Introduction
Glutamat reseptörlerinin, merkezi sinir sistemi sinapslarda uyarıcı sinirsel iletimin çoğunluğu aracılık eder. Postsinaptik zar omurga başında lokalize iyonotropik glutamat reseptörlerinin iki ana alt tipi, N-metil-D-aspartat (NMDA) ve α-amino-3-hidroksi-5-4-proprionik-metilizoksazol asit (AMPA) reseptörleridir. Membran potansiyelleri istirahat, AMPA reseptörleri sinaptik iletimi sırasında postsinaptik akımının en taşımak. Hipokampta, NMDA reseptör postsinaptik zar içindeki AMPA alıcılarının sayısındaki değişiklikler tetiklenmesinde önemli bir rol oynar: bir "tesadüf detektörü" olarak hareket eden 1 sinaptik gücü 1 değişiklikleri başlatmak için, NMDA reseptör sinaptik mekanizmalar dahildir bir alt hücresel düzeyde öğrenme ve hafıza destekleyecek düşünülmektedir. Presinaptik iletici salıverilmesi paralel olarak sinaptik sonrası nöronu depolorizasyonun yanıt olarak, kalsiyum NMDA vasıtası ile içeri girenreseptör AMPA reseptörü ekleme veya kaldırma 2 başlatmak için. Bu reseptör dinamikleri sinaps plastisite temelini oluşturur: sinaptik kuvvetinde bir azalma uzun süreli depresyon 4 (LTD) ise, sinaptik mukavemetinde bir artış, uzun süreli potansiyasyon 2,3 (LTP) 'dir. NMDA reseptörleri, kendi indüksiyon kontrol edildiği düşünülmektedir sırasında nedenle AMPA reseptörü hareketi, sinaptik plastisite ifadesinden sorumlu olduğu düşünülmektedir.
Sinaptik iletim ve plastisite altında yatan kesin mekanizmaları belirlenmesi ideal sinapsların küçük nüfus, tek sinaps eğitim gerektirir. Bazı sinapslar oldukça nedeniyle sinaptik bağlantıların küçük ve dağınık doğası bu son derece zordur çoğu sinaptik popülasyonlarının bu seviyede, örneğin, 5 Tutulacak kaliks, eğitim için uygundur iken. İki büyük elektrofizyoloji teknikleri tek sinaptik bağlantıları incelemek için geliştirilmiştir: İlk minimal stimülasyon, nereyeBir presinaptik lif kabul edilir E ekstrahücresel uyarılmış. İkinci teknik synaptically bağlı nöronlardan gelen eş zamanlı iki tam hücre kayıtları yapılır kayıtları, eşleştirilmiş. Minimum uyarım önemli bir avantajı, aynı zamanda, bir sinaptik sonrası nöronu kayıt sırasında aksonal yolu içine, hücre dışı bir uyarıcı elektrot yerleştirme içeren gerçekleştirmek için hızlı ve nispeten basit olmasıdır. Bu tekniği kullanarak temel kaygısı, tek bir hücrenin güvenilir uyarılması nadiren yargılamadan sonra deneme garanti edilebilir olmasıdır.
Son on beş yıl içinde biz rutin iki synaptically bağlı piramidal nöronlar 6-17 gelen tüm hücre kayıtları paired var. Bu tekniğin önemli avantajı, yalnızca bir presinaptik sinir tutarlı ve güvenilir şekilde uyarılır olmasıdır. Ayrıca, elektrofizyolojik karakterizasyon değil, aynı zamanda presinaptik nöron 6,18 <farmakolojik işleme izin vermemekte,/ Sup>. Bununla birlikte, nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı olasılığı 19 elde etmek için çift bağlantılı zorlaştırır düşüktür. Organotipik beyin dilim kültürlerinin kullanımı sinaptik bağlantı olarak bu engel, in vitro olarak yeniden tesis ve ayrıca elde edilen bağlantı yapısı doğal beyin dokusunda 20 benzerdir aşılmaktadır. Ayrıca, organotipik kültürler için plastisite mekanizmalar sağlayan, LTP, LTD 7-10,12-15,21 ve eşleştirilmiş-darbe kolaylaştırma (KOF) ve depresyon (PPD) 6,22,23 dahil kısa vadeli sinaptik plastisite ek form ifade nöronların çiftleri olarak incelenebilir. Burada bunu başarılı bir şekilde in vitro sistemde eşleştirilmiş kayıtları elde katılan ayrıntılı yöntemler tarifedilmiştir. Bu bilgiler kolaylıkla akut dilimleri ve diğer beyin bölgeleri de dahil olmak üzere diğer deney sistemlerinde, adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan Etik Beyanı:
Bu yazıda anlatılan protokoller Auckland ve Stanford Üniversitesi Üniversitesi tarafından kurulan hayvan bakım yönergeleri izleyin. P7 sıçan yavrular hızlı dekapitasyon ötenazi edildi. Hipokampal diseksiyon hemen sonra aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir.
