Abstract
C. elegansの表皮とキューティクルが負傷に起因する局所的な損傷を修復することができますシンプルで洗練されたスキン層を形成する。このモデルにおける創傷応答および修復の研究は、細胞骨格および組織損傷に対するゲノム応答の我々の理解を照らしている。 C.を創傷に、2つの最も一般的に使用される方法虫の大人の皮膚マイクロインジェクション針、および現地レーザー照射との呵責である。針創傷は、局所的にキューティクル、表皮、および関連する細胞外マトリックスを破壊し、また内部組織を損傷することがあります。より局所的な損傷でレーザー照射をもたらす。創傷は、上昇した表皮のCa 2+（秒分）、創傷部位（1〜2時間）でのアクチン含有環の形成及び閉鎖、抗菌ペプチド遺伝子の上昇転写（2-24含め容易にアッセイした応答の連続をトリガーする時間）、および瘢痕形成。基本的にすべての野生型の大人の動物は、どこに創傷を生き残る創傷修復または他の応答における欠損変異株として生存率の低下を示している。詳細な針とレーザー創傷のためのプロトコル、および定量および創傷応答と修復プロセス（カルシウム動態、アクチン動態、抗菌ペプチドの誘導、および生存）の可視化のためのアッセイが提示されている。
Introduction
皮膚創傷治癒のメカニズムは基本的な生物学的興味のものであり、人間の健康に関連する。脊椎動物および哺乳動物における創傷治癒は、複数の組織および1シグナルの協調的応答の複雑な系列を含む。多くの単純な遺伝的モデル生物はまた、皮膚創傷2治癒することができる。これは、皮膚創傷修復の遺伝的に扱いやすいモデルを分析することが重要である。我々と他の人は肌のための新しいモデルは3,4創傷治癒などの線虫（Caenorhabditis elegans）を使用し始めている。このプロトコルの目的は、Cを使用する研究者のより広範なセットを可能にすること表皮の創傷治癒の分子·細胞メカニズムを調べるためのツールとして虫 。
C.虫の皮膚は（また皮下組織として知られている）、表皮および細胞外のキューティクル5を備えている。大人の表皮は最大でシンシチウムkがあるの多核合胞体の数が少ないから形成されているnownとしてhyp7。表皮は、その頂端表面にキューティクルを分泌する簡単な上皮である。皮膚は積極的に皮膚浸透性の病原体から身を守る、小さな傷4を修復することができます。 C.の創傷修復エレガンススキンはすべて、野生型動物は針、又はレーザ照射による局所的な皮膚損傷による小さな刺し傷に耐えることができる生き残るほぼ、ロバストである。C. elegansの皮膚創傷は、表皮自然免疫応答、創傷閉鎖、および瘢痕形成4を含む応答のスイートを、トリガされます。大人の表皮は有糸分裂後で、創傷治癒、上皮増殖または細胞移動とは対照的に、局所的な細胞応答を含む。我々は、皮膚の創傷が膜TRPMチャネルGTL-2と内部のCa 2+を格納3を必要とする、表皮のCa 2+が大きく、持続的な増加を誘発することが示されている。表皮のCa 2+シグナルは、少なくともF-アクチンリングの形成及び閉鎖WOために必要とされるウントサイト。創傷はまた、NLP-29のようなAMPの転写を活性化する自然免疫応答を誘導する。 AMPの創傷誘導性転写は、表皮4に自律的に動作するTIR-1 / PMK-1 p38 MAPキナーゼカスケードに依存している。どちらのCa 2+シグナル伝達経路におけるまたは先天性免疫応答の欠陥は低い生存創傷後につながる。 C.の比較的単純な構造elegansの表皮、in vivoイメージングのためにその遺伝従順および利点は、創傷修復の複数の側面を研究するためにそれを優れたシステムを作る。
針創傷およびレーザー創傷：ここでは、創傷の2つの一般的な方法のためのプロトコルを提示する。ニードル創傷は（針プラー以外）何の特殊な装置を必要とせず、経験で一日あたりのワームの何百もの上で実行することができます。針創傷寒天プレート上で生育した動物に対して行われる。対照的に、レーザー創傷はanes上で実行されるthetized動物はカバーガラスの下のパッド寒天上に搭載されており、損傷に対する細胞応答のライブイメージングに適しています。
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Protocol
次のプロトコルは、Cの詳細な手順を説明します皮膚が負傷および創傷応答をアッセイするための虫 。
1.ニードル創傷は3,4
- E.と標準NGM（線虫の増殖培地）プレート上の健康unstarvedワームを育てる20℃のインキュベーター中で維持食品として大腸菌 OP50細菌。
