Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

Published: October 5, 2014 doi: 10.3791/51963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Summary

Cell migrasjon er et biologisk fenomen som er involvert i en mengde av fysiologisk, slik som sårheling og immunresponser, og patofysiologiske prosesser, som kreft. Den 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en allsidig verktøy for å analysere de trekkende egenskaper av forskjellige celletyper innenfor et 3D fysiologisk lignende miljø.

Abstract

Evnen til å migrere er et kjennetegn på ulike celletyper og spiller en avgjørende rolle i flere fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser. Imidlertid er cellemigrasjon også en viktig mekanisme i kreft slik at disse kreftceller til å løsne fra den primære tumor til å begynne metastatisk spredning. I løpet av de siste årene forskjellige cellemigrerings analyser har blitt utviklet for å analysere den vandringsadferd av forskjellige celletyper. Fordi motorisk oppførsel av cellene markert forskjellig mellom en to-dimensjonal (2D), og tre-dimensjonale (3D) miljø kan det antas at analysen av migrering av celler som er innebygd i et 3D-miljø ville gi mer signifikant cellemigrasjon data. Fordelen med den beskrevne 3D kollagenmatriksen migrasjon analysen er at cellene er innleiret i en fysiologisk 3D nettverk av kollagenfibre som representerer den viktigste komponent av ekstracellulær matriks. Grunnettime-lapse videomikros fast cellemigrasjon blir målt slik at bestemmelse av en rekke migrasjonsparametere så vel som deres endringer som respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter / leukocytter, stamceller og kreftceller. Likeledes kan også celle klynger eller sfæroider bli integrert i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitteret. Vi konkluderer med at 3D-migrasjon kollagen matriks-analysen er en anvendelig metode for å analysere migreringen av celler i en fysiologisk lignende 3D miljø.

Introduction

Som cellefusjon (for en oversikt se 1,2) celle migrasjon er en annen biologisk fenomen som er involvert i en mengde fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, sårheling og immunresponser (for gjennomgang se 3). Imidlertid er evnen til å migrere videre en forutsetning for tumorceller til å metastasere (for gjennomgang se 3,4).

Cell migrering er en kompleks, ennå ikke fullt forstått prosess som er styrt av et samspill av flere signaltransduksjonsveier initieres med forskjellige ligand (f.eks, cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, hormoner, ekstracellulære matriks-komponenter)-reseptor (for eksempel reseptor tyrosinkinaser, kjemokine reseptorer, inte) interaksjoner fem slutt forårsaker omorganisering av aktin cytoskjelettet samtidig med de- og remontering av fokale vedheft komplekser og inte-mediert signale seks.

in vitro og in vivo cellemigrasjon analyser har blitt utviklet de siste tiårene, inkludert Boyden kammer / Transwell analysen 7, scratch analysen / sårheling analysen 8-10, tredimensjonale ( 3D) kollagenmatriksen migrasjon assay 11 så vel som intravital avbildning / mikroskopi (for gjennomgang se 12). Hver av disse cellemigrasjon analyser har fordeler og ulemper, f.eks om kostnader og behov for utstyr, håndtering eller påliteligheten av innhentet data.

Både Boyden kammer / Transwell analysen og scratch analysen / sårheling analysen er enkle, rimelige og velutviklede metoder for å måle celle migrasjon in vitro 7-10. I Boyden kammer / Transwell analyse celler er sådd på toppen av en innsats inneholdende porer (ca. 8 mikrometer i diameter) - den såkalte øvre rom 7. Valgfritt, kan innsatsen være belagt med ekstracellulær mATRIX komponenter, f.eks, fibronektin, kollagen, etc., for å etterligne en mer fysiologisk miljø. Likeledes kan endotelceller dyrkes på toppen av innsatsen og dermed etterligne en endotelcelle barriere 13. De cellene som har gått gjennom porene i løpet av en definert tidsintervall i nedre kammer husing media og kosttilskudd, slik som vekstfaktorer og kjemokiner, blir brukt som et lese-out for å kvantifisere celle migrasjon (eller bloduttredelse).