1. Organotipik Hipokampal Dilim Kültür
- Hazırlık
- (Beyin diseksiyon için sadece kullanılır) diseksiyonu Orta hazırlayın. 5 ml HEPES tampon çözeltisi, 2 ml 1 M Tris stok çözeltisi (pH 7.2) (0.85% NaCl, her biri 10,000 birim) 200 ml Asgari Temel Ortam, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu birleştirin ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize . Buz-soğuk diseksiyon ortamda hipokampal diseksiyonu yürütmek.
- Diseksiyon orta soğutun. Yaklaşık 1 saat önce sıvı çok soğuk kadar diseksiyon başlamadan dondurucuda diseksiyon ortamı yerleştirin. Büyük buz cr izin vermeyinystals oluşturur. Gerekli kadar buz üzerinde muhafaza edin.
- (Hippocampi diseksiyon dışında her şey için kullanılır) kültür ortamı hazırlayın. / L-glutamin, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu, w Hank tuzları w / 100 ml Asgari Temel Ortam, (1x konsantrasyonu, sıvı) birleştirin (% 0.85 sıvı, her biri 10.000 adet NaCl), 2.5 mi HEPES 1 M tamponu Çözelti, 50 mi Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 50 mi At Serumu (tanımlandığı gibidir, ısı ile inaktive edilmiş), ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize edilir.
- Kültür yemekleri hazırlayın. 35 mm kültür tabağı başına kültür ortamı, 1 ml yerleştirin ve her bir tabağa, bir zar ek eklemek. Bir 150 mm Petri kabı içine bu yemekler yedi kadar koyun (bir 'plaka' olarak anılan). Yemekler, kültür ortamı, uygun sıcaklık ve pH doldurduğu şekilde diseksiyon başlamadan önce en az bir saat boyunca bir CO2 inkübatör plaka koyun.
- Postnatal Gün 7 de Rat Yavrularının gelen Hipokamplardan diseksiyonu (P7)
- İşlemden önce UV ışık altında tüm diseksiyonu araçları Ön sterilize.
- Hızlı başı kesildikten sonra, bir tabak soğutulmuş ortama beyin ve yer kaldırın ve sonra diseksiyon için nemlendirilmiş filtre kağıdı bir parça için onu kaldırın. Hipokampus açığa künt pürüzsüz plastik kaplamalı minyatür spatulası kullanarak uzak orta beyin korteksi kızdırmak. Forniksinin kesin, sonra yavaşça (Şekil 1A) dışarı çevirmek için hipokampus altında spatula çalışır.
NOT: Başarılı dilim kültürleri P10 kadar hayvanları kullanılarak hazırlanabilir. - Uzak beynin geri kalanından izole hipokampus kesin. Nemlendirilmiş yumuşak bir fırça kullanarak soğutulmuş diseksiyonu medya içeren yeni bir tabağa aktarın hippocampi (örneğin, beyaz samur # 4).
- Bu süngerimsi, meninge gibi dokular zor hipokampus ayırmak için yapmak gibi, diseksiyon sırasında koroid pleksus hipokampusun alt (yani düz tarafı) temizleyindaha sonra birbirinden dilimleri.
NOT: nazikçe alay edilemez ise yerde bu dokuları bırakın. - Hippocampi zarar vermeden mümkün olduğunca hızlı tüm diseksiyon.
Not: dikkatli bir diseksiyon sürece deneysel koşullar soğutulmuş olarak, hızlı bir daha önemlidir. Aynı anda üç fareden hipokampları dilim. Kaplama dilimleri inkübatör içine gitmek dilim sağlık için kadar baştan toplam süre olarak etkilenmez 30 dakika altındadır.
- Dilimleme
- Transvers bir biçimde el doku dilicisi kullanılarak 400 um enine bölüme hipokampları dilim. Dilimleme gerçekleştirilen edildiği gibi bir yöntem, ince dokulu kağıdın aşırı zarar vermeyen ve (Ammon Boynuz kolayca dokusunda korunması gerekli görülmektedir) yani, hali hazırda görünür laminer mimarisi ile tutarlı kalınlıkta dilimler üretiyor sürece, önemli değildir.
- Doku sahnede hippocampi Lie# 2 filtre kağıdı üçlü kalınlığı üzerinde kıyıcı. Hipokamplar (daha ziyade bu noktada dilimlenmiş ekmek somunları gibi; Şekil 1B tüm kesimler yapılana kadar tüm hipokampus helikopterde sahnede kalan yani), her tür dilimleri çıkarmadan tamamen dilimlenmiş.
