Summary
세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.
Abstract
이주 할 수있는 능력은 다양한 세포 유형의 특징이며 배아 발생, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함한 여러 생리 과정에서 중요한 역할을한다. 그러나, 세포 이동은 또한 확산 전이성을 시작하는 일차 종양으로부터 분리하는이 암세포를 활성화 암에서 중요한 메커니즘이다. 과거 내의 다양한 세포 이동 분석법은 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석하기 위해 개발되어왔다. 세포 locomotory 문제가 현저하게 이차원 (2D) 사이의 차이 및 3 차원 (3D) 환경 그것은 3D 환경 내에 포함 된 세포의 이동의 분석은 더 중요한 세포 이동을 수율 것이라고 가정 할 수 있으므로 데이터. 기재된 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석의 장점은 세포 외 매트릭스의 주요 구성 요소를 나타내는 콜라겐 섬유의 생리적 3D 네트워크 내에 내장된다는 점이다. 으로 인해시간 경과 비디오 현미경 리얼 셀 마이그레이션 프로 이동성 인자 또는 저해제에 응답하여 여러 이주 파라미터뿐만 아니라 변형의 결정을 허용 측정된다. 다양한 세포 유형의 세포 및 종양 세포를 림프구 / 백혈구를 포함한,이 기술을 이용하여 줄기를 분석 할 수있다. 마찬가지로, 또한, 셀의 클러스터 또는 타원체가 콜라겐으로 격자 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다. 우리는 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 생리와 같은 3D 환경에서 세포의 이동을 분석 할 수있는 다양한 방법이라고 결론 지었다.
Introduction
세포 융합 (개요는 1, 2 참조) 세포의 이동이 배아 발달, 상처 치유 및 면역 반응 (검토를 위해 3 참조)을 포함하여 생리 학적 과정의 과다에 참여하는 다른 생물학적 현상처럼. 그러나, 마이그레이션 할 수있는 기능은 종양 세포가 (검토를 위해 3,4 참조) 전이하기위한 전제 조건이기도하다.
세포 이동은, 복잡하고 다양한 리간드 (예, 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 세포 외 매트릭스 성분) 수용체 (예를 들면, 수용체 티로신 키나제에 의해 개시 여러 신호 전달 경로의 작용에 의해 지시된다 아직 완전히 이해 과정 궁극적 있도록 지연 및 초점 접착 단지의 재 조립과 함께 액틴 세포 골격의 수반의 재구성을 일으키는 케모카인 수용체, 인테그린)의 상호 작용 5 6 신호 인테그린은 매개.
시험 관내 여러 생체 세포 이동 분석에서 세포의 이동을 분석하는 분석 실험 8-10, 입체감을 (치유 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 7, 내찰 분석 / 상처를 포함한 과거 수십 년 동안 개발되어왔다 3D) 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석 (11)뿐만 아니라의 intravital 영상 / 현미경 (검토를 위해 12 참조). 이러한 세포 이동 분석 각각의 장점과 단점, 예를 들어, 관련된 비용 및 장비의 필요성, 취급 또는 획득 한 데이터의 신뢰성을 가지고 있습니다.
보이든 챔버 / 트랜스 웰의 분석 및 스크래치 분석 / 상처 치유 분석 모두 체외 7-10에서 세포의 이동을 측정하기 쉽고, 저렴한 비용과 잘 발달 된 분석이다. 소위 상부 구획 7 - 보이든 챔버에서 / 트랜스 웰 분석 세포를 삽입 함유 기공 (약 8 μm의 직경)의 상단에 씨앗을 품고있다. 선택, 삽입은 세포 외 m로 코팅 될 수있다ATRIX 성분, 예를 들면, 피브로넥틴, 콜라겐 등이 더 생리적 환경을 모방한다. 마찬가지로, 내피 세포함으로써 내피 세포 장벽 (13)을 흉내 낸, 삽입물의 상단에 성장 될 수있다. 이러한 성장 인자 및 케모카인과 같은 미디어 보충제, 은닉 하부 구획으로 정의 된 시간 간격 동안 기공 통과 한 이들 세포는, 세포 이동 (또는 혈관 외 유출)을 정량화 판독로서 사용된다.
스크래치 분석에 / 상처 치유 분석 세포를 플레이트에 접종하고 배양이 10로 성장하고 있습니다. 실험 설정 판의 의존도에서 피브로넥틴 등의 세포 외 기질 구성 요소와 사전에 코팅 될 수있다. 스크래치의 각 측면에서 세포 단층 단일 세포를 긁어 상처 스크래치 / 생성 한 후 / 상처 이에 의해 10 치유 / 충전 격차로 마이그레이션 할 수 있습니다. 스크래치 / 상처의 양면 사이의 거리가 결정된다시간 의존성과 셀 (10)의 활동에 대한 이동성 판독로서 사용된다. 그러나, 시간이 경과 비디오 현미경 및 단일 셀 (10)를 추적과 분석을 결합하는 것이 좋습니다 및 세포 이동 (또한 스크래치 / 상처의 충전 / 치유 될 수있는) 세포의 증식을 구별합니다.
