Summary
Cell migration er et biologisk fænomen, der er involveret i en overflod af fysiologiske, såsom sårheling og immunresponser, og patofysiologiske processer, som kræft. 3D-collagenmatrix migration assay er et alsidigt værktøj til at analysere den migrerende egenskaber af forskellige celletyper inden i en 3D fysiologisk-lignende miljø.
Abstract
Evnen til at migrere er kendetegnende for forskellige celletyper og spiller en afgørende rolle i flere fysiologiske processer, herunder embryonisk udvikling, sårheling og immunresponser. Men celle migration er også en vigtig mekanisme i kræft give disse kræftceller til at løsne sig fra den primære tumor for at starte metastatisk spredning. Inden for de seneste år er der udviklet forskellige celle migration assays til at analysere vandringsadfærd forskellige celletyper. Fordi bevægelsesadfærd af celler adskiller sig markant mellem en todimensional (2D) og tre-dimensionelle (3D) miljø kan det antages, at analysen af migrationen af celler, der er indlejret i et 3D-miljø ville give mere markant cellemigration data. Fordelen ved den beskrevne 3D collagenmatrix migration assay er, at cellerne er indlejret inden for en fysiologisk 3D netværk af collagenfibre, der repræsenterer den største komponent af den ekstracellulære matrix. På grund aftime-lapse video mikroskopi virkelige celle migration målt tillader bestemmelse af flere migration parametre samt deres ændringer som reaktion på pro-migrerende faktorer eller inhibitorer. Forskellige celletyper kan analyseres ved hjælp af denne teknik, herunder lymfocytter / leukocytter, stamceller, og tumorceller. Ligeledes kunne også celle klynger eller sphæroider være indlejret i kollagenmatrixen samtidig med analyse af emigration af enkelte celler fra cellen klynge / klumpformet i kollagengitter. Vi konkluderer, at 3D-collagenmatrix migration assay er en alsidig metode til at analysere migration af celler i en fysiologisk-lignende 3D-miljø.
Introduction
Ligesom cellefusion (for en oversigt se 1,2) celle migration er en anden biologisk fænomen, der er involveret i et utal af fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling og immunreaktioner (til gennemgang se 3). Evnen til at migrere er også en forudsætning for tumorceller metastaserer (for en gennemgang se 3,4).
Cellemigrering er et komplekst, endnu ikke fuldt forstået proces, der er styret af samspillet af flere signaltransduktionsveje initieres af forskellige ligand (fx cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer, hormoner, extracellulære matrixkomponenter) receptor (f.eks receptortyrosinkinaser, kemokinreceptorer, integriner) interaktioner 5 i sidste ende forårsager reorganisering af actincytoskelettet samtidig med de- og samling af fokale vedhæftning komplekser og integrin-medieret signalering 6.
in vitro og in vivo celle migration assays er blevet udviklet i de seneste årtier, herunder Boydenkammer / transwell assay 7, scratch assay / sårheling assay 8-10, tre-dimensionelle ( 3D) collagenmatrix migration assay 11 samt intravital billedbehandling / mikroskopi (for en gennemgang se 12). Hver af disse celle migration assays har fordele og ulemper, f.eks vedrørende omkostninger og behov for udstyr, håndtering eller pålideligheden af opnåede data.
Både Boydenkammer / transwell analysen og scratch-analysen / sårheling assay er nemme, billige og veludviklede assays til at måle celle migration in vitro 7-10. I Boydenkammer / transwell assay celler podes på toppen af en indsats, der indeholder porer (ca. 8 um i diameter) - den såkaldte øvre kammer 7. Valgfrit, kan indsatsen være coatet med ekstracellulære mATRIX komponenter, fx fibronectin, kollagen, etc., for at efterligne en mere fysiologisk miljø. Ligeledes kunne endotelceller dyrkes på toppen af indsatsen, og dermed efterligne en endotelcelle barriere 13. De celler, der har passeret gennem porerne i løbet af et bestemt tidsinterval i det nedre rum huser medier og kosttilskud, såsom vækstfaktorer og chemokiner, der bruges som en udlæsning at kvantificere celle migration (eller ekstravasation).