I scratch analysen / sårtilheling analyse cellene er sådd i form av plater og er vokst til konfluens 10. I avhengighet av de eksperimentelle innstillingsplatene kan være forhåndsbelagt med ekstracellulære matriks-komponenter, slik som fibronektin. Etter å ha laget en ripe / såret ved skraping blir cellemonoskiktet enkeltceller fra hver side av bunnen / såret kan migrere inn i gapet, for derved å fylle / helbredende det 10. Avstanden mellom de to sider av skrape / sår bestemmesi avhengighet av tiden, og brukes som en lese-ut for den vandrende aktiviteten av cellene 10. Imidlertid, for å diskriminere mellom celleproliferasjon (som også kan føre til fylling / helbredelse av grunnen / sår) og cellemigrasjon er det anbefalt å kombinere analysen med time-lapse videomikroskopi og enkelt celle sporing 10.

Men både Boyden kammer / Transwell assay og ripe assay / sårheling analysen, er temmelig ufullkomment om en fysiologisk lignende cellulære miljø. I Boyden kammer / Transwell analysecellene har til å migrere gjennom en pore av plast, mens det i bunnen av assay / sårheling analyseceller sås på en to-dimensjonal pre-belagte plastplate. Likeledes er det velkjent at den vandrende oppførsel skiller seg markant mellom en to-dimensjonal og 3D miljø 3. For eksempel tredimensjonal matrise voksninger av fibroblaster avvike fra fokale og fibrillar sammenvoksninger karakteriseres på to-dimensjonale substrater i sitt innhold av α5β1 og αvβ3 integrinene, paxillin, andre cytoskeletal komponenter, og tyrosinfosforylering av fokus vedheft kinase 14. Likeledes, celler innebygd i et 3D-miljø også vises en endret trekkadferden 15. Således for å analysere cellemigrasjon mer nøyaktig en migreringsanalyse er anbefalt som tillater å måle overføringen av enkeltceller i et 3D fysiologiske eller fysiologisk lignende miljø.

Intravital avbildning / mikroskopi er gull-standarden for måling av cellemigrering innenfor et 3D fysiologisk sammenheng. Dette betyr ikke bare hører til ekstracellulære matriks-celle interaksjoner, men også til interaksjonene mellom forskjellige celletyper, slik som tumor-celler og endotelceller under ekstravasasjon 16 eller lymfocytt handel innen lymfeknute 17, som til dags dato, er mulig på grunn forbedrede fluorescensmikroskopi teknikker, for eksempel 2-fotonkonfokal laser scanning mikroskopi, bruk av vitale fluorescerende fargestoffer og transgene musestammer som uttrykker fluorescerende proteiner derivater 12,16,17. I tillegg kan intra bildebehandling / mikros kombineres med manuell og automatisert celle sporing 18. Imidlertid, på grunn av behovet for en 2-foton konfokal laser-skanning mikroskopi, så vel som dyr (og egnede transgene dyremodeller) intravital avbildning / mikroskopi er en ganske kostnadskrevende teknikk.

For å overvinne begrensningene i Boyden kammer / Transwell analysen og ripe assay / sårheling assay og for å analysere migrering av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø 3D kollagenmatriksen migrering assay ble utviklet 11,19. Derved blir migrerende celler innleiret i en 3D-kollagen fibernett, som mer ligner til in vivo-situasjonen. Conjointly, på grunn av time-lapse video mikros ekte cellemigrasjon måles slik at bestemme strnasjon av flere migrasjonsparametere så vel som deres forandringer i respons på pro-trekkende faktorer eller inhibitorer. Ulike celletyper kan analyseres ved hjelp av denne teknikken, inkludert lymfocytter og leukocytter 11,20, blodkreft stilk / stamceller 21-24, og kreftceller 5,25-29. I tillegg til enkle celler også celleklynger eller sfæroider kan være innebygd i kollagenmatriksen samtidig med analyse av utvandring av enkeltceller fra celle klynge / sfæroide inn i kollagen gitter 30,31.

