kleine, of die duidelijk zichtbaar cel niet bezittenbody lagen.
Opmerking: Het is vaak het geval dat niet alle segmenten met succes gescheiden van hun siblings deze wijze zijn. In dit geval kunnen zij worden gescheiden door ze op scherp en porren ze met de uiteinden van fijne pincet. "Goed" slices worden vervolgens overgebracht naar een schone petrischaal met koud dissectie medium met een afgesneden en vuur gepolijste Pasteur pipet (Figuren 1C-E).
- Opslag
- Leg de afzonderlijke segmenten op het membraan filter inserts. Met behulp van een Pasteur pipet afgesneden en vuur gepolijst tot een grotere boring geven, afzonderlijk segmenten dragen inzetstukken cultuur.
OPMERKING: De grootte van de boring ontstaat wanneer Vuurwapens en polijsten de pipet is belangrijk. Te klein en de plakjes niet gemakkelijk de pipet voor de membraan verlaat. Te groot en overtollige vloeistof wordt op het oppervlak van het membraan geplaatst, samen met het segment. De beste boring typisch ongeveer de helft van de diameter van het vat van de pipet. Bij het snijden, kan deze diameter worden gekozen door te snijden op de juiste plaats in de tapsheid van de pipet. - Slice Transfer
- Vul de pipet met een medium, en dan zuigen een enkel schijfje met kleine zuigkrachten. Dit houdt de plak bij de opening van de pipet en voorkomt te veel medium uitzetting in het inzetstuk aan het segment plaatsen.
- Breng een lichte druk op de lamp om een kleine hangende druppel te vormen, zodat het schijfje te vestigen in die druppel, en raak die druppel aan het membraan en laat het stukje "val" op het membraan. Algemeen drie plakjes worden geplaatst op elk membraan insert.
Opmerking: Als de vloeistof druppel te groot is, de druppels van de drie segmenten lijken over te gaan op het membraanoppervlak en de plakken zal dus meer tezamen naar het midden van het membraan, waardoor het moeilijker om ze later te scheiden voor elektrofysiologische opname.
- Fluid Removal
- Zuig overtollige medium uit de top van de kweekplaat inzetstuk voor alle segmenten in die plaat (3 segmenten per wisselplaat = 21 plakken per plaat), waardoor schijfjes niet worden ondergedompeld in of omgeven door een pool van dissectie medium.
- Voer deze is met een ongesneden, maar-vuur gepolijste Pasteur pipet. Laat de slice om zich te vestigen en zich te houden aan het membraan voor een minuut voordat pipetteren. Zorg ervoor dat u het stukje omhoog in de pipet te zuigen. Uit te voeren verwijdering vloeistof voor de inserts die eerste zijn bedekt, zodat er voldoende tijd voor de plakjes laten bezinken.
- Slice-opslag
- WINKEL slice cultures in een 5,0% CO2 incubator bij 37 ° C. Let op de uiteindelijke opstelling van de culturen in figuur 1E. De afzonderlijke segmenten rusten op een petrischaal inzetstuk dat een poreus membraan voor een bodem heeft en dit inzetstuk past in een petrischaal gevuld met een kleine hoeveelheid van het medium; Op deze wijze worden de schijfjes niet ondergedompeld in het medium, maar toegankelijk is alleen door het membraan onder in de kweekplaat insert.
- Optioneel, verwijder de plakjes kan voor studie, hetzij door het verwijderen van de cultuur plaat insert of door het uitsnijden van een deel van de insert membraan met een slice.
- Leg de afzonderlijke segmenten op het membraan filter inserts. Met behulp van een Pasteur pipet afgesneden en vuur gepolijst tot een grotere boring geven, afzonderlijk segmenten dragen inzetstukken cultuur.
- Onderhoud
- Wisselen het medium in de petrischaaltjes de dag na het maken van culturen. Breng de kweek inzetrooster in nieuw petrischaaltje met 1 ml vers kweekmedium dat is geëquilibreerd in de incubator gedurende ten minste een uur vóór de overdracht.
- Verander het medium weer op dezelfde wijze op de derde dag na het maken van culturen. Op de derde dag, de overdracht van de culturen tot een incubator ingesteld op 34 ° C. Verander het medium twee keer per week (om de 3-4 dagen).
- Identificeer gezonde culturen. Kies gezonde culturen voor gepaarde hele cel opnames.