그러나, 보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석 및 분석 치유 스크래치 분석 / 상처 모두, 생리 같은 셀룰러 환경에 관하여 다소 불완전하다. 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 세포 어 세이에 스크래치 세포를 치유 분석 / 상처 이차원 프레 코트 플라스틱 접시에 시딩 반면, 플라스틱 기공을 통해 이전한다. 마찬가지로, 잘 이동성 동작은 2 차원 환경에서 3D (3) 사이에 현저하게 다르다는 것을 인식한다. 예를 들어, 섬유 아세포의 입체 매트릭스 유착이 특징에 초점 및 섬유 성 유착 다를αvβ3 인테그린 α5β1과, paxillin, 다른 세포 골격 성분, 국소 유착 키나제 (14)의 티로신 인산화의 콘텐츠 - 차원에서의 기판. 마찬가지로, 3 차원 환경 내에 포함 된 세포는 또한 변경된 이동성 동작 (15)을 표시. 따라서보다 정확하게 세포의 이동을 분석하기 위해 마이그레이션 분석은 3D 생리 학적 또는 생리 학적 같은 환경 내에서 단일 세포의 이동을 측정 할 수 있도록 권장한다.
의 intravital 영상 / 현미경 3D 생리 학적 맥락에서 세포의 이동을 측정하기위한 황금 표준입니다. 이것은 지금까지 인해 가능하다, 그러나 또한 림프절 17 내의 혈관 외 유출 16 또는 림프구 거래 동안 종양 세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포 유형 간의 상호 작용, 세포 외 기질 세포의 상호 작용에 속하지 않는 예컨대 2 광자 같은 향상된 형광 현미경 기법공 초점 레이저 주사 현미경, 형광 단백질을 발현 유도체 12,16,17 중요한 형광 염료 및 형질 전환 마우스의 변종의 사용. 또한,의 intravital 영상 / 현미경은 수동 및 자동 셀 (18) 추적과 결합 될 수있다. 그러나, 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경의 필요성뿐만 아니라 동물 (적절한 형질 전환 동물 모델)의 촬상의 intravital / 현미경 오히려 비용 집약적 기술이다.
보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석 및 내찰 분석 / 상처 치유 분석의 한계를 극복하고 3D 콜라겐 매트릭스 이주 분석법 11,19 개발 된 3 차원 환경 내에서 다른 세포 유형의 마이그레이션을 분석하기. 이에 따라, 이주 세포 3D 콜라겐 섬유 네트워크, 생체에 더 비슷해이 상황에 포함된다. 공동으로, 시간 경과 비디오 현미경 실제 세포의 이동에 의한는 determi 수 있도록 측정여러 마이그레이션 매개 변수뿐만 아니라 프로 철새 요인 또는 억제제에 대한 응답에서의 변화의 나라. 다양한 세포 유형의 림프구 및 백혈구 11,20, 조혈 모 / 21-24 전구 세포 및 종양 세포를 포함 5,25-29이 기술을 사용하여 분석 할 수있다. 단셀 외에도 클러스터 셀 또는 타원체는 30,31 격자 콜라겐으로 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다.
생체 내 상황에 가까운 결과에 항복 시험 관내 방법 -이 프로토콜은 3 차원 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석 할 수있는 간단하지만 강력한 방법에 대한 개요를 제시한다.
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Protocol
마이그레이션 챔버의 1 준비
- 혼합물까지 혼합하고 열이 녹아 : 파라핀 왁스 / 석유 젤리 (1 일)을 준비합니다. 페인트 브러시를 사용하고 파라핀 왁스 / 바셀린의 2-3 층 그릴 (1 : 1)도 1B-1D에 따라 유리 슬라이드의 중간에 섞는다.
참고 : 우리는 일반적으로 유리 슬라이드를 사용하는 (76 X 26 X 1.0 ~ 1.5 mm (W / D / H)) - 그리는 동안 응고를 방지하기 위해 유리 슬라이드에 급속히 용융 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스를 적용. 파라핀 왁스 / 바셀린 층은 길이가 약 2-2.5 cm, 폭 0.3 ~ 0.5 cm이다 확인. 파라핀 왁스 / 바셀린 층의 두께는 약 0.1-0.15 cm이어야한다.
- 응고 된 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스에 커버 슬립을 추가하고 2-3 층 왁스 / 석유 젤리 믹스를 파라핀 (그림 1E, 1F)로 밀봉. 일반적인 세포의 이동 실험에 4-8 마이그레이션 챔버를 사용합니다. 장소 마이그레이션 챔버 전랙 위쪽 위치에 n.