Denne protokollen gir en oversikt om et enkelt, men kraftig teknikk for å analysere vandringsadferd av forskjellige celletyper innenfor et 3D miljø - en in vitro fremgangsmåte gir resultater som er i nærheten av den in vivo-situasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Migration Chambers

  1. Tilbered en parafinvoks / vaselin (1: 1) blanding og varme inntil blandingen har smeltet. Ved hjelp av en maling-børste og trekke 2-3 lag av parafinvoks / vaselin (1: 1) Bland i midten av glass-slide i henhold til figurene 1B-1D.
    MERK: Vi bruker vanlige glassplater (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / D / H))
  2. Påfør smeltet parafinvoks / vaselin mix raskt på glasset lysbilde for å unngå størkning mens du tegner. Sørg for at parafinvoks / vaselin laget er ca 2-2,5 cm i lengde og 0,3-0,5 cm i bredden. Tykkelsen av parafinvoks / vaselin lag bør være omtrent 0,1 til 0,15 cm.
  3. Legg et dekkglass til størknet parafinvoks / vaselin mix og forsegle den med to til tre lag parafinvoks / vaselin mix (Tall 1E, 1F). Bruk 4-8 ​​migrasjons kamre for en vanlig celle migrasjon eksperiment. Sted migrasjons kamre In en oppreist stilling i et stativ.

2. Utarbeidelse av kollagen Suspension Cell Mix

  1. Harvest (f.eks, med 0,25% Trypsin / EDTA) og telle celler av interesse. Resuspender cellene i komplett medium inneholdende kalvefosterserum (FCS), antibiotika og anbefalte kosttilskudd. Forbered 4-8 1.5 ml reaksjonsrørene og 20 ul cellesuspensjon inneholdende 4-6 x 10 4 celler (det totale antall celler er avhengig av celletypen som skal bli analysert) og fyll opp til 50 ml med komplett medium.
    MERK: Ytterligere forbindelser (for eksempel vekstfaktorer, kjemokiner, hemmere, etc.) er lagt til cellesuspensjonen. Bruk passende stamløsninger slik at det endelige volum av cellesuspensjonen ikke overstiger 50 mikroliter.
  2. Forbered et samlet beløp på 452 mL endelig kollagen suspensjon for fire celle migrasjon eksperimenter. Tilsett 50 ul 10 x MEM (pH 5,1-5,5) og 27 pl av 7,5% natrium-bikarbonat-oppløsning (pH 9,0 til 9,5) Til en 1,5 ml reaksjonsrøret og bland grundig. Observer løsningen farge sving fra gul-oransje til intens lilla (pH 9,0 til 9,5). Legg 375 ul væske kollagensuspensjonen til 10 x MEM / natriumbikarbonat-løsning, og blandes godt. PH-verdien av den endelige kollagensuspensjonen bør være omtrent 7.5 (indikert med en lys fiolett farge).
    MERK: Kontroller pH-verdien for 7,5% natrium-bikarbonat-oppløsning. Hvis pH-verdien er ca 7,5 sted natrium-bikarbonat-oppløsning med et åpent lokk i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for å bli mettet med CO2 og øke pH (ca. 9,0 til 9,5). PH-verdien av suspensjonen av kollagen celle blanding er avgjørende for stabiliteten av kollagen-nettverk. Hvis den er for lav kollagen gitteret vil kollapse i løpet av celle migrasjon eksperiment.
    MERK: For denne protokollen, bruke flytende kollagen (pH 1,9-2,2) fra storfe hind (2.9 til 3.3 mg / ml kollagen, 95% kollagen type I, 5% kollagen type IV). Eksempler på ytterligere kollagen gitter forberedelse protokoller som brukerkollagen type I fra andre kilder, slik som fra svin eller rotte, er gitt i 32,33. Ikke endre volumene på de brukte løsninger som dette vil endre den ultimate kollagen konsentrasjonen av 1,67 mg / ml av gitteret. En høyere eller lavere kollagen konsentrasjonen har en innvirkning på tettheten av kollagenfibre og den gjennomsnittlige avstanden mellom dem samtidig med cellene trekkadferden 34.
  3. Tilsett 100 pl av den endelige kollagensuspensjon til 50 pl cellesuspensjon, og bland thoroughly.The endelige kollagen suspensjon (1,67 mg / ml kollagen) er svakt viskøs. For å overføre riktig beløp (100 pl), pipetter den endelige kollagen løsning en gang opp og ned før du overfører den til cellesuspensjonen.
    MERK: Når kollagen suspensjon celle blanding er kombinert med 10x MEM / natriumbikarbonat-oppløsning og pH-verdien er endret til 7,5 kollagenfibre umiddelbart begynne å polymerisere.
  4. Overfør den endelige kollagen suspensjon celle mix fra the reaksjonsrørene til overgangen kamre. Forsiktig på migrering kammeret til jevnt å fordele den kollagensuspensjon celle blanding på bunnen av overføringskammeret (figur 1 H). Plasser kamrene migrasjon i en oppreist stilling i et stativ og inkuberes i omtrent 30 min (37 ° C, 5% CO2) for å tillate polymerisering av kollagenfibre.
  5. Legg merke til at den polymeriserte kollagen gitteret er litt uklar, men fortsatt er lys lilla farge. Fyll opp migrasjons kamre med komplett medium eller komplett medium med tilskudd av interesse og forsegle migrasjon kammer med parafinvoks / vaselin mix (Tall 1I, 1J).