OPMERKING: Gezonde culturen hebben een goed gedefinieerde rand en een duidelijk omschreven piramidale cellaag. Culturen with donker (waarschijnlijk necrotische) gebieden aanwezig zijn of een gevacuoleerde verschijning met afgeplatte grenzen worden afgewezen. Gebruikmakend van deze criteria, gewoonlijk tweederde van slice cultures voldoende gezond voor opname. - Gebruik maken van deze culturen binnen een vrij kleine venster van de tijd. Niet gebruikte weefsels die gekweekt voor meer dan twee weken zijn aangezien de neuronen beginnen enigszins epileptische gedrag dat langzaam erger wordt met de tijd weer. De exacte bovengrens van neuronale overleving is niet bekend maar het is mogelijk opnemen functioneren piramidale cellen zo laat als 16 weken in kweek.
2 Gekoppelde Whole Cell Recordings
- ACSF en intracellulaire Solutions
- Bereid presynaptische elektrode oplossing door het mengen (in mM) 120 kaliumgluconaat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP en 0,3 NaGTP (pH 7,2 met KOH; osmolariteit: 290 mOsm). Hoewel die elektrode oplossing wordt gebruikt voor postsynaptische neuronen, cesium gluconaat (120 mM) Wordt typisch gebruikt als de belangrijkste zout in de postsynaptische elektrode plus 5 mM QX314.
OPMERKING: Dit maakt stabiele spanning klemmen op positieve mogelijkheden om postsynaptische-NMDAR gemedieerde stromen 8-10,13 opnemen. Het voorkomt ook dat de kalium-geïnduceerde hyperexciteerbaarheid van de presynaptische neuron door de interne oplossing die uit de postsynaptische registratie-elektrode voor een zegel giga ohm wordt gemaakt. - Bereid postsynaptische elektrode samenstellen oplossing (in mM) 120 cesium gluconaat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 NaATP en 0,3 NaGTP (pH 7,2 met CsOH, osmolariteit: 290 mOsm). Trek glazen micro-elektroden 5-10 MQ weerstand en vullen met gefilterd interne oplossing.
- Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) samenstellen (in mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1.3 MgSO4, 2,4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3, 11 glucose, pH 7,4, verzadigd met 95% O2, 5 % CO 2. OPMERKING: Als Ampar-gemedieerde responses moeten worden geblokkeerd voor het onderzoek van NMDAR EPSCs, inclusief 10 uM CNQX of NBQX in de ACSF.
- Bereid presynaptische elektrode oplossing door het mengen (in mM) 120 kaliumgluconaat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP en 0,3 NaGTP (pH 7,2 met KOH; osmolariteit: 290 mOsm). Hoewel die elektrode oplossing wordt gebruikt voor postsynaptische neuronen, cesium gluconaat (120 mM) Wordt typisch gebruikt als de belangrijkste zout in de postsynaptische elektrode plus 5 mM QX314.
- Verkrijgen Gekoppelde Whole Cell Recordings
- Om synaptische transmissie tussen twee individuele neuronen te onderzoeken, wijst een neuron als het presynaptische neuron en houden in de huidige klem om actiepotentialen opwekken en initiëren van synaptische transmissie.
- Wijzen de tweede neuron, als de postsynaptische neuron, en houd hem in stroom of spanning klem afhankelijk van de door de onderzoeker informatie. Verkrijgen van gedetailleerd onderzoek van de glutamaat stromingen, met Ampar-gemedieerde EPSCs bij -65 mV onderzocht en-NMDAR gemedieerde EPSCs onderzocht bij 30 mV 6-16 door het vasthouden van de postsynaptische neuron in voltage clamp
- Opzetten van een gepaarde opname. Om een gekoppeld opname vast te stellen, wordt de presynaptische hele cel opname altijd eerst verkregen, waardoor meerdere opeenvolgende postsynaptische neuronen te worden verkregen tot een die synaptically connected wordt verkregen. Als uitvoeren synaptische plasticiteit experimenten is bijzonder kritisch voor het presynaptische neuron eerste verkrijgen de inductie van LTP in het postsynaptische neuron op 10 min van het verkrijgen van de volledige cel opnamen washout van cytoplasmatische factoren die nodig zijn voor LTP 8,19 voorkomen moet worden gestart.
- Vermijd beweging geïnduceerde cel verlies. Een grote uitdaging bij het uitvoeren van gepaarde hele cel opnames is het vermijden van trillingen en-beweging geïnduceerde verstoring van de eerste hele cel opname, terwijl het verkrijgen van de tweede opname.