콜라겐 서스펜션 셀 믹스의 2 준비
- 수확 (예, 0.25 % 트립신 / EDTA)와 관심의 세포를 계산합니다. 완전한 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 미디어, 항생제의 세포를 재현 탁하고 보충제를 추천했다. 4-8 1.5 ml의 반응 관 4-6 × 104 세포 (세포의 총 수가 분석 될 세포 유형에 따라)를 함유하는 20 ㎕의 세포 현탁액을 준비하고 완전한 미디어 50 μL까지 채운다.
NOTE : 추가의 화합물 (예, 성장 인자, 케모카인, 억제제 등)를 세포 현탁액에 첨가된다. 세포 현탁액의 최종 부피가 50 μl를 초과하지 않도록 적절한 스톡 용액을 사용한다. - 네 세포 이동의 실험을 위해 452 ㎕의 최종 콜라겐 현탁액의 총량을 준비합니다. 50 ㎕의 10 배 MEM (pH가 5.1-5.5) 및 7.5 % 탄산 수소 나트륨 용액 27 μL (pH가 9.0-9.5 추가) 1.5 ml의 반응 관과 완전히 혼합한다. 강렬한 보라색 (pH가 9.0-9.5)에 노란색 - 오렌지에서 솔루션 컬러 턴을 준수하십시오. 10 배 MEM / 탄산 수소 나트륨 용액에 375 ㎕의 액체 콜라겐 현탁액을 첨가하고 잘 섞는다. 최종 콜라겐 현탁액의 pH가 약 7.5이어야한다 (자주색 색상으로 표시).
주 : 7.5 % 중탄산 나트륨 용액의 pH를 확인한다. pH가 약 7.5 장소 인큐베이터에서 오픈 뚜껑 중탄산 나트륨 용액 인 경우 (37 ° C, 5 % CO 2) CO 2로 포화 및 산도 (약 9.0-9.5)으로 증가한다. 콜라겐 현탁 세포 믹스의 pH는 콜라겐 네트워크의 안정성을 위해 중요하다. 너무 낮 으면 콜라겐 격자는 세포 이동 실험 동안에 붕괴한다.
참고 :이 프로토콜의 경우, 소 뒷다리에서 액체 콜라겐 (pH가 1.9-2.2)를 사용 (2.9-3.3 ㎎ / ㎖ 콜라겐을, 95 % 콜라겐 타입 I, 5 %의 콜라겐 유형 IV). 추가하여 콜라겐 격자 제제 프로토콜의 예로이러한 돼지 나 쥐와 같은 다른 소스로부터 콜라겐 유형 I은 (32, 33)에 제시되어있다. 이 1.67 밀리그램 / 격자의 ML의 궁극적 인 콜라겐 농도를 변경하므로 사용 된 솔루션의 볼륨을 변경하지 마십시오. 더 높거나 낮은 콜라겐 농도 콜라겐 섬유의 밀도 및 세포 이동성 동작 34 병용 그들 사이의 평균 거리에 영향을 미친다. - 50 ㎕의 세포 현탁액의 최종 콜라겐 현탁액 100 μl를 추가하고 thoroughly.The 최종 콜라겐 서스펜션 (1.67 ㎎ / ㎖ 콜라겐)을 혼합하면 약간 점성이다. 정확한 양 (100 μL)를 전송하려면, 세포 현탁액에 전송하기 전에 한번 상하 최종 콜라겐 용액을 피펫.
NOTE : 콜라겐 현탁 세포 믹스 pH 값을 7.5로 변경했다 배 MEM / 중탄산 나트륨 용액과 결합되면 콜라겐 섬유가 바로 중합 시작. - 일의 최종 콜라겐 서스펜션 세포 믹스로 이동마이그레이션 챔버에 전자 반응 튜브. 부드럽게 동일하게 마이그레이션 챔버 (그림 1H)의 하단에있는 콜라겐 서스펜션 세포 믹스를 배포 마이그레이션 실을 누릅니다. 랙에 수직으로 마이그레이션 챔버를 놓고 30 분 동안 품어 (37 ° C, 5 % CO 2) 콜라겐 섬유의 중합을 허용합니다.
- 중합 된 콜라겐 격자 약간 혼탁하지만 여전히 밝은 자주색 색상되고 있음을 알 수 있습니다. 관심 보충제 완전 배지 또는 전체 매체와 마이그레이션 챔버를 입력하고 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스 (그림 1I, 1J)와 마이그레이션 챔버를 밀봉하십시오.
3 녹화 및 세포 이동의 분석
이 섹션에서는 수동 셀 추적하여 시간 경과 비디오 현미경과 세포 이동의 분석에 의해 세포 이동의 기록에 대해 설명합니다.
- 현미경 및 현미경 스테이지 난방에 전환터. 37 ° C까지 온도를 조정합니다. 10X 목표를 사용합니다. 현미경 이주 챔버를 배치하고 시야에 약 50 개 이상의 세포를 집중한다.
- 멀티 카메라 비디오 감시 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 저속 모드에서 기록 세포 이동. 예를 들어, 적절한 형식으로 세포의 이동 영화를 저장, "* .AVI"또는 "*의 .MOV". 이러한 세포 유형과 실험 조건으로서, 지원 정보가 데이터베이스에 포함 된 세포 이동 무비 파일을 링크.