I bunden assayet / sårhelings- assay celler podes i plader og dyrkes til konfluens 10. I afhængighed af de eksperimentelle indstilling plader kan præ-coatet med ekstracellulære matrixkomponenter, såsom fibronectin. Efter oprettelse af en ridse / sår ved skrabning cellemonolaget enkelte celler fra hver side af bunden / sår kan migrere ind i hullet, og derved fylde / healing det 10. Afstanden mellem de to sider af scratch / sår bestemmesi afhængighed af tid og anvendes som en udlæsning for vandrende aktivitet af cellerne 10. For at skelne mellem celleproliferation (der også kunne resultere i opfyldning / heling af bunden / sår) og cellemigration anbefales det at kombinere assayet med time-lapse video mikroskopi og enkelt celle sporing 10.
Men både Boydenkammer / transwell assay og ridser assay / sårheling assay er en ufuldstændig om en fysiologisk-lignende cellulære miljø. I Boydenkammer / transwell assay celler har til at migrere gennem en plast pore, mens der i bunden assayet / sårheling assay celler podet på en todimensional præ-coatede plastplade. Ligeledes er det velkendt, at vandringsadfærd varierer markant mellem en to-dimensionel og 3D-miljø 3. For eksempel tredimensionale matrix adhærencer fibroblaster afviger fra fokale og fibrillære adhæsioner karakteriseret på todimensionale substrater i deres indhold af α5β1 og αvβ3 integriner paxillin andre cytoskeletale komponenter, og tyrosinphosphorylering af fokal adhæsionkinase 14. Ligeledes celler indlejret i et 3D-miljø vises også en ændret vandringsadfærd 15. Således at analysere cellemigrering mere præcist en migration assay anbefales gør det muligt at måle migreringen af enkelte celler i en 3D fysiologisk eller fysiologisk-lignende miljø.
Intravital billedbehandling / mikroskopi er guld-standard for måling celle migration inden en 3D-fysiologisk kontekst. Dette betyder ikke kun hører til ekstracellulære matrix-celle-interaktioner, men også til vekselvirkninger mellem forskellige celletyper, såsom tumorceller og endotelceller under ekstravasation 16 eller lymfocyttrafik i lymfeknude 17, som til dato er muligt på grund forbedrede fluorescens mikroskopi teknikker, såsom 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, anvendelse af vitale fluorescerende farvestoffer og transgene musestammer, der udtrykker fluorescerende proteiner derivater 12,16,17. Derudover kunne intravital billedbehandling / mikroskopi kombineres med manuel og automatiseret celle sporing 18. Men på grund af nødvendigheden af en 2-foton konfokal laser scanning mikroskopi samt dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital billedbehandling / mikroskopi er en temmelig omkostningstung teknik.
For at overvinde begrænsningerne i Boyden kammer / transwell assay og bunden assayet / sårheling analyse og analysere migrationen af forskellige celletyper i et 3D-miljø 3D collagenmatrix migration assay blev udviklet 11,19. Derved er migrerende celler indlejret i en 3D-kollagen fibernet, som mere minder om en in vivo-situationen. Forening, som følge af time-lapse video mikroskopi virkelige celle migration målt tillader determination af flere migration parametre samt deres ændringer i respons på pro-migrerende faktorer eller inhibitorer. Forskellige celletyper kan analyseres ved hjælp af denne teknik, herunder lymfocytter og leukocytter 11,20, hæmatopoietiske stamceller / progenitorceller 21-24, og tumorceller 5,25-29. Ud over enkelte celler også celleklyngerne eller spheroids kunne være indlejret i kollagenmatrixen samtidig med analyse af emigration af enkelte celler fra cellen klynge / klumpformet i kollagengitter 30,31.
Denne protokol indeholder en oversigt over en enkel, men kraftfuld teknik til at analysere vandringsadfærd forskellige celletyper i et 3D-miljø - en in vitro metode, der giver i resultater, der er tæt på in vivo situationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Migration Chambers
- Forbered en paraffin / vaseline (1: 1) mix og varme, indtil blandingen er smeltet. Ved hjælp af en pensel og trække 2-3 lag af paraffin / vaseline (1: 1) blandes i midten af objektglasset i henhold til figurerne 1B-1D.
BEMÆRK: Vi bruger almindelige objektglas (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H)) - Påfør den smeltede paraffin / vaseline mix hurtigt på objektglasset for at undgå størkning under tegning. Sørg for paraffin / vaseline lag er ca 2-2,5 cm i længden og 0,3-0,5 cm i bredden. Tykkelsen af paraffin / vaseline lag skal være omkring 0,1 til 0,15 cm.
- Tilføj et dækglas til det størknede paraffin / vaseline mix og forsegle det med to til tre lag paraffin / vaseline mix (figur 1E, 1F). Brug 4-8 migration kamre for en fælles cellemigration eksperiment. Placer migration kamre In en oprejst position i et rack.