- Her hipokampus yanında koydu yumuşak bir fırça (2 beyaz samur #) kullanarak diseksiyon ortama hippocampi aktarın. Yavaşça hipokampus ve altta uzanan filtre kağıdı arasındaki yapışmayı kırmak için yan her hipokampus itin. Sahneden onu almak için her hipokampus altına fırçayı döndürün. Soğutulmuş diseksiyon ortamının aynı 35 mm Petri kabı içine tüm hipokampları yerleştirin. Elle saat yönünde ve saat yönünün tersine hareketleri alternatif olarak çanak ajite tek tek dilimler halinde hippocampi ayırın.
- Bir mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve açıkça görünür hücre sahip değil, küçük hasarlı veya hangilerinin herhangi atınVücut katmanları.
NOT: Bu genellikle tüm dilimleri başarıyla bu şekilde onların kardeşleri ayrılır değil böyle olacaktır. Bu durumda, kenar çevirerek ve ince forseps uçları ile kışkırtmaktansa ile ayrılabilir. "İyi" dilimler kesilir ve yangın cilalanmış Pasteur pipet (Şekil 1C-E) kullanarak soğutulmuş diseksiyon orta içeren bir başka temiz bir Petri kabı aktarılır.
- Depolama
- Membran filtre ekler üzerine tek tek dilimler yerleştirin. Pasteur pipet kullanarak kesti ve yangın, büyük bir delik vermek ayrı kültürü ekler dilimleri aktarmak için cilalı.
NOT: Kesme ve ateş cilalı pipet önemlidir oluşturulan deliğin büyüklüğü. Çok küçük ve dilimler kolaylıkla membran için pipet bırakmaz. Çok büyük ve fazla sıvı dilim ile birlikte, zarın yüzeyi üzerine yerleştirilir. En iç çapı, tipik olarak yaklaşık yarısı olan çappipet namlunun etre. Kesme esnasında, bu çap pipet incelen uygun yerde kesilerek seçilebilir. - Dilim Transferi
- İlk orta ile pipet doldurun, ve sonra küçük emme güçleri ile tek bir dilim kadar emmek. Bu pipet açılışına yakın dilim tutar ve dilim yerleştirmek için ekleme içine çok fazla orta çıkmaları önlenir.
- Küçük bir asılı damla oluşturulması için ampul hafif bir basınç uygulanır, bu dilim damlacık içine yerleşir ve daha sonra zarın bu damlacık dokunun ve zar üzerine dilim "düşüş" izin verir. Genel olarak üç dilim her zar elemanının üzerine yerleştirilir.
Not: sıvı damlacık çok büyükse, üç dilim gelen damlacıklar, membran yüzeyinde birleştirme eğilimi ve dilimler bu nedenle tüm daha zor, daha sonra elektrofizyolojik kayıt için onları ayırmak için yapım zarın merkezi toplayacaktır.
- Sıvı Removal
- Dilimleri dalmış veya diseksiyon orta bir havuzu ile çevrili değildir, böylece o plaka tüm dilimleri (uç başına 3 dilim = plaka başına 21 dilim) için kültür plaka ucun üstünden herhangi bir aşırı orta aspire.
- Bu bir kesilmemiş ile olan gerçekleştirin, ancak yangın cilalı Pasteur pipet. Dilim yerleşmek ve pipetlemeden önce bir dakika membran uymak için izin verin. Yukarı pipet içine dilim emmek için özen. Dilimleri yerleşmek için yeterli zaman tanımak için, ilk ekilir uçlar için sıvı kaldırma yürütmek.
- Dilim Depolama
- 37 ° C'de% 5.0 CO2 inkübatöründe saklayın dilim kültürleri. Şekil 1 E'deki kültürlerin nihai düzenleme dikkate alınmalıdır. Her bir diliminin bir tabanı için bir gözenekli membran içeren bir kültür plakasında eki üzerine oturmaktadır ve bu uç orta küçük bir miktarı ile doldurulur ve bir Petri kabı içine yerleştirilir; Bu yolla, dilimler bana batmayankireç, sodyum, ancak kültürü plakası, parçanın alt zar içinden erişime sahip.
- İsteğe bağlı olarak, kültür plaka elemanını kaldırarak veya bir dilim içeren insert membran bir bölümünü keserek olabilir çalışma için ya dilimleri çıkartın.
- Membran filtre ekler üzerine tek tek dilimler yerleştirin. Pasteur pipet kullanarak kesti ve yangın, büyük bir delik vermek ayrı kültürü ekler dilimleri aktarmak için cilalı.
- Bakım
- Kültürleri yaptıktan sonra bir gün Petri yemekler orta değiştirin. Transfer edilmeden önce en az bir saat boyunca inkübatör, denkleştirilmektedir taze kültür aracı maddesi 1 ml içeren yeni bir petri etmek için kültür plakası elemanını aktarın.