注：NGM寒天プレートとCのルーチン栽培のための方法エレガンス www.wormbook.org 6で見つけることができます。 - 20℃CO / Nで負傷し、培養の前に新鮮に播種プレート1日に25 L4ステージワームをピック。
- 負傷する前に、針プラーを使用して、毛細血管から針を引っ張る。創傷に使用する針は、Cのマイクロインジェクションのために使用されるものと同じです虫 。
- すべてのワームは若い成人の段階であることを確認します。約30分間氷上でワームのプレートを置きます。冷却は、針の創傷を促進する、動物が低迷されます。
- 解剖実体顕微鏡に氷から寒天プレートを取り外します。ワームのピックを使用して、寒天プレートの中央に25ワームを動かす。
- より簡単に針を保持するために、100μlのピペットチップに針を置きます。生殖腺を避け、針でワームの本体の前方または後方の部分を穿刺。一般的に、後部咽頭と前方生殖腺の間、または後の生殖腺と直腸の間で巻かしようとします。再使用の針を何度も、それらが破壊されるまで。
注：傷が動物に〜5-10ミクロンを貫通し、キューティクルや皮膚を穿刺簡単な、穏やかな呵責であることを確認してください。針はアニメーションを入力してください皮膚へらほぼ直角。傷は内臓に明らかな損傷、または身体の即時破裂が発生することはありません。傷の後に数秒間滲出細胞質の少量を観察。しかし、細胞内容が長時間にわたって漏れる場合、動物が生存しないであろう。最適な画像化のために、横方向の表皮シンシチウム（hyp7）または横方向の継ぎ目を巻か。
注：この手順は、ガラス針の使用を含む。 - ワームは20℃で、次に室温で文化を回復できるようにします。以下に記載のアッセイの数によって針創傷の成功を判断する。野生型動物の95％より多くは、針が若年成人段階で創傷後24時間を生き残る。幼虫や高齢者に負傷の影響がまだ広範囲に分析されていない。
2.レーザー創傷は3
より正確な創傷を実行するためにフェムト秒レーザー照射（800 nm）を使用してください。
- 寒天Pを準備溶融した2％寒天7とガラススライド上に広告。パッドはCのライブイメージングのために使用される寒天パッドに似ていることを確認虫 。
- ワームのピックを持つアガロースパッドの上に10若い成虫を転送し、12 mMのレバミゾール液の2μlのドロップを追加。カバースリップで動物や液体をカバーしています。ワームは麻痺させるために1〜2分待ちます。
- スピニングディスク共焦点顕微鏡上にスライドガラスを置きます。ワームを見つけると100Xの目的とした横方向の前方または後方胞体表皮（NA 1.4から1.46）に焦点を当て、ステージを移動します。
- （対物前に測定）140 mWまでフェムト秒レーザーのパワーを設定します。 80 MHzのの繰り返し率でフェムト秒レーザーを使用してください。
注：（20ミリ秒で区切られた）200ミリ秒ずつの2つのパルスは、私たちの手の中に負傷のために十分である。 - 表皮細胞の頂端面に焦点を当て、表皮を巻か。細胞質（バブリング）の局部的破壊、またはローカル漂白Oを守って使用する任意の蛍光マーカーF。
注：フェムト秒レーザーを使用するときに、適切なレーザー安全手順に従ってください。このような二光子顕微鏡のものとフェムト秒レーザーを使用して線または点走査は、レーザー創傷のための十分な電力を提供すべきである。
注：私たちは他のレーザーを使用しての直接の経験を持っていないが、原則として創傷に（C. elegansの細胞アブレーションに使用されるような）従来のUVレーザーを使用して可能にする必要があります。必要に応じて、表皮（N.プジョル、私信）を巻きつけ、ディスク共焦点を回転さに（FRAP）モジュールを光退色後の蛍光回復を使用しています。
創傷形成表皮のCa 2+応答の3可視化
- トランスジェニックC.を使用してください大人の表皮特異的プロモーターCOL-19（ 図1Aの制御の下で、表皮に（そのようなGCaMPシリーズのものなど）のCa 2+センサーを表現する線虫株は、導入遺伝子がにリストされています
- 表皮にトリガーのCa 2+の上昇が負傷針とレーザーの両方。針創傷容易スピニングディスク共焦点上で実行することができないようしかし、レーザー創傷は、Ca 2+応答（ 図1）の定量分析のために好適である。
- 100Xの目的とした回転ディスク共焦点（NA 1.4から1.46）と適切なフィルターセットを使用して多次元取得モード（インターバル時間114ミリ秒励起レーザー露光と2秒）でのタイムラプス画像を取得（GFPフィルタがGCaMP3のために動作します）。