3. Opptak og analyse av celle migrasjon

Denne delen beskriver innspillingen av celle migrasjon av time-lapse video mikroskopi og analyse av celle migrasjon ved manuell celle sporing.

  1. Slå på mikroskopet og mikroskop scenen heater. Juster temperaturen til 37 ° C. Bruk en 10X objektiv. Plasser migrering kammer under et mikroskop og fokus omtrent 50 celler eller mer i synsfeltet.
  2. Record celle migrasjon i time-lapse-modus ved hjelp av en multi-kamera videoovervåkning program. Lagre celle migrasjon filmer i en passende format, for eksempel "* avi" eller "* .mov". Knytte cellemigrasjon filmfiler til en database som inneholder tilleggsinformasjon, for eksempel celletype og eksperimentelle forhold.
    MERK: Vi tar opp lymfocytter og HSPCs for opptil 2 timer ved hjelp av en time-lapse faktor på 1:80, noe som betyr at 0,75 sek i time-lapse er lik 1 min i sanntid. Kreftceller er langsom bevegelse celler og er dermed tatt opp i minst 16 timer ved hjelp av en tidsintervall faktor på 1: 1800 (0,5 sek ved intervall er lik 15 min i sanntid).
  3. Analysere cellemigrasjon filmer ved hjelp av en passende celle sporing programmet, som ImageJ programvare plugins(En oversikt er gitt i 18). For en objektiv analyse er det av avgjørende betydning at cellene vil bli valgt tilfeldig uten kunnskap om cellene er trekkfugler aktive eller ikke.
    MERK: Vi bruker et egenutviklet program for å spore banene minst 30 celler per eksperiment manuelt ved å følge bevegelige celler nøyaktig med musepekeren (som er plassert til kjernen). Mens sporing, er xy-koordinatene til de spores celler automatisk fastsatt i samsvar til brukte time-lapse-modus. For lymfocytter / HSPCs xy-koordinater bestemmes hver 0,75 sek (tilsvarer 1 min realtime), mens for kreftceller xy-koordinater blir fastsatt for hvert 0,5 sek (tilsvarer 15 min realtime).
  4. Bestem totalt 60 xy-koordinater per celle for en typisk celle migrasjon eksperiment. Dette er lik 1 hr sanntid for lymfocytter / HSPCs og 15. HR sanntid for tumorceller. A "," indikerer at en celle ikke har beveget seg mellom two tidspunkter, mens en "numerisk verdi" angir avstanden i "piksler" en celle som har beveget seg mellom to tidspunkter (figur 2A).
    MERK: Manuell celle sporing krever erfaring. Spesielt raskt migrerende celler er vanskelig å spore og hver celletype utviser en distinkt vandringsadferd som kan bli utløst av supplert faktorer. Ved celledeling mens sporing, tilfeldig velge en datter celle for å fortsette sporing. Celler som vandrer ut av synet felt eller dø mens sporing er ikke neglisjert, men anses for analyse.