2. Forberedelse af collagen Suspension Cell Mix
- Harvest (fx med 0,25% trypsin / EDTA) og tælle celler af interesse. Resuspender cellerne i komplette medier indeholdende føtalt kalveserum (FCS), antibiotika og anbefalede kosttilskud. Forbered 4-8 1,5 ml reaktionsrør og 20 pi cellesuspension indeholdende 4-6 x 10 4 celler (det totale antal af celler afhænger af den celletype der skal analyseres) og fyld op til 50 pi med komplet medie.
BEMÆRK: Yderligere forbindelser (f.eks, vækstfaktorer, kemokiner, inhibitorer, etc.) sættes til cellesuspensionen. Der anvendes passende stamopløsninger, således at det endelige volumen af cellesuspension ikke overstiger 50 pi. - Forbered et samlet beløb på 452 ul endelige kollagen suspension fire celle migration eksperimenter. Tilsæt 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) og 27 pi 7,5% natriumbikarbonat opløsning (pH 9,0-9,5) Til et 1,5 ml reaktionsrør og blandes. Overhold løsning farve omgang fra gul-orange til en intens lilla (pH 9,0-9,5). Tilføj 375 ul flydende kollagen suspension til 10x MEM / natriumbicarbonatopløsning og blandes. PH af den endelige kollagen suspensionen bør være omkring 7,5 (angivet med en lys violet farve).
BEMÆRK: Kontroller pH-værdien af 7,5% natriumhydrogencarbonatopløsning. Hvis pH er omkring 7,5 sted natriumbicarbonatopløsning med åbent låg i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for at være mættet med CO 2 og øge pH (ca. 9,0-9,5). PH af kollagen suspension celle mix er afgørende for stabiliteten af collagen-netværket. Hvis den er for lav kollagengitter vil kollapse under cellemigrering eksperiment.
BEMÆRK: denne protokol, bruge flydende kollagen (pH 1,9-2,2) fra bovin hind (2,9-3,3 mg / ml kollagen, 95% collagen type I, 5% kollagen type IV). Eksempler på yderligere kollagengitter forberedelse protokoller anvendercollagen type I fra andre kilder, såsom porcint eller rotte, er givet i 32,33. Du må ikke ændre mængden af de anvendte løsninger, da dette vil ændre den ultimative kollagen koncentration på 1,67 mg / ml af gitter. En højere eller lavere koncentration kollagen har en indvirkning på tætheden af kollagen fibre og den gennemsnitlige afstand mellem dem samtidig med cellerne vandringsadfærd 34. - Tilsæt 100 pi af den endelige kollagen suspensionen til 50 pi cellesuspension og bland thoroughly.The endelig kollagen suspension (1,67 mg / ml collagen) er lidt tyktflydende. For at overføre det korrekte beløb (100 ul), pipette den endelige kollagen opløsning en gang op og ned før den overføres til cellen suspension.
BEMÆRK: Når kollagen suspension celle blanding kombineres med 10x MEM / natriumbicarbonatopløsning og pH-værdien er ændret til 7,5 kollagenfibrene straks begynde at polymerisere. - Overfør den endelige kollagen suspension celle mix fra the reaktionsrør til migrationen kamre. Bank forsigtigt på migration kammeret lige distribuere kollagen suspension celle-mix på bunden af migrationen kammer (figur 1 H). Placer migration kamre i en opretstående position i et rack og inkuberes i omkring 30 min (37 ° C, 5% CO2) for at muliggøre polymerisation af collagenfibre.
- Bemærk, at den polymeriserede kollagengitter er lidt uklar, men stadig er lyslilla farve. Fyld op migrationen kamre med komplet medium eller komplet medium med tilskud af interesse og forsegle migration kammer med paraffin / vaseline mix (Tal 1I, 1J).
3. Registrering og analyse af cellemigration
Dette afsnit beskriver registrering af celle migration med time-lapse video mikroskopi og analyse af cellemigration ved manuel cellesporing.
- Tænd mikroskopet og mikroskopbordet HEATer. Temperaturen justeres til 37 ° C. Brug en 10X mål. Placer migration kammer under et mikroskop og fokus cirka 50 celler eller mere i synsfeltet.
- Optag celle migration i tidsforskudt tilstand ved hjælp af en multi-kamera videoovervågning programmet. Spar celle migration film i et passende format, fx "* avi" eller "* .mov". Forbinde celle migration film filer til en database, der indeholder oplysninger til støtte, såsom celle type og eksperimentelle betingelser.