注：CA 2+ RESPを調べるために約2時間毎に30秒タイムラプス画像を取得より長い時間経過にわたって負傷にオンセ。 - 画像解析ソフトウェアを使用して、表皮細胞の細胞質ゾルおよびバックグラウンドの5つを中心とするそのうちの5つの近隣の10同等の領域（ROI）、平均GCaMP蛍光を測定する。
- 傷害の前に、バックグラウンドで5 ROIの平均を引いた後、表皮における5のROIの蛍光を平均化することにより、ベースライン蛍光（F 0）を取得します。ベースラインに対する変化の比率として蛍光ΔFの変化を表現する[（F tは -F 0）/ F 0]。
創傷後F-アクチンダイナミクスの4可視化
- 注：針創傷に応じて、徐々に傷の周りに閉じ創傷部位でのアクチンリングを観察します。このプロトコルセクションアッセイはアクチンリングの直径を測定することにより、創傷閉鎖。
- このように融合されたショウジョウバエモエシンアクチン結合ドメインとしてのF-アクチンのマーカーを発現するトランスジェニックワームを生成しますGFPは、（導入遺伝子juIs352）のcol-19（ 図2A）のような表皮特異的プロモーターの制御下で発現される。
注：私たちは、そのようなLifeactまたはF-tractin（未発表の結果）などの他のアクチン結合ドメインマーカーを使用して同様の結果を得た。 - P COL-19- GFP-モエシンジェニックワームに負傷針を実行します。針創傷後、約5分までに、創傷部位の周りにGFP-モエシンのリングを観察する。アクチンリングは直径が小さくなり、最終的には野生型動物（ 図2A）で負傷2-3時間後を閉じます。
- スライドガラス上の2％寒天パッドを準備し、2μlの12 mMのレバミゾール溶液にパッドの上に10のワームを転送する。画像GFP-モエシンリング従来の共焦点顕微鏡を用いて創傷後1時間。
注：使用し、共焦点顕微鏡1時間創傷後アクチンリングのzスタック（13×0.5μm）を取得する。 - 創傷後アクチンリング径を測定します。表皮Gを定量するために、FP-モエシン、最初のzスタックの最大強度投影を行ってから、4ラインスキャンを描くGFP-モエシンリング上（互いに45°）。リングの直径は、4つのライン走査（ 図2B）のピーク距離平均ピークとして定義される。すでに閉じられているリングのために、直径が0以下のように定義されている。
注：これは、野生型創傷閉鎖過程を経て約半分の方法であるように、F-アクチンリングが便利に負傷1時間後に測定している。 Fアクチン環はまた、創傷閉鎖の経時変化を導出するために、複数の時点で測定することができる。創傷閉鎖のタイムラプスムービーは、レバミゾールを固定化したワームを使用して、ディスク共焦点顕微鏡を回転さを取得することができる。
表皮抗菌ペプチドの5アッセイの誘導
注：創傷はまた、Cの自然免疫応答をトリガー虫の皮。抗菌性ペプチド（AMPS）をコードする遺伝子の転写は、INDです表皮にuced。 NLP-29（神経ペプチド様タンパク質）AMPが強く4を創傷により誘導される。表皮は、創傷後のAMPの発現を制御する方法の個々のAMPの転写レベルを検出するために、トランスジェニックレポーターまたはリアルタイムPCRを使用して、アッセイする。
- 4が負傷に対する自然免疫応答のためのトランスジェニックレポーターアッセイ。
- 内部コントロールとしてのP NLP-29- GFP とP COL-12-のDsRedが含まれているトランスジェニックレポーターfrIs7を発現する成体動物に（プロトコル1のように）針創傷を実行します。 GFPロングパスフィルタのような濃い赤やオレンジ無傷成体動物を観察します。
注：野生型のワームが負傷すると、PのNLP-29 -GFP発現を誘導しますが、オレンジ、黄色、またはGFPロングパス照明下で緑色にワームで、その結果、PのCOL-12 -dsRedには影響しません。そのようなPMK-1またはNSY-1な どのp38 MAPK経路における遺伝子の機能の喪失は、NLP-29 -GFPをブロックします4を創傷後誘導。 PのNLP-29- GFPは、幼虫の段階で高いレベルで発現される - 若い成人の動物でAMP誘導アッセイを行う。無傷対照動物は、GFPのレベルが低いことを確認してください。
注：P NLP-29- GFP発現は、浸透圧ストレス8によって誘導され、他の環境ストレスに敏感である。 - 創傷後6時間、GFPロングパスフィルタでスコープを解剖蛍光を用いて、P NLP-29 -GFP誘導（ 図3）9 を持つワームの数をスコア。