- Kültür yapıldıktan sonra üçüncü günde aynı şekilde tekrar orta değiştirin. Üçüncü gün, 34 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka kültürleri aktarın. Iki kez, her hafta (her 3-4 gün) orta değiştirin.
- Sağlıklı kültürleri tanımlamak. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları için sağlıklı kültürleri seçin.
Not: Sağlıklı kültürler iyi tanımlanmış bir kenarı açık bir şekilde tanımlanmış ve piramidal hücre tabakası vardır. Kültürler zekâsaat karanlık (olasılıkla nekrotik) alanlar mevcut veya düzleştirilmiş sınırları ile bir vaküollu görünüm reddedilir. Bu kriterlere istihdam, dilim kültürlerin genellikle iki-üçte yeterince kayıt için sağlıklı. - Zaman oldukça küçük bir pencere olan bu kültürleri yararlanın. Nöronlar yavaş yavaş zamanla kötüleşir biraz epilepti davranışı göstermek için başlar beri fazla iki hafta boyunca kültüre değil kullanılan dokularda yapın. Nöronal hayatta kalma kesin üst sınırı bilinmemektedir ancak kültürde piramidal hücreleri gibi geç 16 haftaya kadar çalışmasını kaydetmek mümkündür.
2. Eşli Tüm Hücre Kayıtlar
- ACSF ve Hücre içi Çözümleri
- 120 potasyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 kadar NaATP ve 0.3 NaGTP (;: 290 mOsm ozmolarite, KOH ile pH 7.2) ile (mM olarak) karıştırılması ile presinaptik elektrot çözeltisi hazırlayın. Aynı elektrot çözeltisi ve postsinaptik nöronların, sezyum glukonat için kullanılır iken (120 mM), Başlıca postsinaptik elektrotta tuzu artı 5 mM QX314 olarak kullanılır.
NOT: Bu postsinaptik NMDAR aracılı akımları 8-10,13 kaydetmek için olumlu potansiyelleri stabil voltaj kelepçeleme sağlar. Ayrıca Giga ohm mühür yapılmadan önce postsinaptik bir kayıt elektrotu akan iç çözelti ile presinaptik nöronların potasyum kaynaklı aşın engeller. - (MM olarak) oluşturan postsinaptik elektrot çözeltisi 120 sezyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 kadar NaATP ve (;: 290 mOsm ozmolarite CsOH ile pH değeri 7.2) içinde 0.3 NaGTP hazırlayın. 5-10 M? Direnci cam Mikroelektronlar çekin ve filtre iç çözümü ile doldurun.
- Yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 119 NaCl, 2.4 KCl, (mM olarak) oluşturan hazırlayın MgSO 4 1.3, 2.4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3,% 95 O, 2, 5 ile doyurulmuş 11 glukoz, pH 7.4, % CO 2. NOT: r AMPAR aracılı iseesponses, NMDAR EPSCs incelenmesi için bloke gereken ACSF 10 mcM CNKX veya NBKX içerir.
- 120 potasyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 kadar NaATP ve 0.3 NaGTP (;: 290 mOsm ozmolarite, KOH ile pH 7.2) ile (mM olarak) karıştırılması ile presinaptik elektrot çözeltisi hazırlayın. Aynı elektrot çözeltisi ve postsinaptik nöronların, sezyum glukonat için kullanılır iken (120 mM), Başlıca postsinaptik elektrotta tuzu artı 5 mM QX314 olarak kullanılır.
- Eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar elde
- İki ayrı nöronlar arasındaki sinaptik iletimi incelemek için, presinaptik nöron olarak bir nöron tayin ve aksiyon potansiyelleri teşvik ve sinaptik iletimi başlatmak için geçerli kelepçe tutun.
- Postsinaptik nöron olarak, ikinci nöronu tayin ve araştırmacı tarafından gerekli bilgilere göre akım veya gerilim kelepçe tutun. Gerilim kelepçeye postsinaptik nöron tutarak mV 6-16 30 muayene -65 mV muayene AMPAR-aracılı EPSCs ve NMDAR-aracılı EPSCs ile Glutamaterjik akımları, ayrıntılı muayene edinin
- Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturun. Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturmak için, presinaptik bütün hücre kayıt daima çok sayıda arka arkaya ve postsinaptik nöronların sağlayan, ilk elde edilen bağlandığını sinaptik bir ürünle elde edilene kadar edilmesid elde edilir. Sinaptik plastisite deneyler, bu LTP 8,19 için gereken sitoplazmik faktörleri ile yıkama önlemek için bütün hücre kayıtları elde 10 dakika içinde başlatılmalıdır postsinaptik nöron LTP indüksiyonu ilk olarak presinaptik nöron elde edilmesi için özellikle kritiktir.