BEMÆRK: Vi indspiller lymfocytter og HSPCs for op til 2 timer ved hjælp af en time-lapse faktor 1:80, hvilket betyder, at 0,75 sek i time-lapse er lig med 1 min i real-tid. Tumorceller langsom bevægelse celler og er således registreret for mindst 16 timer ved hjælp af en time-lapse faktor 1: 1.800 (0,5 sek i time-lapse er lig med 15 min i real-tid). - Analyser celle migration film ved hjælp af en passende celle sporing program, ligesom ImageJ software plugin(En oversigt er givet i 18). For en uvildig analyse er det af afgørende betydning, at celler vil blive tilfældigt udvalgt uden kendskab til, hvorvidt celler er vandrende aktiv eller ej.
BEMÆRK: Vi bruger et egenudviklet program til manuelt at spore stier af mindst 30 celler pr eksperiment ved at følge de bevægelige celler præcist med musen (som er placeret til kernen). Mens sporing, er xy-koordinater sporede celler bestemmes automatisk i henhold til den anvendte time-lapse-mode. For lymfocytter / HSPCs xy-koordinater bestemmes hver 0,75 sekunder (svarende til 1 min realtime), mens det for tumorceller xy-koordinater bestemmes hver 0,5 sek (svarende til 15 min realtime). - Bestem alt 60 xy-koordinater per celle for en typisk cellemigration eksperiment. Dette er lig med 1 time realtid til lymfocytter / HSPCs og 15 timer i realtid for tumorceller. A "," indikerer, at en celle ikke har bevæget sig mellem two tidspunkter, mens en "numerisk værdi" angiver afstanden i "pixels" en celle er flyttet mellem 2 tidspunkter (figur 2A).
BEMÆRK: Manuel cellesporing kræver erfaring. Særligt hurtigt migrerende celler er vanskelige at spore og hver celletype udviser en tydelig vandringsadfærd der kan udløses ved suppleret faktorer. I tilfælde af celledeling, mens sporing, tilfældigt vælge en datter celle for fortsatte sporing. Celler, der vandrer ud af syne felt eller dør, mens sporing ikke er forsømt, men er i betragtning til analyse.
4. Data Analysis
- Analyser cellesporing data ved hjælp af et passende program, fx et regnearksprogram.
- Analyser cellesporing data ved at kopiere cellesporing rådata (figur 2A), ind i en selvstændig designet regneark skabelon. Multiplicer summen af "numeriske værdier", der repræsentererden samlede afstand en celle har migreret med en korrektionsfaktor til at konvertere "pixel" i "um".
- Bestem to parametre cellemigration: motorisk aktivitet (hvilket svarer til migration rate) og tidspunktet for aktiv bevægelse (figur 2C, 2D).
- Identificere de celler, der har migreret mindre end 25 um (tærskelværdi for at reducere antallet af falsk-positive celler) som ikke-bevægelige celler. Erstat "numeriske værdier" i disse celler med ",".
BEMÆRK: parameteren "motorisk aktivitet" (eller migration rate) repræsenterer procentdelen af celler fra den sporede cellepopulation, der er flyttet mellem to tidspunkter (figur 2D). En "numerisk værdi" er defineret som en bevægende celle, mens "," defineres som en ikke-bevægelige celle. Parameteren "tid aktiv bevægelse" (tid aktiv) repræsenterer procentdelen af den samlede tid en celle er migreret i rening for den tidsramme af observationsperioden (figur 2C). En "numerisk værdi" angiver, at en celle har bevæget sig, mens "," angiver, at en celle ikke er flyttet. Denne parameter er yderligere anvendt til at bestemme antallet af celler, der ikke er flyttet.
- Beregn statistisk signifikans og celle migration visning af data.
- Beregn statistiske signifikans af den gennemsnitlige motorisk aktivitet af celler (vandringshastighed) ved anvendelse af Mann-Whitney U test. Overvej p-værdi <0,05 som væsentlige.
- Vise den gennemsnitlige motorisk aktivitet af celler som XY-diagram, Boxplot diagram, eller som et søjlediagram diagram. Display encellede-baserede data, såsom tidspunktet for aktiv bevægelse eller hastighed, som et søjlediagram diagram eller som et histogram.