4. Data Analysis

  1. Analysere cellesporingsdata ved hjelp av et egnet program, for eksempel, et regnearkprogram.
    1. Analysere cellesporingsdata ved å kopiere cellen sporing rådata (figur 2a), inn i en selvlaget mal for regneark. Multipliser summen av "tallverdier", som representererden totale distansen en celle har migrert med en korreksjonsfaktor for å konvertere "pixel" inn "mikrometer".
    2. Bestem to cellemigrasjon parametere: motorisk aktivitet (som tilsvarer migrasjonsrate) og tid for aktiv bevegelse (Tall 2C, 2D).
    3. Identifiser de celler som har migrert mindre enn 25 mikrometer (terskelnivået for å redusere antallet av falske positive celler) som ikke-glidende celler. Erstatt "numeriske verdier" av disse cellene med ",".
      MERK: Parameteren "motorisk aktivitet" (eller migrasjonsrate) representerer prosentandelen av celler i sporet cellepopulasjon som har flyttet mellom to tidspunkter (figur 2D). En "tallverdi" er definert som en celle i bevegelse, mens "," er definert som en ikke-glidende celle. Parameteren "tid for aktiv bevegelse" (tid aktiv) representerer prosentandelen av den totale tiden en celle har migrert i rening til tidsrammen av observasjonsperioden (figur 2C). En "tallverdi" indikerer at en celle er flyttet, mens "," indikerer at en celle ikke har beveget seg. Denne parameteren blir videre benyttet for å bestemme antall celler som ikke har beveget seg.
  2. Beregne statistisk signifikans og vise celle migrasjon data.
    1. Beregn statistisk signifikans av middelverdien motorisk aktivitet av cellene (migrasjonshastighet) ved hjelp av Mann-Whitney U-test. Tenk p-verdi <0,05 som vesentlig.
    2. Vise gjennomsnittet motorisk aktivitet av celler som xy-diagram, Plott diagram, eller som et søylediagram. Vise encellete baserte data, for eksempel tidspunktet for aktiv bevegelse eller hastighet, som en søylediagram eller som et histogram.
      MERK: Hvis den valgte regneark aktuelle programmet ikke inneholder et boksplott diagram eller histogram chart verktøy en online søk skal utføres for å se etter egnede tutorials.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den brukte 3D-kollagen matrise migrasjon analysen kombinert med time-lapse video-mikroskopi og datastøttet celle sporing gjør for bestemmelse av ulike cellemigrasjon parametere inkludert både populasjonsbasert parameter (f.eks, mener motorisk aktivitet) og enkeltcellebaserte parametere (for eksempel tidspunktet for aktiv bevegelse, hastighet, avstand migrert). Et eksempel på de oppnådde celle sporing datasett, databehandling og datapresentasjons er gitt i figur 2. En celle sporing datafil ligner en tabell (figur 2A). Hver kolonne står for en beltegående celle, hvorved per celle migrasjon eksperiment 30 celler blir registrert. Radene inneholder informasjonen om en celle har beveget seg eller ikke mellom to tidspunkter. Summen av de "tallverdier", som representerer avstanden i "pixel" en celle har beveget seg mellom to tidspunkter, er den totale avstanden denne celle har migrert. Det er multiplisert med acorrection faktor å konvertere "pixel" inn "mikrometer". Celler som har migrert mindre enn 25 mikrometer er definert som ikke-glidende celler for å redusere antallet av falske positive celler. Den hastighet (um / min) for hver celle beregnes ved å dividere "total distanse migrert" av "total tid (min) av observasjonsperioden".

For å karakterisere den motorisk oppførsel av celler som vanligvis to parametre benyttes. Motorisk aktivitet (figur 2D) representerer middelverdien motorisk aktivitet (eller migrasjon rate) av den analyserte cellepopulasjon, mens tidspunktet for aktiv bevegelse (figur 2C) representerer den totale tid i en celle har migrert i løpet av observasjonsperioden. Den sistnevnte parameter blir videre benyttet for å bestemme antall celler som ikke har beveget seg. Grunnen til å bruke to cellemigreringsparametre for analyse er knyttet til det faktum at den motorisk aktivitet av celler som kan utløses av different mekanismer. Det finnes tre muligheter for hvordan, f.eks, en vekstfaktor, kan "induserer" celle migrasjon: a) i forhold til styre flere celler migrerer, b) antall celler i bevegelse i forhold til kontrollen er ikke endret, men vekstfaktor behandles cellene oppviser en øket tid for aktiv bevegelse, noe som betyr at disse cellene vil migrere for en lengre tid, og c) en kombinasjon av a) og b).