- Haal het eerste gehele cel opnemen en vervolgens de microscoop lens 10-200 urn in de x-as, zodat de vastgestelde opname ligt aan de rand van het gebied zichtbaar op de monitor (figuur 2A).
- Til de lens van de microscoop ~ 5-10 mm, terwijl ervoor te zorgen dat de ACSF contact met de lens nog steeds handhaaft. Monteer de tweede elektrode en begeleiden in de vloeistof meniscus (Figuur 2B
- Beweeg de elektrode in het xy vlak tot het direct onder de lichtbundels door de lens, maar nog steeds aanzienlijk boven de vastgestelde registratie-elektrode. Als de elektrode zichtbaar onder de microscoop, zorgen de tip aan de uiterste rand van het beeldscherm van het eerste electrode.
- Beweeg de tweede elektrode in sequentie met de microscoop nadruk totdat beide elektroden in hetzelfde focal plane. Belangrijk is dat het niveau van positieve druk sterk genoeg om tip verstopping te voorkomen, maar niet te sterk om het eerste hele cel opname verstoren. Dit vertaalt zich naar de overdruk inducerende beweging 2-3 neuronen van de elektrode wanneer het eerst het segment binnenkomt.
- Zoek een postsynaptische partner in een soortgelijke focal plane naar de eerste presynaptische opname (figuur 2C). Opname wordt krijgen over het algemeen gepaard opnames tussen CA3 piramidale neuronen de tweede hele cel uit een 0-200 mm neuron van de eerste ropnametechnieken (Figuren 2C, D).
OPMERKING: Synaptic transmissie tussen neuronale paren zijn stabiel in de tijd een periode van maximaal 3-4 uur bij gebruik van deze standaard whole cell opnametechnieken.
- Synaptische plasticiteit: Once Upon verkrijgen van een succesvolle synaptically-verbonden piramidale cel pair (Figuren 3A, B), op de kenmerken van de synaptische transmissie en plasticiteit.
- LTP inductie.
- Induceren LTP door het koppelen presynaptische actiepotentialen (1 Hz) met postsynaptische depolarisatie tot -10 tot 0 mV gedurende 1 min (Figuur 3C) 7-9,12-14. Koppeling tot stand brengen binnen 10 min van de inbraak in het postsynaptische neuron.
OPMERKING: LTP kan worden geïnduceerd met zowel neuronen dat op lopende clamp door koppelen presynaptische en postsynaptische actiepotentialen 1 Hz gedurende 1 min, met postsynaptische actiepotentialen opgewekt 10 msec na injectie van stroom in het presynaptische neuron 8
- Induceren LTP door het koppelen presynaptische actiepotentialen (1 Hz) met postsynaptische depolarisatie tot -10 tot 0 mV gedurende 1 min (Figuur 3C) 7-9,12-14. Koppeling tot stand brengen binnen 10 min van de inbraak in het postsynaptische neuron.
- Verder induceren LTD by laagfrequente stimulatie (LFS) 1 Hz in combinatie met een lichte depolarisatie van het postsynaptische neuron tot -55 mV gedurende 5-10 min (Figuur 3C) 9.
- LTP inductie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synaptische connectiviteit is duidelijk door het stimuleren van de presynaptische neuron om een actiepotentiaal te vuren door het passeren van een depolariserende stroomstoot (meestal 20-50 jaar voor 20 msec) via de registratie-elektrode. De postsynaptische stroom trace wordt dan voor de aanwezigheid van een monosynaptic EPSC onderzocht opgeroepen Snel (<5 msec) en consistent latencies na de piek van de presynaptische actiepotentiaal (Figuur 3A). In de meeste experimenten meerdere postsynaptische neuronen zijn getest voor een synaptisch verbonden pair kan worden verkregen. Kortom, ~ 1/3 van presynaptische CA3 cellen monosynaptische gekoppeld met de postsynaptische cel door CA3 gezien synaptische verbindingen (figuur 3A), en ongeveer 20% van CA3 neuronen worden verbonden door alle stille synaptische verbindingen 6,8.