BEMÆRK: Hvis det valgte regneark programmet ikke indeholder en Boxplot diagram eller histogram diagram værktøj en online-søgning skal udføres for at kigge efter egnede tutorials.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den anvendte 3D-kollagenmatrix migration assay kombineret med time-lapse video mikroskopi og computer-assisteret cellesporing giver mulighed for bestemmelse af forskellige celle migration parametre, herunder både befolkning-baserede parameter (fx betyde motorisk aktivitet) og enkeltparametre cellebaserede (fx tidspunkt for aktiv bevægelse, hastighed, distance migreret). Et eksempel på de opnåede cellesporing datasæt, databehandling og datapræsentation er givet i figur 2. En celle sporing datafil ligner en tabel (figur 2A). Hver kolonne står for en spores celle, hvorved pr cellemigrering eksperiment 30 celler spores. Rækkerne indeholder de oplysninger om en celle er flyttet eller ikke mellem to tidspunkter. Summen af "numeriske værdier", som repræsenterer afstanden i "pixel" en celle er flyttet mellem to tidspunkter, er den samlede afstand denne celle er flyttet til. Det multipliceres med acorrection faktor til at konvertere "pixel" til "um". Celler, der er migreret mindre end 25 um er defineret som ikke-flytte celler for at reducere antallet af falske positive celler. Hastigheden (um / min) for hver celle beregnes ved at dividere "samlede distance migreret" med "total tid (min) af observationsperioden".
For at karakterisere den bevægelsesadfærd af celler almindeligvis to parametre anvendes. Motorisk aktivitet (figur 2D) repræsenterer middelværdien motorisk aktivitet (eller migration rate) af den analyserede cellepopulation, mens tidspunktet for aktiv bevægelse (figur 2C) repræsenterer den samlede tid en celle har migreret under observationsperioden. Sidstnævnte parameter yderligere anvendes til at bestemme antallet af celler, der ikke er flyttet. Grunden til at bruge to cellemigration parametre for analysen tilskrives den omstændighed, at motorisk aktivitet af celler kan udløses af font mekanismer. Der er tre muligheder, hvordan fx en vækstfaktor, kan "fremkalde" celle migration: a) i forhold til kontrolgruppen flere celler migrerer, b) antallet af bevægelige celler i sammenligning med kontrollen har ikke ændret sig, men vækstfaktor behandlet celler udviser en øget tid for aktiv bevægelse, hvilket betyder, at disse celler vil vandre i længere tid, og c) en kombination af a) og b).
Diagrammet i figur 2B illustrerer skematisk, hvordan motorisk aktivitet og tidspunkt for aktiv bevægelse beregnes. I dette eksempel vandrende aktiviteter 120 celler (som er lig med fire uafhængige forsøg) er vist. Hver diamant angiver, at en celle er flyttet mellem mindst to tidspunkter (uanset afstand cellen er flyttet!). De grå linjer blev føjet til dette diagram at vise, at den analyserede population af celler består af bevægelige og ikke-bevægelige celler. Parameteren "locomotory aktivitet "repræsenterer motorisk aktivitet af den analyserede cellepopulation i afhængighed af hvert tidspunkt (figur 2D). For eksempel kan en motorisk aktivitet på 10% ved t = 5 timer viser, at mellem t = 4,45 h og t = 5 h 10% af de analyserede celler er flyttet. Når vises som et xy-diagram parameter motorisk aktivitet indikerer dynamik i henseende den analyserede cellepopulation. En anden mulighed for at få vist motorisk aktivitet af en cellepopulation er Boxplot diagram (figur 2F).
Parameteren "tid aktiv bevægelse" (aktiv tid) er korreleret til den samlede tid en celle har bevæget sig i løbet af observationsperioden, hvorved en aktiv tid "0" angiver, at en celle ikke er flyttet (figur 2C). Den tid aktive af cellerne kan vises som et histogram.
Samspillet af EGFR / HER2 / PLC-γ1 og HER2 / HER3 / Pl3K signalering bidrager til envandrende fænotype EGFR / HER2 / HER3 positiv brystcancer celler 25. PI3K-signalering er påkrævet til generering af phosphatidyl-3,4,5-triphosphat (PIP3), der fungerer som et anker molekyle til PLC-1, derved at rekruttere dette enzym til plasmamembranen at blive aktiveret af receptortyrosinkinaser 35. Stimulering af udelukkende EGFR-positive MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) brystkræftceller resulterede i langsigtet PLC-γ1 tyrosinphosphorylering samtidig med vedvarende IP3 og DAG-niveauer producerer sinusformede calcium svingninger 27. Derimod EGFR / HER2-positiv MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) brystkræftceller viste baseline forbigående calcium svingninger efter behandling Globaliseringsfonden på grund af kortsigtede PLC-γ1 tyrosin aktivering og kortsigtet IP3 og DAG omsætning 27 angiver at HER2-ekspression var korreleret til en differentieret PLC-γ1 kinetik og signalering.