注：1時間後創傷のP NLP-29- GFPが目に見えて、ピークから約6時間後に創傷に到達し、誘導された後、24時間後の創傷にまで上昇したままで。視覚的なスコアリング4,9によって発現を定量。あるいは、蛍光活性化セルソーターワーム4を用いて、発現レベルを定量化する。ワームソーターの場合は、少なくとも50の動物が負傷する必要がある。 - 資格でのためのリアルタイムPCRアッセイ個々のAMP遺伝子の転写レベルをntitating。アッセイ転写物のいくつかの遺伝子のためのレベル：NLP-29、NLP-30、CNCの-1、およびCNCの-5。
- 野生型または変異型ワームに負傷針を実行します（プロトコル1を参照）
- 希望の時間に50負傷したワームや50無傷ワーム（ 例えば、3、6、24時間）後の創傷を収集します。
- 製造業者の指示に従って市販のキットを用いてRNAを抽出します。
- 商業逆転写酵素キットを用いて全20μlのcDNAを取得するために逆転写を行います。
- RT-PCRのために、フルオレセインおよび0.2μMのプライマーと緑のスーパーミックスとの組み合わせで各サンプルから0.2μLのcDNA（1/40）を使用します。 RNAの品質を比較するために、参照としてAMA-1またはSNB-1 RT-PCRを使用します。内部統制（AMA-1またはSNB-1）に正規化することにより、AMPの相対発現レベルを比較し、またはノルムで（負傷したワーム/非創傷ワームでAMP誘導）誘導倍率創傷後を比較内部統制にalizing。
注：CNC-1とCNC-5は、その転写が10を負傷によって活性化され、家族の抗菌ペプチドをcaenacinされている。典型的には、針創傷は、4時間10の時間経過にわたる式（CNCの-1〜500倍）を誘導する。発表された研究に用いたプライマーを表2に示す。
創傷後6.アッセイサバイバル
- 注：のCa 2+依存性の創傷修復経路および自然免疫応答経路：創傷は、表皮中に少なくとも2個の独立したシグナル伝達経路を活性化する。両方の経路は、無菌創傷の完全な生存のために必要とされる。変異体またはRNAi治療が創傷治癒に影響するかどうかをテストするには、24〜48時間後に創傷の生存率を測定する。必要に応じて、長寿4,9上負傷の影響を決定するために、従来の寿命アッセイを使用しています。
- （若年成人（L4 + 24時間）のワームで50ワームを負傷させた針を実行し、リピートセベ上記のプロトコル1以下RAL回）。コントロールとして非創傷ワームの同等の数を維持する。
- 生存ごとに24時間を確認してください（新しい寒天プレートに24時間毎に負傷したワームを転送する）。そのようなGTL-2またはTIR-1、正規化された無傷対照動物にとして創傷修復における欠陥がある変異体において創傷後50％の生存〜24時間を守ってください。死は、ワームのピックによってタッチする運動応答の欠如として定義されている。
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Representative Results
そのようなGCaMPsとしてCAセンサ（ 図1）を用いて可視化などのレーザーやニードル創傷は、表皮のCaレベルが急速かつ持続的上昇をトリガーします。 Caの上昇は数秒以内に発生し、数十分のために上昇したままです。針創傷を再現創傷部位（ 図2）におけるF-アクチンリングの形成をもたらす。これらは、数分以内に表示され、創傷後1〜2時間かけて徐々に近い。アクチンリングは少なく、多くの場合、より精密なレーザー創傷後に形成されている。針とレーザーの両方が転写レポーター（ 図3）を用いて検出などNLP-29のような表皮の抗菌ペプチド（AMPの）の発現を誘導負傷。 AMPの誘導は、創傷後2-4時間以内に明らかであり、約24時間持続します。野生型のニードル創傷が大幅に（創傷後24時間で測定）生存能力や寿命に影響を与えるべきではない。
図1.レーザー創傷はC.におけるCa 2+応答を誘発虫の表皮。 （A）表皮GCaMP3蛍光（P COL-19 -GCaMP3（juIs319））フェムト秒レーザー創傷後のレベル。前 - 体内での表皮の側面図。 xは、レーザー創傷。 N、表皮核。スピニングディスク共焦点画像、強度コード。 UW：無傷、W：。負傷者（B）20時GCaMP3ΔF/ F 0の定量、40、および創傷部位から60ミクロン。代表トレース。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.ニードル創傷は、創傷部位周辺のアクチン重合をトリガします。 （A） COL-19- GFP-モエシン（juIs352）で可視化創縁、でアクチンリングの形成を誘発する。スケール：10μmである。 UW：無傷、W：ラインスキャンからアクチンリング径の負傷（B）の定量、動物あたり4ラインスキャン（パネルの点線の赤い線（A）、WT）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.表皮創傷が自然免疫応答を活性化する。代表的な画像針創傷後のP NLP-29 -GFP（frIs7）誘導の（WT解い、WTは、+ 3時間を負傷した）。スケール：200μmである。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