De amplitude van de basislijn AMPA receptor gemedieerde stromen is variabel van proef tot proef binnen een gekoppelde opname, en ook tussen onafhankelijke pairood opnamen (figuur 3B) 6,8. Gemiddelde Ampar EPSC amplitude variëren van <10 pA tot> 800 pA en waarschijnlijk ontstaat door verschillen in het aantal functionele synapsen tussen gepaarde opnames. Uitval zijn ook waargenomen om aanzienlijk verschillen tussen gepaarde opnames 6,7, variërend van 100% Ampar EPSC uitval bij stille synapsen, tot 0-95% uitval in paren verbonden door actieve synapsen 6,7. Binnen de individuele gepaarde opnames, synaptische mislukten, vooral bij opnames met kleinere Ampar EPSC amplitudes. De variabiliteit in Ampar EPSC amplitude blijkt uit onderzoek voor de rechter in de ruwe data (Figuur 3B) is waarschijnlijk te wijten aan fluctuaties in quantale aantal vrijgelaten uit de proef naar proef, zoals gebeurt bij andere synapsen 6.
Dual whole cell opnames bieden ook directe toegang tot zowel de pre-en de postsynaptische neuronale cytoplasma, waardoor farmacologische manipulation van of / zowel de presynaptische en postsynaptische cellen via de registrerende elektroden 6. Typisch presynaptische farmacologische manipulaties zeer snel (binnen 10 minuten). Dit is niet beperkt tot kleine moleculen (bijvoorbeeld BAPTA), zoals fluorescent gelabelde dextranen kunt presynaptische terminals ≤200 urn van het registratie-elektrode. Daarom analyse vergelijkbaar met die uitgevoerd in de reuzeninktvis synaps 25 kan worden uitgebreid naar studies van synaptische blaasjes vrijkomen machines in de hippocampus slice. De positie van het specifieke synapsen gemeten in de gepaarde opnamen zijn niet geïdentificeerd in het opnameproces. Daarom is de proximale versus distale locaties van synapsen niet zo gemakkelijk kan worden beoordeeld als lokale stimulatie met extracellulaire stimulerende elektroden of focale glutamaat toepassing. Echter, kan kleurstof vullen van elk neuron in de gepaarde opname morfologische reconstructie van axonale priëlen en potentiële synaptische locaties mogelijk te maken LTP en LTD betrouwbare wijze worden geïnduceerd CA3-CA3 synapsen in dit kweeksysteem (figuur 3C), en beide vormen van plasticiteit laatste gedurende de duur van volledige cel opnamen (in 2 uur). De LTP en LTD inductie paradigma's gebruikt zijn identiek aan die uitgevoerd in acute plakjes en LTP en LTD vertonen de eigenschappen van NMDAR-afhankelijkheid, associativiteit en route onafhankelijkheid, en daarom is deze combinatie van cultuur systeem en gekoppeld opnames biedt een waardevol modelsysteem voor synaptische onderzoeken plasticiteit 7. Polysynaptic remmende gebeurtenissen worden vaak waargenomen in gepaarde opnames tussen CA3 piramidale cel paren (Figuur 3D). We hebben geen farmacologisch blokkeren deze remming GABAergic als deze produceert een zeer onderscheidende hyperactiviteit. Vanwege de langere latentie van deze polysynaptic remmende gebeurtenissen, zij doorgaans geen meting van de monosynaptic excitato voorkomenry huidige. Als de polysynaptic remmende werden waargenomen interfereren met de huidige monosynaptic, verduistert de piek van de huidige monosynaptic moeten deze paren van de analyse uitgesloten. Polysynaptic prikkelende verbindingen worden soms waargenomen, maar aanzienlijk minder vaak ook uitgesloten van de analyse. Zelden wordt een monosynaptic remmende synaptische stroom verkregen als gevolg van het presynaptische neuron dat een remmende interneuron. Dit wordt gemakkelijk vastgesteld door het gebrek aan accommodatie van actiepotentiaal afvuren reactie langer (1 sec) stroominjectie. Dit is niet mogelijk in postsynaptische neuronen waarbij de inwendige oplossing cesium gluconaat-based. Aangezien neuronen visueel geïdentificeerd voor de opname, in onze ervaring dit gebeurt <1% van de tijd. Interneuronen in organotypische hippocampale plakken worden gemakkelijk visueel geïdentificeerd door hun niet-piramidale cellichaam, vooral in het stratum radiatum en oriens. Daarom is deze preparation maakt ook opnames van interneuron prikkelende en remmende stromen. Echter, heel weinig is bekend over de remmende netwerken in organotypische plakjes, en of ze connectiviteit vergelijkbaar met die in de hersenen te behouden is niet duidelijk. 