Analyse af vandringsadfærd af MDA-HER2 og MDA-NEO brystkræft cellelinier viste, at begge cellelinier udviste en lignende spontan motorisk aktivitet (MDA-HER2: 23,0-28,9%, median 26,7% vs MDA-NEO: 19,3-24,4%, median 21,5%; figur 3A-3D ). Parameteren tid aktive, repræsenterer tidspunktet for aktiv bevægelse af enkelte celler i forhold til observationsperioden, viste en lidt højere antal spontant bevæger MDA-HER2-celler (64%, figur 3E) sammenlignet med MDA-NEO brystcancerceller ( 53%, figur 3F). Stimulering med 100 ng / ml EGF førte til en signifikant forøget motorisk aktivitet i begge cellelinier. Den vandrende aktivitet af EGF behandlet MDA-HER2 hævet til 30,4 til 35,2% (middel 33,7%, figur 3A, 3C), som blev tilskrevet både et øget antal bevægelige celler (100 ng / ml EGF: 81% versus kontrol: 64%) og en øget tid for aktiv bevægelse. For eksempel er mængden af MDA-HER2-celler, der udviser en aktiv tid på 40% varsteget fra 20% (kontrol) til 28% (100 ng / ml EGF). Lignende data blev opnået for MDA-NEO brystcancerceller, som vandrende aktivitet steg til 25,2 til 35,2 (median 30,4%, figur 3B, 3D) efter EGF-stimulering. Forening flere MDA-NEO celler migreret reaktion på EGF stimulering (100 ng / ml EGF: 66% versus kontrol: 53%) og viste en forskudt tid aktiv mønster (figur 3F). For eksempel blev mængden af celler med en aktiv tid på 60% markant forøget til 30% i nærvær af EGF i forhold til ubehandlede MDA-NEO-celler (13%).
Behandling af MDA-HER2 og MDA-NEO brystcancerceller med PLC-γ1-inhibitor U73122 resulterede i en inhibering af både spontan og EGF induceret migration af celler (figur 3A-D). Men sammenlignet med MDA-NEO brystcancerceller den hæmmende virkning af U73122 på den spontane migrering af MDA-HER2-celler var forholdsvis moderat, men ikke desto mindresignifikant (kontrol: 23,0-28,9%, median: 26,7% vs 2 uM U73122: 17,8-21,5%, median: 20,0%; figur 3C). Analyse af parameteren tid aktive afslørede en let øget mængde af ikke-bevægelige celler i nærværelse af U73122 (kontrol: 36% vs 2 uM U73122: 48%, figur 3E). Tilsvarende U73122 behandling blokeret EGF induceret migration af MDA-HER2 brystkræft celler (100 ng / ml EGF: 30,4-35,2%, median 33,7% vs 100 ng / ml EGF + 2 uM U73122: 19,3-24,1%, median 22,6 %, figur 3C). I henhold til udelukkende U73122 behandlet MDA-HER2-celler denne hæmmende effekt var snarere tilskrives en øget mængde af ikke-bevægelige celler, men ikke et ændret tidspunkt aktiv mønster (figur 3C). Faktisk er en lille forskydning i retning af en øget tid på aktiv bevægelse var påviselig i migrere MDA-HER2-celler, der behandles med EGF og U73122 (figur 3C).
Derimod, Behandling af MDA-neo celler med 2 uM U73122 resulterede i en markant nedsat motorisk aktivitet på 5,6-10,7% (median: 9,3%; figur 3F), som blev primært henføres til en øget mængde af ikke-bevægelige celler (kontrol: 47% vs 2 uM U73122: 79%, figur 3F). Ligeledes blev EGF induceret migration af MDA-neo brystkræftceller markant blokeret af U73122 til 1,1 7,4% (median: 4,8%), hvilket blev tilskrevet en øget mængde af ikke-bevægelige celler (100 ng / ml EGF: 34 % versus 100 ng / ml EGF + 2 uM U73122: 70%) samt en nedsat tid aktiv mønster (figur 3F).