참고 : 우리는 시간 경과에 0.75 초 실시간으로 1 분 같다는 것을 의미 1:80의 시간 경과 계수를 사용하여 최대 2 시간 동안 림프구와 HSPCs를 기록하고 있습니다. 종양 세포는 느리게 이동하는 세포이며, 따라서 하나의 시간 경과 계수를 이용하여, 적어도 16 시간 동안 기록된다 : 1,800 (시간 경과에 0.5 초 실시간으로 15 분 동일하다). - ImageJ에 소프트웨어 플러그인과 같은 적절한 세포 추적 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 세포의 이동 영화를 분석(개요 18에 제시되어있다). 편견 분석을 위해이 세포가 활성화 여부 철새인지 세포가 무작위로 지식없이 선택 될 것입니다 매우 중요하다.
참고 : 수동 (핵에 위치한다) 마우스 커서 정확하게 세포 이동에 따라 실험 당 적어도 30 세포의 경로를 추적하는 자체 개발하는 소프트웨어 애플리케이션을 사용하고있다. 추적하는 동안, 추적 셀 XY 좌표가 자동 중고 저속 모드에 따라 결정된다. 종양 세포에 대한 XY 좌표가 (15 분 실시간 같음) 각 0.5 초를 결정하는 반면 림프구 / HSPCs의 XY 좌표는, (1 분 실시간 같음) 각각 825 초 결정된다. - 일반적인 세포의 이동 실험을 위해 세포 당 60 XY 좌표의 총을 결정합니다. 이는 종양 세포 림프구 / HSPCs 15 시간 실시간으로 1 시간 실시간으로 동일하다. A "는"셀 TW 사이에서 이동되지 않았 음을 나타냅니다오 시점, "수치"반면 "픽셀"셀이이 시점 (그림 2A) 사이에 이동 한의 거리를 나타냅니다.
참고 : 수동 셀 추적 경험이 필요합니다. 특히 빠른 마이그레이션 세포 추적하기 어렵고 각 세포 유형 전시 보충 요인에 의해 유발 될 수있는 별개의 이동성 동작. 추적하는 동안 세포 분열 가지 경우에서 무작위로 추적을 계속하는 한 딸 셀을 선택합니다. 시력 필드에서 마이그레이션하거나 추적을 소홀히하지 않는 상태에서 사망하지만, 분석을 위해 고려 세포.
(4) 데이터 분석
- 예를 들어, 적절한 소프트웨어 어플리케이션, 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 세포의 추적 데이터를 분석한다.
- 자기 설계 스프레드 템플릿으로 원시 데이터 (도 2a)을 트래킹 셀을 복사하여 셀 트래킹 데이터를 분석한다. 대표, "수치"의 합을 곱총 거리는 셀은 "μM"로 "픽셀"을 변환하는 보정 계수 이주로했다.
- 이 세포 이동의 매개 변수를 결정하고 활동적인 운동 (그림 2C, 2D)의 시간 (이동 속도에 해당) locomotory 활동.
- 비 세포와 같은 이동 (거짓 양성 세포의 수를 줄이기 위해 임계 레벨)보다 낮은 25 μm의 마이그레이션 한 셀을 식별한다. ","이러한 세포의 "수치"를 교체합니다.
참고 : 매개 변수 "locomotory 활동"(또는 이동 속도가)이 시점 (그림 2D) 사이에서 이동 한 추적 세포 인구의 세포의 비율을 나타냅니다. A "의 수치는" ","반면, 이동 셀로서 정의되어 움직이지 않는 세포로 정의된다. 파라미터 "활성 이동 시간"(활성화 시간)은 셀 재에 마이그레이션 총 시간의 비율을 나타내고관찰 기간 (도 2c)의 시간 프레임에 만큼은. "수치" ","세포가 이동되지 않았 음을 나타냅니다 반면 셀, 이동 한 것을 나타냅니다. 이 매개 변수는 더 이상 이동하지 않은 세포의 수를 결정하기 위해 사용된다.
- 통계적 유의성 및 디스플레이 세포의 이동 데이터를 계산합니다.
- 맨 - 휘트니 U 시험을 사용하여 세포 (이동 속도)의 평균 locomotory 활성의 유의 한 차이를 계산한다. P-값 <상당한 0.05를 생각해 보자.
- XY-다이어그램, 상자 그림 다이어그램, 또는 막대 차트 다이어그램만큼 셀들의 평균 locomotory 활성을 보여준다. 막대 차트 다이어그램으로 또는 히스토그램과 같은 활성 이동이나 속도의 시간과 같은 단일 셀 기반의 데이터를, 표시합니다.
참고 : 선택한 스프레드 시트 소프트웨어 응용 프로그램이 상자 그림 차트 또는 히스토그램 차트 도구가 포함되지 않은 경우 온라인 검색은 적합 TU를 찾고 수행해야torials.