- Hareket ile tetiklenen hücre kaybını önlemek. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları gerçekleştirerek büyük bir meydan okuma titreşim ve ikinci kayıt elde ederken ilk tam hücre kayıt hareketi kaynaklı bozulmasını önler edilir.
- İlk tüm hücre kayıt elde ve kurulan kayıt monitör (Şekil 2A) görünen alanının kenarında yer alır, böylece daha sonra x-ekseninde mikroskop objektif 10-200 mikron taşıyın.
- ACSF hala lens ile temas muhafaza sağlarken ~ 5-10 mm mikroskop merceği kaldırın. İkinci elektrot takın ve (sıvı menisküste içine Şekil 2B kılavuz
- Bu lensten ışık yolu altında olduğunu, ancak hala önemli kurulan kayıt elektrot yukarıda kadar xy düzleminde elektrot hareket ettirin. Elektrot mikroskop altında görünür olduğunda, uzak ucu birinci elektroddan monitörün uzak kenarında olduğundan emin olun.
- Her iki elektrot, aynı odak düzleminde kadar odaklı mikroskop dizisinde ikinci elektrot aşağı doğru hareket ettirin. Bu ilk bütün hücre kayıt bozacak şekilde pozitif basınç düzeyi çok güçlü uç tıkanmayı önlemek için yeterince sağlam, ancak olması önemlidir. Bu, ilk olarak dilim girdiğinde elektrottan 2-3 nöronlarda hareket indükleyici pozitif basınç çevirir.
- İlk presinaptik kaydı (Şekil 2C) benzer bir odak düzleminde bir postsinaptik ortağı bulun. Kayıt genellikle ilk r bir 0-200 mm nöron CA3 piramidal nöronların ikinci tüm hücre arasındaki kayıtları eşleştirilen Obtain edilirayıt (Şekil 2C, d).
NOT: nöronal çiftleri arasındaki Sinaptik iletim kadar 3-4 saatlik süreler boyunca stabil olan bu standart tüm hücre kayıt tekniklerini kullanırken.
- Sinaptik plastisite: Bir kez başarılı synaptically bağlı piramidal hücre çifti elde edilmesi üzerine (Şekil 3A, B), sinaptik iletim ve plastisite özelliklerini incelemek.
- LTP indüksiyon.
- 1 dakika boyunca 0 mV (Şekil 3C) 7-9,12-14 -10 için postsinaptik depolarizasyon ile presinaptik aksiyon potansiyelleri (1 Hz) eşleştirme tarafından LTP neden. Break-postsinaptik nörona 10 dakika içinde eşleştirme başlatın.
Not: LTP da postsinaptik aksiyon potansiyeli ile, 1 dakika için 1 Hz presinaptik ve postsinaptik aksiyon potansiyelleri eşleyerek mevcut kelepçede tutulmuştur, her iki nöron ile indüklenebilir presinaptik nöron 8 içine enjekte edildikten sonra akım 10 msn ortaya çıkardı
- 1 dakika boyunca 0 mV (Şekil 3C) 7-9,12-14 -10 için postsinaptik depolarizasyon ile presinaptik aksiyon potansiyelleri (1 Hz) eşleştirme tarafından LTP neden. Break-postsinaptik nörona 10 dakika içinde eşleştirme başlatın.
- Bundan başka 5-10 dakika (Şekil 3C), 9 -55 mV'ye sinaptik sonrası nöronu hafif bir şekilde depolarize ile birlikte 1 Hz düşük frekansta (LFS) ile LTD neden olur.
- LTP indüksiyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sinaptik bağlantı kayıt elektrot aracılığıyla bir depolarizan akım darbesi (20 msn için genellikle 20-50 pA) ileterek bir aksiyon potansiyeli presinaptik nörona uyararak açıktır. Postsinaptik akımı iz bu presinaptik hareket potansiyelini (Şekil 3A) ve pikten sonra kısa (<5 ms) ve tutarlı bir tepki vermişlerdir gecikmeleri olan monosinaptik bir batık EPSC varlığı açısından incelenir. Bir synaptically bağlı çifti elde edilebilir önce en deneylerde birden postsinaptik nöronlar test edilir. Genel olarak, presinaptik CA3 hücrelerinin ~ 1/3 monosynaptically aktif sinaptik bağlantıların (Şekil 3A) ile postsinaptik CA3 hücreye bağlanır, ve CA3 nöron yaklaşık olarak% 20, tüm sessiz sinaptik bağlantıların 6,8 ile bağlanır.