Figur 1. Skematisk oversigt over forberedelsen af celle migration kamre. (AE) En cellemigrering kammer fremstilles ved at trække 2-3 lag af en smeltet paraffin voks / vaseline blandes på et objektglas. (F, G) tilsættes et dækglas og forseglet med smeltet paraffin / vaseline mix. (H) Migrationen kammer sættes i opretstående stilling, efterfulgt af tilsætning af kollagen-celle suspension. Efterfølgende migration kammer anbragt i en inkubator tillader kollagen-cellesuspension til polymerisere. (I, j) er migration kammer fyldt op med medier og forseglet med smeltet paraffin / vaseline mix på den fjerde side. Derefter migration kamre placeret under et mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk oversigt over cellemigrering dataanalyse. (A) Cell sporing datafil. The vandrende aktiviteter 30 celler bestemmes pr eksperiment, hvor 60 tidspunkter analyseres. A "," angiver, at en celle ikke har bevæget sig mellem to point, mens en "numerisk værdi" angiver cellebevægelse. (B) Dette diagram er en skematisk afbildning af data i (A). Hver diamant angiver, at en er flyttet mellem to tidspunkter; en linje angiver længere bevægelse. De grå linjer blev inkluderet for at visualisere, at cellepopulationen består af ikke-bevægelige celler og flytte celler (som dog gøre pauser). (C) Tidspunkt for aktiv bevægelse (aktiv tid) repræsenterer den procentdel af den samlede tid en celle har migreret i forhold til den samlede tid for observationsperioden. En tid aktiv på 20% og en samlet tid på 15 timer angiver, at denne celle er flyttet i alt til 3 timer. Denne parameter er yderligere anvendt til at bestemme antallet af ikke-flytte celler, hvilket svarer til en aktiv tid på 0%. (D) (E) Alternativt kan motorisk aktivitet af de analyserede celler vises som en Boxplot diagram. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Data Repræsentative cellemigration MDA-HER2 og MDA-NEO brystcancerceller. Cellerne blev behandlet med 100 ng / ml EGF, 2 uM U73122 eller med en co mbination af begge. (A, B) Middel motorisk aktivitet af MDA-HER2 (A) og MDA-NEO (B) celler i afhængighed af tiden. (C, D) Boxplot diagram af den gennemsnitlige motorisk aktivitet, som repræsenterer 2 timer til 13 timers tidsinterval (se bar (A, B)) MDA-HER2 (C) og MDA-NEO (D) celler. Statistisk signifikans blev beregnet ved anvendelse af Mann-Whitney- U-test. *** = P <0,001. (E, F) Histogram afbildninger af aktiv tid MDA-HER2 (E) og MDA-NEO (F) celler. En aktiv tid på 0% angiver, at cellerne ikke har bevæget sig i løbet af observationsperioden. Forening, en tid aktiv på 20% viser, at i betragtning af en observationsperiode på 15 timer, er disse celler flyttet op til 3 timer. Vist er gennemsnittet af mindst tre uafhængige forsøg.blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at migrere er kendetegnende for tumorceller 4. Uden evnen til at løsne sig fra den primære tumor og til at vandre gennem de omgivende bindevæv tumorceller vil ikke være i stand til at pode sekundære læsioner, som er den vigtigste dødsårsag for næsten alle cancerpatienter. På grund af dette forhold mange undersøgelser fokuserer på kræft celle migration. Formålet med disse undersøgelser er identifikationen af nye målmolekyler og målrette veje, der effektivt blokerer tumorcellemigration og derved svække eller bremse metastasedannelse. Et eksempel på en sådan indsats kunne være β-blokkere, som har vist sig at hæmme metastatisk spredning af brystkræft celler in vitro og in vivo 36, og som har været forbundet med en forbedret tilbagefald overlevelse hos patienter med triple-negativ brystkræft cancerceller 37. Vi har for nylig vist, at hybride celler, som stammer fra Spontaneskellige fusionsbegivenheder mellem en human bryst epitelcellelinie og en human brystcancer cellelinje, men ikke de parentale celler, svarede til chemokin CCL21 med en øget vandrende aktivitet 26. CCL21 er blevet forbundet med lymfeknudemetastaser dannelsen af forskellige cancertyper, herunder bryst-38, hvilket antyder, at cellefusion kan være en proces, hvor tumor (hybrid) cellerne kan erhverve metastatiske egenskaber 39,40.
3D collagenmatrix migration assay har flere fordele sammenlignet med Boyden kammer / transwell assay og bunden assayet / sårheling assay. For det første kan celler indlejret i en 3D fysiologisk miljø. Som nævnt ovenfor, vandringsadfærd af celler adskiller sig markant mellem en to-dimensionel og 3D-miljø 3,14,15. Således kan det konkluderes, at vandringsadfærd af celler indlejret i en 3D-kollagengitter ligner mere til in vivo-situationen end locomotory aktivitet af celler kravler på en todimensional overflade. For det andet, på grund af tidsforskudt videooptagelse, er det muligt at analysere migration af flere celler over en vis tidsramme, der muliggør bestemmelse af forskellige celle migration parametre. Derimod i Boyden kammer / transwell assay kun de celler, anses for analyse, der er flyttet til det nedre kammer. Disse celler, der migrerer fx på toppen af membranen er ikke medtaget i analysen data, selv om de er vandrende aktive.