Figuur 1 Bereiding van organotypische hippocampus slice cultures. (A) De hippocampus, in situ, door de stippellijn aangegeven. Om de hippocampus verwijderd, worden de verbindingen met de fornix doorgesneden en hippocampus voorzichtig uitgerold van de hersenen. (B) Hippocampi staan de fase van de slicer boven op filtreerpapier. (C) hippocampus plakjes worden via de brede overgebracht boring van een Pasteur pipet om schade te voorkomen. (D) Voorbeelden van 'goede' versus 'slechte' plakjes.(E) van het beeldverhaal van slice setup op membranen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 2 Het verkrijgen van gepaarde hele cel opnamen van hippocampale CA3 neuronen. Opeenvolgende beelden van het bereiken van een gepaarde opname, waarin optimale elektrode en neuronale positionering. (A) Na het behalen van de eerste hele cel opnemen van de microscoop wordt verplaatst 10-200 mm in de x- as, zodat de gevestigde opname (pijl) bevindt zich aan de rand van het gebied zichtbaar op de monitor. Schaalbalk:. 25 pm (B) Om ruimte voor de tweede elektrode in te schakelen, wordt de lens van de microscoop hief ~ 5-10 mm, ervoor te zorgen dat de ACSF onderhoudt nog steeds contact met dede lens. De tweede elektrode waarborgen ofwel geen oneffenheden andere registratie-elektrode, is de tweede elektrode verplaatst in de x-as totdat deze direct onder de lichtbundels door de lens, maar nog steeds aanzienlijk boven de vastgestelde registratie-elektrode. (C) opgericht gekoppeld opname showing beide elektroden (pijlen) in dezelfde focal plane. Schaalbalk:. 25 micrometer (D) Gekoppelde opname van aangrenzende CA3 neuronen in een transgeen dier, waarin de EGFP-positieve neuronen op de RHS. Schaalbalk:. 20 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 3 Synaptische transmissie en plasticiteit tussen CA3-CA3 piramidale cel paren. (A) Voorbeeld van popnieuw en postsynaptische sporen uit een gekoppeld opname tussen twee CA3 piramidale neuronen. In reactie op een 20 seconden stroompuls aan presynaptische actiepotentiaal vuren induceren de postsynaptische Ampar gemedieerde stroom (geregistreerd bij -65 mV) in directe reactie op de actiepotentiaal (B) Linker:. De amplitude van Ampar gemedieerde EPSCs varieert niet alleen tussen gepaarde opnames, maar ook van trial-to-proces binnen een gekoppelde opname. Iedere proef is de amplitude van de EPSC gemeten bij 0,1 Hz. In dit voorbeeld Ampar EPSC amplitude varieert van 5 pA tot> 60 pA. Rechts: NMDAR EPSC amplitudes gemeten bij +40 mV in aanwezigheid van 10 uM CNQX. NMDAR EPSC amplitudes zijn meestal aanzienlijk kleiner in amplitude dat Ampar EPSCs, maar vertonen nog steeds grote variabiliteit. NMDAR EPSC amplitude meestal gemiddeld tussen de 10-20 jaar in gepaarde opnames tussen CA3 piramidale cellen, waardoor storingen gemakkelijk herkenbaar (C) Links:. CA3 piramidale cel paren express LTP dat aanhoudt voor de lengte van de gepaarde opname. LTP is direct duidelijk door een toename van de amplitude van Ampar EPSCs. Significante proces naar proces variabiliteit in de Ampar EPSC amplitude blijft na de inductie van LTP. Rechts: Expressie van lange termijn depressie (LTD) tussen CA3 piramidale neuronen. Let op de daling van de gemiddelde amplitude van de Ampar EPSC en gelijktijdige verlaging van het proces voor de rechtbank amplitude variabiliteit. (D) Voorbeeld van postsynaptische polysynaptic remmende stromingen, die zich voordoen bij een langere wachttijd in vergelijking met de monosynaptic Ampar EPSC. Wanneer het postsynaptische neuron spanning geklemd bij -65 mV, de stromen polysynaptic zichtbaar als een tweede piek bij een latentie van> 5 msec na de piek van de presynaptische actiepotentiaal. Houd het postsynaptische neuron bij -30 mV bevestigt dat de polysynaptic stroom remmend te wijten aan de omkering van de stroomrichting.es.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Tabel 1: Mogelijke problemen die zich voordoen in gepaarde opnames en voorbereiding van organotypische slice culturen. Dit geeft vaak mogelijke problemen die zich voordoen met gepaarde whole cell opnames in organotypische slice culturen. Daarnaast adviseren wij ook dat veel tijd moet worden besteed 'besturen' van de elektrofysiologie setup voor gepaarde opnames, zoals de meeste problemen hebben betrekking op beweging storingen die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en verholpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we beschreven de vereisten voor de oprichting van een succesvolle gepaarde whole cell opnames in organotypische hippocampus slice culturen. Gepaarde opnames kunnen ook worden uitgevoerd in verschillende bereidingen, waaronder acute plakjes en gedissocieerde kweeksystemen 26,27. Hoewel de focus hier is op de inductie van langere vormen van synaptische plasticiteit (namelijk LTP en LTD), is het belangrijk dat gepaarde whole cell recordings in organotypische, acute slice markeren en gedissocieerde cellen preparaten hebben belangrijke inzichten verschaft in precise size, short -termijn plasticiteit, presynaptische functie en LTP en LTD 2,4,8,26,27.