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Representative Results
시간 경과 비디오 - 현미경 및 컴퓨터 보조 셀 추적과 함께 사용되는 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 모두 인구 기반 파라미터 (예 locomotory 활성을 의미한다)을 포함하는 다양한 세포 이동 파라미터 및 단일 셀 기반 파라미터들의 결정을 허용 (예를 들어, 활성 이동, 속도, 거리의 시간은 마이그레이션). 얻어진 세포 트래킹 데이터 세트, 데이터 처리 및 데이터 프리젠 테이션의 예가도 2에 나타내었다. 데이터 파일을 트래킹 셀이 테이블 (도 2A)를 닮았다. 세포 이동 실험 당 30 세포를 추적함으로써 각 열은 하나의 추적 셀을 의미합니다. 행은 셀이 이동 여부를이 시점 사이의 여부 정보가 포함되어 있습니다. "화소"의 셀 거리를 나타내는 "수치"의 합이 시간 지점 사이 이동 한,이 세포가 이주했다 전체 거리이다. 이는 AC 곱하여"μm의"로 "픽셀"을 변환하는 orrection 요인. 보다 적은 25 μm의 이주 세포 거짓 양성 세포의 수를 줄이기 위해 비 - 이동 세포로 정의된다. 각 셀의 속도 (μM / 분)은 "관찰 기간의 합계 시간 (분)"에 의해 "마이그레이션 총 거리"를 나누어 계산된다.
이 파라미터는 일반적으로 사용되는 셀의 locomotory 동작을 특성화한다. 활성 이동 (도 2c)의 시간이 세포 관찰 기간내 이주 총 시간을 나타내는 반면 Locomotory 활동 (도 2d)는, 분석 된 세포 집단의 평균 locomotory 활성 (또는 이동 속도)를 나타낸다. 후자의 파라미터는 상기 이동하지 않은 세포의 수를 결정하기 위해 사용된다. 이 분석을위한 세포 이동 파라미터를 사용하는 이유는 세포의 활성이 locomotory differe 의해 트리거 될 수 있다는 사실에 기인NT 메커니즘. 예를 들면, 성장 인자, 세포 이동을 "유도"방법을 세 가지 가능성이있다 : a) 더 많은 세포가 이주하는 제어 비교는, b) 제어에 비해 세포 이동의 개수가 변경되지 않았지만 성장 인자 치료 이들 세포는 세포가 장기간 동안 이주 것을 의미 운동 활성의 증가 된 시간을 나타내고, 및 c) a)와 b)의 조합.
그림 2B의 그림은 개략적으로 활성화 운동의 locomotory 활동 및 시간을 계산하는 방법을 보여줍니다. 이 예에서 (4 개의 독립적 인 실험과 동일) 120 세포의 철새 활동이 표시됩니다. 각 다이아몬드 셀이 적어도 두 시점 사이에서 이동되었음을 나타낸다 (상관없이 셀 마이그레이션있다 거리!). 회색 선은 세포 분석 인구 이동과 비 이동 셀들로 구성 것을 보여 본 도면에가 하였다. 매개 변수 "locomotory 활동은 "각 시점 (그림 2D)의 의존도 분석 세포 인구의 locomotory 활동을 나타냅니다. 예를 들어, t = 5 시간에서 10 %의 활성은 locomotory t = 4.45 시간 및 t = 5 시간 사이에서 분석 된 세포의 10 %가 이동 한 것을 나타낸다. XY-다이어그램으로 표시하면 매개 변수 locomotory 활동 분석 세포 인구의 역 동성을 나타냅니다. 세포 집단의 활성을 locomotory 표시하는 또 다른 가능성은 상자 그림 다이어그램 (도 2F)이다.
"0"의 활성 시간은 셀 (도 2C) 이동하고 있지 않는 것을 나타내고있다 파라미터 "활성 이동 시간"(시간 능동) 셀이 관찰 기간 동안 이동 한 총 시간, 상관된다. 세포의 활성 시간은 히스토그램으로 표시 될 수있다.
EGFR / HER2 / PLC-γ1과 HER2 / HER3 / PI3K 신호의 상호 작용은에 기여EGFR / HER2 / HER3 양성 유방암 세포 25의 철새 표현형. PI3K 시그널링함으로써 수용체 티로신 키나제 (35)에 의해 활성화 될 원형질막에이 효소를 모집하고, PLC-1의 앵커 분자로서 작용 포스파티딜 - 3,4,5-trisphosphate (PIP3)의 생성을 위해 필요하다. 단독 EGFR 양성 MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) 유방암 세포의 자극 지속 IP3 및 정현파 칼슘 진동 27을 제조 DAG 수준 장기 PLC-γ1 티로신 인산화 수반되었습니다. 대조적으로, EGFR / HER2 양성 MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) 유방암 세포가 나타내는 인한 단기 PLC-γ1 티로신 활성화 및 단기 IP3 및 DAG 회전율 27 EGF 처리 후에 기준 과도 칼슘 진동을 표시 그 HER2 발현 차이 PLC-γ1 반응 속도 및 신호에 상관 관계가 있었다.