| リポーター | 導入遺伝子 | 蛍光 | アレル |
| カルシウム | PCOL-19-GCaMP3。PCOL-19-tdTomato | GFP / tdTomato | juIs319 X |
| アクチン | PCOL-19-GFP ::モエシン | GFP | juIs352 I |
| NLP-29 | 型Pnlp-29-GFP / PCOL-12-のDsRed | GFP / DsRedを | frIs7 IV |
創傷応答アッセイにおいて使用表1.トランスジーン 。この表は、 線虫遺伝学センター（http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc）で入手可能な染色体に組み込まれた導入遺伝子を示しています。
| 遺伝子名 | シーケンス |
| NLP-29 | F：cttctcgcctgcttcatggc |
| R：gtccgtatccaccatatcctcc | |
| NLP-30 | F：TTCTTCTCGCCTGCTTCATGG |
| R：CATAACCTCTACCATATCCACCG | |
| CNC-1 | F：gccattgtcgccatttcctc |
| R：cctccatacattggatatcctc | |
| CNC-5 | F：CTTCTTCTAGCAATGCTCGCTC |
| R：GTATCCTCCACCATACCCTCC | |
| AMA-1 | F：ACTCAGATGACACTCAACAC |
| R：GAATACAGTCAACGACGGAG | |
| SNB-1 | F：tccagcagacacaagctcagg |
| R：gagacaacttctgatcacgctc |
AMP転写物のRT-PCRのために使用される表2のプライマー 。濃度の作業は、0.2μmである。SNB-1は内部コントロールとして機能します。
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Discussion
針、レーザー創傷のためにここに提示される方法は、損傷を修復する表皮上皮の能力を評価するための補完的なアプローチを提供する。針創傷は表皮、キューティクル、そしておそらく内部基底膜を破壊に対し、レーザー創傷は、表皮に限定することができ、比較的ローカライズと（レーザーの構成に応じて）である。針創傷は、より正確に病原体または自然環境での機械的な損傷によって与え傷に似ていることがあります。原則として、針創傷は、動物の生存と互換性のある正確な傷を達成するためにもっと練習が必要です。針とレーザー創傷ディスプレイは多くの類似点に対する細胞応答。しかし、アクチンリングの形成は再現性フェムト秒レーザー創傷後に観察されないことに留意すべきである。
また、針の貢献ワームへのダメージ内部組織：針穿刺の制限は、正確な傷がないことである生存率は調べられていない。このプロトコルの可能な変更は、より正確な物理的な創傷を実行するためにマイクロ流体ベースのマイクロインジェクションシステム11と蛍光レポーターを結合することであろう。
ここで詳述針とレーザー負傷方法は、それが困難な創傷応答の特性評価にゲノムまたは生化学的アプローチを使用すること、シンプルでありながらかなり労働集約的、そして最高の状態で中·スループットである。そのような真菌または原生動物などの病原体12,13を貫通キューティクルは、動物のより大きな集団に送達することができる、および創傷に対する応答と重複応答を誘発、まだ病原体特異的応答の付加的な複雑さを導入することができる。さらなる研究は、弾道衝撃14またはマイクロメカニカルピアシング構造15のアレイのような他の非生物的方法は、大規模な創傷に適合させることができるかどうかを調査するために必要とされる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph |
References
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