Het grote voordeel van het organotypische slice systeem is de toegenomen connectiviteit tussen neuronen. Synaptische connectiviteit in de acute slice preparaat de laag door het verbreken van axonale verbindingen tijdens slice voorbereiding. In onze ervaring, gekoppeld opnamen van synaptically connected CA3 neuronen in acute plakjes waren mogelijk in slechts ~ 5% van gepaarde opnames verkregen. Dat wil zeggen dat 95% van de gepaarde opnames waren los. Een alternatief is het gebruik van primaire hippocampale kweken gedissocieerd waarbij synaptische verbindingen beduidend hoger 26. Echter, met gedissocieerde gekweekte preparaten vragen over neuron identity komen of hun eigenschappen zijn vergelijkbaar met die van rijpe synapsen in natief weefsel. Het gebruik van organotypische hippocampale slice cultures gedeeltelijk verbetert deze bezwaren omdat neuronale subtypes gemakkelijk door kan geïdentificeerd, en de cellen behouden morfologie en connectiviteit die vergelijkbaar natief hersenweefsel 20 zijn. Aangezien segmenten worden gehandhaafd vitro dan een week, is het belangrijk op te merken dat in deze tijd aanzienlijk axonale groei optreedt. De daaruit voortvloeiende toename van de connectiviteit is enorm gunstig voor het uitvoeren van gepaarde opnames die synaptische functie en plasticiteit te onderzoeken, maar het hoortworden dat studies naar netwerkverbinding niet geschikt voor dit preparaat zijn.
Hoewel het merendeel van de gepaarde opnames werden uitgevoerd op CA3-CA3 piramidale celparen kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast aan CA3-CA1 en dentate gyrus-CA3 gepaarde opnames. De incidentie van synaptische verbindingen tussen dentate gyrus en CA3 pyramidale neuronen in dit systeem aanzienlijk lager. Echter monosynaptic prikkelende verbindingen tussen CA3 en CA1 in dit systeem gemeld zo hoog als 76% 28 is.
Daarnaast worden gekoppeld whole cell opnames routinematig uitgevoerd in mouse hippocampale weefsels, waaronder transgene muizen (figuur 2D) 29-31. De techniek kan verder worden verfijnd om synaptische transmissie en plasticiteit tussen neuronen met mozaïek genexpressie 30 op te nemen. GFP etikettering van wild-type neuronen maakt gerichte gepaarde whole cell opnames in neuronen of bekend genotype. Deze experimenten zijn veranderingen die in synaptische connectiviteit tussen individuele neuronen, inclusief hyperconnectiviteit of asymmetrische presynaptische functie 30,31 die kunnen bijdragen aan afwijkend gedrag waargenomen in deze dieren.
Samengevat, gepaarde hele cel opnames verhogen de mogelijkheid om elektrofysiologische synaptische eigenschappen te interpreteren en de subcellulaire mechanismen die neuronen gebruiken om synaptische kracht veranderen bepalen. Met deze techniek kon de voorspellingen van pre-en postsynaptische modellen van synaptische plasticiteit direct te testen. Bovendien hebben de fenotype van stille synapsen en specifieke rol van actieve zone en PSD eiwitten ook beschreven in dit preparaat 6-16. Het is ook mogelijk de ontdekking dat synapsen bestaan in verschillende elektrofysiologische gedefinieerde toestanden, en dat tijdens de synaptische plasticiteit synapsen bewegen tussen deze staten 9,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