Bazal AMPA reseptörü aracılı akımların genliği bağımsız pai arasında da bir eşleştirilmiş kayıt içinde deneme yargılanma değişkendir veKırmızı kayıtları (Şekil 3B) 6,8. Ortalama AMPAR EPSC genlik 800 pA <10 pA> ranged, ve büyük olasılıkla eşleştirilmiş kayıtlar arasındaki fonksiyonel sinapsların sayısındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Başarısızlık oranları da aktif sinapsların 6,7 ile bağlı çift% 0-95 başarısızlık oranları, sessiz sinaps% 100 AMPAR EPSC başarısızlık oranları arasında değişen, eşleştirilmiş kayıtlar 6,7 arasında anlamlı farklılık gözlenmiştir. Bireysel eşleştirilmiş kayıtları içinde, sinaptik sorunlar, özellikle küçük AMPAR EPSC genlikleri ile kayıtları, meydana gelmiştir. Diğer sinaps 6 gerçekleşir, AMPAR EPSC genlik değişkenlik, deneme nedeniyle deneme yargılanma salınan quantal sayısında dalgalanma (Şekil 3B) muhtemel ham veri yargılanma açıktır.
Çift tüm hücre kayıtları da farmakolojik manipulat sağlayan öncesi ve postsinaptik nöronal sitoplazma hem de doğrudan erişim sağlayankayıt elektrotları 6 yoluyla ya / presinaptik ve postsinaptik hücreler hem iyon. Tipik olarak, presinaptik farmakolojik manipülasyonlar (10 dakika içinde) çok hızlı vardır. Bu gibi floresan etiketli dekstranlar kayıt elektrottan ≤200 um uzak terminalleri presinaptik erişebilir, küçük moleküller (örneğin, BAPTA) ile sınırlı değildir. Bu nedenle kalamar dev sinaps 25 gerçekleştirilen benzer analiz hipokampal dilim sinaptik vezikül salım makine çalışmalarına uzatılabilir. Eşleştirilmiş kayıtlarında ölçülen özgül sinaps konumu kayıt işlemi tespit edilmez. Bu nedenle sinapsların uzak bölgelere karşı proksimal dışı uyarıcı elektrotlar veya fokal glutamat uygulama ile yerel uyarılması gibi kolaylıkla tespit edilemez. Ancak, eşleştirilmiş kayıt sırasında her bir nöronun boya dolum aksonal milleri ve potansiyel sinaptik morfolojik yeniden etkinleştirebilirsiniz LTP ve LTD güvenilir bu kültür sistemi (Şekil 3C) olarak CA3-CA3 sinaps bağlı ve (saat üzerinde 2) bütün hücre kayıtları süresince plastisite hem formları son edilir. Kullanılan LTP ve LTD indüksiyon paradigmalar akut dilimleri ve LTP ve LTD sergi NMDAR-bağımlılık, çağrışımsal ve yol bağımsızlık ve kültür sisteminin bu nedenle bu kombinasyonun özelliklerini yapılan aynıdır ve eşleştirilmiş kayıtları Synaptic'i incelemek için değerli bir model sistemi sağlar plastisite 7. Polisinaptik inhibitör olayları sıklıkla CA3 piramidal hücre çiftleri (Şekil 3D) arasında eşleştirilmiş kayıtlarında görülmektedir. Bu son derece yıkıcı hiperaktivite üretir Biz farmakolojik bu GABA'erjik engellenmesini bloke yok. Bununla birlikte, bu polisinaptik önleyici etkinlikleri daha uzun gecikme nedeniyle, genellikle monosinaptik excitato ölçülmesini engellemezry akımı. Polisinaptik inhibitör olaylar monosinaptik akımının zirveye örtücü, monosinaptik akım ile müdahale gözlenmiştir, bu çiftleri analiz dışında gerekir. Polisinaptik uyarıcı bağlantıları da bazen gözlenebilir, ancak önemli ölçüde daha az yaygındır ve ayrıca analize dahil edilmiştir edilmektedir. Nadiren, bir monosinaptik inhibitör sinaptik akım presinaptik nöron engelleyici bir interneuron olması nedeniyle elde edilir. Bu hali hazırda daha uzun (1 saniye) akımı içine enjeksiyonuna tepki olarak hareket potansiyeli ateşleme konaklama eksikliği ile tanımlanır. Bu çözelti, iç sezyum glukonat esaslı olduğu ve postsinaptik nöronların mümkün değildir. Nöronlar kayıt önce görsel belirlenmiştir Ancak, deneyimlerimiz bu <zamanın% 1'inde görülür. Organotipik hipokampal dilimler içinde internöron kolayca özellikle stratum radiatumunun ve Oriens olarak, onların olmayan-piramidal hücre vücut tarafından görsel tanımlanır. Bu nedenle, bu prAyırma da interneuron eksitatör ve inhibitör akımları kayıt sağlar. Ancak, çok az organotipik dilimler halinde inhibitör ağları hakkında bilinen ve onlar beyinde benzer bağlantısına sahip olup olmadığı açık değildir. 