MDA-HER2 및 MDA-N의 이동성 동작 분석EO 유방암 세포주 모두 세포주 유사한 자발 locomotory 활성을 발휘하는 것이 밝혀 (MDA-HER2 : 23.0-28.9 %, 중앙값 : MDA-NEO 대 26.7 % : 19.3-24.4 %, 중앙값 : 21.5 %]도 3A-3D ). MDA-NEO 유방암 세포와 비교하여 (능동 매개 시간은, 관측 기간과 관련하여 단일 세포의 활성 이동 시간을 나타내는, 자발적 이동 MDA-HER2 세포의 약간 높은 숫자 (도 3E 64 %) 계시 53 %; 그림 3 층). 100 NG와 자극 / ㎖ EGF 모두 세포주 상당히 증가 locomotory 활동 결과. EGF의 이동성 활성은 MDA-HER2가 30.4로 상승 처리 - 35.2 %; 이동 세포의 증가 된 수 (/ ㎖ EGF ng를 100 모두에 기인 하였다 (중앙값 33.7 %도 3A, 3C) : 제어 대 81 %를 : 64 %)과 운동 활성 증가 시간. 예를 들어, MDA-HER2 세포의 양이 40 %의 활성 시간을 나타내는 것이였다28 % (100 NG / ml의 EGF)에 20 % (제어)에서 증가했다. (,도 3B, 3D 중앙값 30.4 %), EGF 유사 자극시 데이터는 이동성 활동 25.2-35.2으로 증가시켰다 MDA-NEO 유방암 세포에 대해 수득 하였다. 공동으로, 더 MDA-NEO 세포는 EGF 자극에 대한 응답으로 마이그레이션 (100 NG / ml의 EGF : 66 제어 대 : 53 %) 및 이동 시간 활성 패턴 (그림 3 층) 표시. 예를 들어, 60 %의 활성 시간을 갖는 세포의 양이 현저하게 MDA-NEO 미처리 세포 (13 %)에 비해 EGF의 존재하에 30 %로 증가 하였다.
MDA-HER2 및 PLC-γ1 억제제 U73122와 MDA-NEO 유방암 세포의 치료는 세포 (도 3A-D)의 자발 및 EGF 모두 유도 이주의 억제 결과. 그러나, MDA-NEO 유방암 세포에 비해 MDA-HER2 세포의 자발적인 이주에 U73122의 억제 효과가 오히려 보통 이었지만, 그럼에도 불구중요한 (제어 : 23.0-28.9 %, 평균 : 26.7 % 대 2 μM U73122 : 17.8-21.5 %, 평균 : 20.0 %; 그림 3C). 활성 파라미터 시간 분석 U73122의 존재하에 비 세포 이동의 약간 증가 된 양을 계시 (36 % 대 2 μM U73122 : 48 % 컨트롤,도 3e). 30.4-35.2 %, 중앙값 33.7 % 대 100 NG / ㎖ EGF + 2 μM U73122 : 19.3-24.1 %, 중앙값 22.6 유사 U73122 처리 / ㎖ EGF를 겨 MDA-HER2 유방암 세포의 EGF에 의한 이주 (100 슈팅 % 그림 3C). 따르면 전적으로 U73122이 억제 효과가 오히려 비 이동 세포의 증가 된 양에 기인 한 MDA-HER2 세포를 치료가 아닌 변경된 시간 액티브 패턴 (도 3c)한다. 사실, 활성 운동의 증가 시간으로 약간의 변화는 MDA-HER2 세포 EGF와 U73122 (그림 3C)와 함께 치료를 받고 마이그레이션에서 검출되었다.
반면, 2 μM의 U73122와 MDA-NEO 세포의 치료는 현저 10.7 % (평균 : 9.3 %; 그림 3 층)에 5.6 locomotory 활동을 감소 결과 주로 움직이지 않는 세포 (대조군의 양이 증가에 기인한다 : 47 % 대 2 μM의 U73122 : 79 %; 그림 3 층). / ㎖ EGF ng를 비 이동 세포의 증가 된 양 (100 기인 하였다 : 마찬가지로, MDA-NEO 유방암 세포의 EGF 유도 마이그레이션 현저 7.4 % (4.8 %, 중앙값)에 1.1 U73122에 의해 차단 된 34 % 대 100ng / ㎖ EGF + μM U73122 2 : 70 %)뿐만 아니라 활성 감소 시간 패턴 (도 3f)에 관한 것이다.