3D collagenmatrix kan kombineres med mikrofluide anordninger, der udover at efterligne den ekstracellulære matrix kan også efterligne den interstitielle væske, som har vist sig at påvirke morfologien og migrering af forskellige celletyper, såsom fibroblaster, cancerceller, endotelceller og mesenkymale stamceller 41. Data for Haessler et al. Afslørede, at interstitiel strømning øger procentdelenaf celler, der bliver vandrende samt øger migrational hastighed i omkring 20% af cellerne 42. Ud over at undersøge den kemotaktiske adfærd af celler, fx leukocytter / lymfocytter eller tumorceller, en 3D mikrofluid indstilling er også et egnet værktøj til at studere tumorcelle intravasation og endotel barrierefunktion 43.
Selvom 3D collagenmatrix migration assay er et velegnet redskab til at analysere migrationen af celler som respons på en stimulus eller en inhibitor eller en kombination af begge dele skal det bemærkes, at dette assay gør også har nogle begrænsninger. For eksempel er kun collagen type I, der anvendes til at efterligne den ekstracellulære matrix, hvilket imidlertid er en kompleks blanding af flere komponenter, herunder proteoglycaner, non-proteoglycaner (fx hyaluronsyre), collagenfibre såvel fibronectin og laminin, og som sammensætning yderligere varierer markant mellem forskellige bindevæv i forskellige organer
Et andet kritisk punkt i decifrere cellerne vandrende aktivitet er cellesporing procedure. For at opnå gyldig og objektive data er det obligatorisk, at stien til enkelte celler analyseres præcist. Cellesporing udføres manuelt med hånden, hvilket kræver cellesporing erfaringfå objektive data. For yderligere at forbedre de data, og for at undgå et kritisk antal falske positive celler vi bruger en cut-off på 25 um, hvilket betyder, at celler, der har migreret mindre end 25 um, blev udelukket fra dataanalyse. Ligeledes er celler tilfældigt udvalgt til sporing uden at vide, om de er vandrende aktiv eller ej for at undgå partiske data.
Inden for de seneste år er der udviklet flere automatiske cellesporing software applikationer, hvor nogle af dem er egnede til at analysere celle og partikel tracking i en 3D-indstilling 18. Fordelen ved sådanne ansøgninger er, at migrerende celler virkelig analyseres på en objektiv måde. På grund af at det ville være interessant at sammenligne automatiserede celle sporing af data med manuelt gjort cellesporing data.
Som nævnt ovenfor, at guld-standarden analysere cellemigration i en 3D fysiologisk sammenhæng er brugen af intravital billeddannelse kombineret with 2-foton laser scanning konfokal mikroskopi. Fordelen ved dette assay er, at migrerende celler er indlejret i deres fysiologiske miljø, der består af specifikke opløselige faktorer, hormoner, etc., ekstracellulære matrixkomponenter samt celle-til-celle-interaktioner. Det er bemærkelsesværdigt at se film der viser hvordan lymfocytter menneskehandel i en lymfeknude 17, hvor immunceller kommunikerer med hinanden 48 eller hvordan stoffer er fordelt in vivo ved en enkelt celle niveau 12,49.
Imidlertid intravital billeddannelse kombineret med 2-foton laser scanning konfokal mikroskopi er en temmelig omkostningseffektiv dyre teknik på grund af behovet for en passende mikroskop og hensigtsmæssige dyremodeller. Ligeledes er det ikke virkelig egnet til at studere indflydelsen af enkelte opløselige faktorer / inhibitorer for migration af særlige celler eller analyse af cellemigration relateret signaltransduktion kaskader. Til disse formål celle kmtionsindsatsen assays anbefales tillader analyse af diskrete celletyper, der kan modificeres yderligere, f.eks overekspression eller knockdown af målmolekyler i definerede eksperimentelle betingelser. På grund af den drejelige forbindelse mellem et 3D-miljø og bevægelsesadfærd af celler vi konkludere, at 3D-collagenmatrix migration assay er således en alsidig metode til at studere migration af celler i et in vitro indstilling, der er tæt på in vivo-situationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petroleum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use |
References
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