Organotipik hipokampal dilim kültürlerin Şekil 1. hazırlanması. (A), noktalı çizgi ile belirtilen in situ hipokampus,,. Hipokampus kaldırmak için, forniksin için bağlantıları kopmuş ve hipokampus yavaşça beyin dışarı haddelenmiş. (B) Hippokampuslar filtre kağıdı üstüne dilicisinin sahnede konumlandırılmış. (C) hipokampal dilimler geniş yoluyla aktarılır hasar görmesini önlemek için bir Pasteur pipet delik. 'iyi' karşı 'kötü' dilimleri (D) örnekler.(E) Karikatür zarlarında dilim Kur. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2. hipokampal CA3 nöronların tüm hücre kayıtları eşleştirilen elde etmek. Optimum elektrot ve nöronal konumlandırma gösteren bir eşleştirilmiş kayıt ulaşma Sıralı görüntüleri. (A) mikroskop kayıt ilk tam hücre alındıktan sonra x- 10-200 mm taşınır eksen böylece kurulan kayıt (ok) monitörde görünen alanın kenarında yer almaktadır. Ölçek çizgisi:. 25 um (B) ikinci elektrotu için oda etkinleştirmek için, mikroskobun objektif sonra hala ACSF ile temas halinde bulunduğu sağlanması, ~ 5-10 mm yükseltilirobjektif. Lens aracılığı ile ışık yolu altında olduğunu ama yine de önemli ölçüde kurulan kayıt elektrotu üzerinde kadar diğer kayıt elektrot çarpmak etmez ikinci bir elektrot elde etmek için, ikinci elektrot, x-ekseninde hareket eder. (C) kurulan kayıt gösteren eşleştirilmiş aynı odak düzlemi hem elektrotlar (oklar). Ölçek çizgisi:. RHS üzerinde EGFP-pozitif nöronların gösteren bir transgenik hayvanda bitişik CA3 nöronlannda, 25 um (D) Eşleştirilmiş kaydı. Ölçek çubuğu:. 20 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
CA3-CA3 piramidal hücre çiftleri arasında Şekil 3. Sinaptik iletim ve plastisite. (A) p örneğiİki CA3 piramidal nöronlar arasındaki eşleştirilmiş kayıttan yeniden ve postsinaptik izleri. 20 saniye akım titreşimine karşılık olarak presinaptik aksiyon potansiyeli ateşlemesini uyarılması için, postsinaptik AMPAR aracılı akımı (-65 mV kaydedilmiş) hareket potansiyeli doğrudan yanıt olarak oluşan (B) Sol:. AMPAR aracılı EPSCs genliği değişir sadece eşleştirilmiş kayıtlar arasında değil, aynı zamanda deneme-to-deneme eşleştirilmiş kayıt içinden. Her bir deneme 0.1 Hz ölçülen EPSC genliğini temsil etmektedir. Bu örnekte, AMPAR EPSC genlik> 60 pA 5 pA dalgalanır. Sağ: NMDAR EPSC genlikleri, 10 uM CNQX mevcudiyetinde 40 mV olarak ölçülür. NMDAR EPSC amplitüdleri tipik olarak AMPAR EPSCs, fakat yine de önemli değişkenlik göstermektedir ki amplitüdünün önemli oranda daha küçüktür. CA3 piramidal hücreler arasında eşleştirilmiş kayıtları 10-20 pA arasında genellikle ortalamalar NMDAR EPSC genlik, hataları kolayca tanımlanabilir hale (C) Sol:. CA3 piramidal hücre çiftleri Eşleştirilmiş kayıt uzunluğu için devam LTP ifade eder. LTP AMPAR EPSCs amplitüdünde bir artış ile hali hazırda belirgindir. AMPAR EPSC genlik önemli deneme-to-deneme değişkenlik LTP indüksiyonu sonra kalır. Sağ: CA3 piramidal nöronlar arasındaki uzun dönemli depresyon (LTD) ifadesi. AMPAR EPSC ortalama genliği genlik ve yargılama değişkenliğe denemede birlikte azalma duşuşe dikkat edilmelidir. Monosinaptik AMPAR EPSC göre daha uzun bir gecikme meydana postsinaptik akımlar polisinaptik önleyici, (D) Örnek. Sinaptik sonrası nöronu -65 mV'de kenetlendi gerilim olduğunda, akımları polisinaptik presinaptik aksiyon potansiyelinin pikten sonra> 5 msn bir gecikme ikinci bir tepe noktası olarak görebilir. -30 MV postsinaptik nöronu tutan polisinaptik akımı nedeniyle akım yönünün tersine engelleyici olduğunu doğrular.es.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Tablo eşleştirilmiş kayıtları ve organotipik dilim kültürlerin hazırlanmasında doğan 1. Potansiyel sorunları. Bu Organotipik dilim kültürlerde eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları ile ortaya ortak potansiyel problemleri listeler. Buna ek olarak, biz de çoğu sorun kolayca görsel ve düzeltilmesi olabilir hareket aksaklıklarla ilgili olarak önemli zaman, eşleştirilmiş kayıtları için elektrofizyoloji setup 'çakma' harcanması gerektiğini öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada Organotipik hipokampal dilim kültürlerde başarılı eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları kurulması için gereksinimleri tarif etmişlerdir. Eşli kayıtlar da akut dilimleri ve ayrışmış kültür sistemleri 26,27 dahil olmak üzere birden hazırlıkları, yapılabilir. Odak burada sinaptik plastisite (yani LTP ve LTD) uzun formları indüksiyon olmuştur ederken, kısa bu organotipik, akut dilim o eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları vurgulamak önemlidir ve hücre preparatları quantal boyutu önemli bilgiler sağladı disosiye Vadeli esneklik, presinaptik işlevi, hem de LTP ve 2,4,8,26,27 LTD.