세포 이동 챔버의 준비의 도식 개요를 그림. (AE) 세포의 이동 챔버는 용융 paraffi의 2-3 층을 그려 준비N 왁스 / 석유 젤리 유리 슬라이드 상에 혼합한다. (F, G)를 커버 슬립을 첨가하고, 녹은 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스로 밀봉된다. (H) 이주 챔버 콜라겐 세포를 첨가 하였다 직립 위치에 넣어 서스펜션. 그 후, 마이그레이션 챔버는 콜라겐 세포 현탁액은 중합 할 수 있도록 인큐베이터에 배치됩니다. (나는, J) 마이그레이션 실 미디어로 가득하고, 넷째 측에 녹은 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스로 밀봉된다. 그 후, 마이그레이션 챔버 현미경으로 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포 이동 데이터 분석의 개요도 2 도표. (A) 셀 트래킹 데이터 파일. 목60 시간 지점을 분석함으로써 30 세포의 전자 철새 활동은 실험마다 결정된다. "은" "수치가"세포 이동을 나타내는 반면, 셀이 두 점 사이에서 이동하고 있지 않는 것을 나타낸다. (B)이 도표는 (A)에 제시된 데이터의 개략도이다. 각각의 다이아몬드가 두 시점 사이에 이동 한 것을 나타냅니다; 선이 더 이상 움직임을 나타냅니다. 회색 선은 세포 집단이 세포가 비 - 이동 및 세포 (이는, 그러나, 일시 정지하게) 이동으로 구성되어 있음을 시각화 하였다. (C) 시간은 활성 이동 (시간 활성)은 셀이 갖는 전체 시간의 백분율을 나타낸다 관찰 기간의 전체 시간과 관련하여 이주. 20 % 및 15 시간의 총 시간의 활동 시간이 셀이 3 시간 동안 총 이동 한 것을 나타냅니다. 이 매개 변수는 0 %의 상기 활성 시간에 해당 비 이동 세포의 개수를 결정하는데 사용된다. (D) (E) 또는 분석 된 세포의 locomotory 활동이 상자 그림 다이어그램으로 표시 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MDA-HER2 및 MDA-NEO 유방암 세포의도 3 주제 세포 이동 데이터. 세포는 2 μM U73122 또는 공동 100 NG / ㎖ EGF 처리 하였다 양자의 mbination. (A는, B)는 MDA-HER2 (A) 및 MDA-NEO (B) 시간에 의존하여 세포 locomotory 활성을 의미. (C, D)에 2 시간을 나타내는 평균 locomotory 활동 상자 그림 다이어그램 13 시간의 시간 간격은 MDA-HER2 (C) 및 MDA-NEO의 (D) 세포 ((A, B)에 줄 참조). 통계적 유의성은 만코 Whitney- U의 -test을 사용하여 계산 하였다. *** = P <0.001. (E, F) MDA-HER2 (E) 및 MDA-NEO (F) 세포의 활성 시간의 히스토그램 플롯. 0 %의 활성 시간은 세포가 관찰 기간 동안 이동하지 않았 음을 나타냅니다. 공동으로, 20 %의 활성 시간은 15 시간의 관찰 기간을 고려,이 세포는 3 시간까지에 대한 이동 한 것을 나타냅니다. 도시는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균이다."빈>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마이그레이션 할 수있는 능력은 종양 세포 4의 특징이다. 기본 종양에서 분리하고 거의 모든 암 환자의 사망의 주요 원인이되는 보조 병변을 배정 할 수 없습니다 주위의 결합 조직 종양 세포를 통해 마이그레이션 할 수있는 기능없이. 이 때문에 관계의 많은 연구는 암 세포의 이동에 초점을 맞추고있다. 이 연구의 목적은 효율적으로함으로써 손상 또는 전이 형성을 늦추고, 종양 세포의 이동을 차단하는 신규 한 표적 분자 및 목표 경로의 식별이다. 삼중 음성 유방암 환자에서 향상된 재발 생존과 관련되어 생체 내 36 시험 관내 및 유방암 세포의 확산 전이를 억제하는 것으로 도시되고있다 β-차단제, 수도 등의 노력 예 암세포 37. 우리는 최근에 보여준 그는 자발적에서 파생 된 하이브리드 세포,인간 유방 상피 세포주 및 인간 유방암 세포주 아니지만 연령 셀 사이의 OU 융합 이벤트는, 증가 된 이동성 활동 26 케모카인 CCL21 응답. CCL21 종양 (하이브리드) 세포 전이 특성을 얻을 수 39,40 어떻게 처리 할 수있는 세포 융합을 제안하는, 유방 암 (38)을 포함하는 다양한 유형의 림프절 전이 형성과 관련되어있다.