Organotipik dilim sistemin büyük avantajı nöronlar arasındaki artan bağlantı olduğunu. Akut dilim hazırlık sinaptik bağlantı nedeniyle dilim hazırlanması sırasında aksonal bağlantıları koparılan için düşüktür. Bizim tecrübelerimize göre, sinaptik connecte kayıtları eşleştirilmişakut dilimleri d CA3 nöronların elde eşleştirilmiş kayıtların sadece ~% 5 mümkündü. Bu eşleştirilmiş kayıtların% 95'i bağlantısız, ediliyor. Alternatif bir sinaptik bağlantı 26 tanesi önemli ölçüde daha yüksek olduğu birincil hippokampal kültürler çözülmüş kullanmaktır. Ancak, ayrışmış kültürlü hazırlıkları ile nöron kimliğe ilişkin soruları gelmek ve onların özellikleri doğal doku olgun sinaps benzer olup olmadığını. Nöronal alt tipleri tarafından kolayca tespit çünkü Organotipik hipokampal dilim kültürlerinin kullanımı kısmen de olsa endişeleri iyileştiren ve hücreler, yerli beyin dokusu 20 benzer bir morfolojiye ve bağlantı sağlamak. Dilimler, bir hafta boyunca in vitro korunup korunmadığı Ancak, bu önemli aksonal rejenerasyon bu süre içinde meydana dikkat etmek önemlidir. Bağlanılırlıkta çıkan artış, ancak gerektiği, sinaptik fonksiyon ve plastisite incelemek eşleştirilmiş kayıtları performans büyük ölçüde faydalıdırağ bağlantısı inceleyen çalışmalar bu hazırlanması için uygun olmayabilir kaydedilmelidir.
Bizim eşleştirilmiş kayıtların çoğunluğu CA3-CA3 hücre çiftleri olarak gerçekleştirildi iken, bu teknik, kayıt eşleştirilmiş CA3-CA1 ve CA3 dişli beyin kıvrımı-adapte edilebilir. Bu sistemde dentat girus ve CA3 piramidal nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı sıklığı oldukça düşüktür. Ancak, bu sistemde CA3 ve CA1 arasındaki monosinaptik uyarıcı bağlantıları% 76 28 gibi yüksek olduğu bildirilmiştir.
Buna ek olarak, çift bütün hücre kayıtları rutin transgenik fareler (Şekil 2D) 29-31 de dahil olmak üzere, fare hipokampal doku içinde gerçekleştirilir. Tekniği daha mozaik gen ifadesi 30 ile nöronlar arasındaki sinaptik iletim ve plastisite kaydetmek için rafine edilebilir. Yabani tip sinir GFP etiketleme O nöronlarda tüm hücre kayıtları eşleştirilmiş hedeflenen sağlarf genotipi da bilinir. Bu deneyler, bu hayvanlarda gözlenen davranış açıklarına katkıda bulunabilir Hyperconnectivity veya asimetrik presinaptik fonksiyonu 30,31 dahil bireysel nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı değişikliklere belirledik.
Özetle, eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları elektrofizyolojik sinaptik özelliklerini yorumlamak ve nöronlar sinaptik gücü değiştirmek için istihdam hücrealtı mekanizmaların belirlenmesi yeteneğini artırır. Bu tekniği kullanarak sinaptik plastisite öncesi ve postsinaptik modellerin tahminleri doğrudan test edilmesi için izin verdi. Buna ek olarak, sessiz sinaps ve aktif-bölgesi ve PSD proteinlerinin spesifik rollerinin fenotipi bu terkipte 6-16 de tarif edilmiştir. Ayrıca sinapsların farklı elektrofizyolojik tanımlı devletlerde mevcut keşif etkin ve olan sinaptik plastisite sinapslar bu devletlerin 9,17 arasında hareket sırasında söyledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1 M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| Plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| Soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| Manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 Filter paper | Faraday cage | ||
| #5 Forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