3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 보이든 챔버 / 트랜스 웰의 분석 및 분석을 치유 스크래치 분석 / 상처에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, 세포는 3D 생리 학적 환경에 포함됩니다. 위에서 설명 된 바와 같이, 세포의 이동성 동작은 2 차원 및 3 차원 환경 3,14,15간에 현저하게 다르다. 그러므로 그것은 3D 콜라겐 격자 내에 포함 된 세포의 이동성 동작은 locom보다 생체 내 상황에보다 유사한 것으로 결론 지을 수있다이 차원 표면에 크롤 링 세포의 otory 활동. 둘째로, 시간 경과에 의한 비디오 녹화에 다양한 세포 이동 파라미터의 결정을 허용하는 특정 시간 프레임을 통해 여러 셀의 마이그레이션을 분석 할 수있다. 반대로, 보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석에서 세포들만이 하부 구획으로 이동 한 분석을 위해 고려된다. 막 위에, 예를 마이그레이션하는 그 세포들은 활성 이동성 비록 데이터 분석에 포함되지 않는다.
3D 콜라겐 매트릭스는 미세 유동 장치와 결합 될 수있는 또한 섬유 아세포, 암 세포, 내피 세포와 같은 다양한 세포 유형의 형태 및 이동에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 간질 유체를 모방 않은 세포 외 기질을 모방 이외에 및 중간 엽 줄기 세포 (41). Haessler 등.의 데이터는 간질 흐름이 비율을 증가시키는 것으로 밝혀셀 (42)의 약 20 %에 migrational 속도를 증가뿐만 아니라 이동성 될 셀. 세포, 예를 들면, 백혈구 / 림프구 또는 종양 세포의 화학 주성 거동을 연구 또한, 3 차원 미세 설정은 종양 세포 및 내피 intravasation 배리어 기능 (43)을 연구하기에 적합한 도구도이다.
3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 모두가이 조합 자극 또는 억제제 나에 대한 응답으로 세포의 이동을 분석 할 수있는 적절한 도구는이 분석 할 것을 유의해야한다 비록 일부 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 만 콜라겐 타입 I 그러나뿐만 피브로넥틴과 라미닌 어느 같은 프로테오글리칸, 비 프로테오글리칸 (예, 히알루 론산), 콜라겐 섬유를 포함한 여러 요소들의 복잡한 혼합물 인 세포 외 기질을 모방에 사용 조성물은 또한 다른 기관에서 다른 결합 조직 사이에서 현저하게 변화
이주성 세포 활성을 해독 또 다른 중요한 점은 셀 추적 절차이다. 유효하고 객관적인 데이터를 확보하기 위해서는 단일 세포의 경로를 정확하게 분석하는 것이 필수입니다. 셀 추적 세포 추적 경험을 요구하는 손에 의해 수동으로 수행된다객관적인 데이터를 얻을. 상기 데이터를 개선하고, 우리가 이주 세포, 덜 25 μM이 데이터 분석에서 제외되었음을 의미 25 μM의 컷오프 레벨을 사용하는 거짓 양성 세포의 임계 개수를 피하기 위해. 마찬가지로, 세포는 무작위로 그들이 바이어스 데이터를 방지하기 위해 활성 철새인지 아닌지를 모르고 추적 선택된다.
그들 중 일부는 3 차원 셀과 입자 (18)는 추적을 설정하기에 적합한 분석함으로써 지난 몇 년 안에 자동화 세포 추적 소프트웨어 애플리케이션이 개발되고있다. 이러한 응용 프로그램의 장점은 마이그레이션 세포가 진정으로 객관적인 방법으로 분석한다는 것입니다. 그것은 수동으로 만든 셀 트래킹 데이터와 자동 셀 트래킹 데이터를 비교하는 것이 흥미로울 그 때문에.
전술 한 바와 같이, 금 표준 3D 생리적 컨텍스트 내 세포 이동을 분석하는 것은 영상의 intravital 결합 WI의 사용이다제 2 광자 레이저 스캐닝 공 초점 현미경. 이 분석의 장점은 이주 세포가 생리적 특정 가용성 인자 호르몬 등, 세포 외 매트릭스 성분으로 이루어지는 환경뿐만 아니라, 세포 간 상호 작용에 포함된다는 것이다. 그것은 림프구는 면역 세포가 서로 48 또는 통신하는 방법 림프절 17 일 이내에 매매하는 방법을 보여주는 영화를 볼 현저한 약물 단일 세포 수준에서 생체 12,49에 분포되는 방법.
그러나, 영상의 intravital 인해 적절한 현미경 및 적절한 동물 모델의 필요성이 광자 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 오히려 비용 비싼 기술을 결합이다. 마찬가지로, 특정 세포의 이동 또는 세포 이동과 관련된 신호 전달 캐스케이드의 분석에 단일 가용성 인자 / 억제제의 영향을 연구하기 위해 정말 적합하지 않다. 이러한 목적 세포 마일을 위해연계 가능성 분석 정의 실험 조건에서, 추가로 변형 될 수있다 이산 세포 유형, 예를 과발현 또는 대상 분자의 최저의 분석을 허용 권장된다. 때문에 3D 환경과 세포의 locomotory 동작 사이의 중요한 관계를 우리는 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석 따라서 생체 내 상황에 가까운 생체 외 환경에서 세포의 이동을 연구하기위한 다양한 방법이라고 결론 지었다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petroleum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use |
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