Diagrammet i Figur 2B illustrerer skjematisk hvordan motorisk aktivitet og tid for aktiv bevegelse beregnes. I dette eksempelet er den trekkende aktivitetene til 120-celler (som er lik fire uavhengige eksperimenter) er vist. Hver diamant indikerer at en celle har beveget seg mellom minst to tidspunkter (uavhengig av avstanden i cellen har migrert!). De grå linjer ble tilsatt til dette diagram for å vise at den analyserte populasjon av celler består av bevegelige og ikke-bevegelige celler. Parameteren "locomotory aktivitet "representerer motorisk aktivitet av den analyserte cellepopulasjon i avhengighet av hvert tidspunkt (figur 2D). For eksempel angir en motorisk aktivitet på 10% ved t = 5 hr at mellom t = 4,45 t og t = 5 timer 10% av de analyserte celler er flyttet. Når vises som et xy-diagram parameter motorisk aktivitet indikerer dynamicity av den analyserte cellepopulasjon. En annen mulighet for å vise motorisk aktivitet av en cellepopulasjon er Boksdiagrammet (figur 2F).

Parameteren "tid av aktiv bevegelse" (tiden aktivt) er korrelert til den totale tiden en celle har flyttet seg i løpet av observasjonsperioden, hvorved en tids aktive av "0" indikerer at en celle ikke har beveget seg (figur 2C). Klokka aktive av cellene kan vises som et histogram.

Samspillet mellom EGFR / HER2 / PLC-γ1 og HER2 / HER3 / PI3K signalering bidrar til entrekkfugl fenotype av EGFR / HER2 / HER3 positiv brystkreft celler 25. PI3K signalering er nødvendig for generering av fosfatidyl-3,4,5-trisphosphate (PIP3), som fungerer som et anker molekyl for PLS-en, for derved å rekruttere dette enzymet til plasmamembranen til å bli aktivert av reseptor tyrosinkinaser 35. Stimulering av utelukkende EGFR positive MDA-MB-468-NEO (MDA-NEO) brystkreft celler resulterte i langsiktig PLC-γ1 tyrosinfosforylering samtidig med vedvarende IP3 og Dag nivåer produserer sinus kalsium svingninger 27. I motsetning EGFR / HER2 positive MDA-MB-468-HER2 (MDA-HER2) brystkreft celler vises baseline transient kalsium svingninger etter EGF behandling på grunn av kortsiktig PLC-γ1 tyrosin aktivering og kortsiktig IP3 og DAG omsetning 27 indikerer at HER2 ekspresjon ble korrelert til en differensial PLC-γ1 kinetikk og signalering.

Analyse av vandringsadferd av MDA-HER2-og MDA-NEO brystkreft cellelinjer avslørte at begge cellelinjer viste en lignende spontan motorisk aktivitet (MDA-HER2: 23,0 til 28,9%, median: 26.7% vs MDA-NEO: 19,3 til 24,4%, median: 21,5%; 3A-3D ). Parameteren tid aktive, som representerer tiden for aktiv bevegelse av enkeltceller i forhold til observasjonsperioden, avslørte en litt høyere antall spontant bevegelige MDA-HER2-celler (64%; figur 3E) som i forhold til MDA-NEO brystkreftceller ( 53%; figur 3F). Stimulering med 100 ng / ml EGF resulterte i en signifikant økning i motorisk aktivitet i begge cellelinjer. Den vandrende aktiviteten til EGF behandlet MDA-HER2 hevet til 30,4 til 35,2% (median 33,7%, 3A, 3C), som ble tilskrevet både et økt antall bevegelige celler (100 ng / ml EGF: 81% vs kontroll: 64%) og en øket tid for aktiv bevegelse. For eksempel er mengden av MDA-HER2-celler som oppviser en tids aktiv på 40% varøkt fra 20% (kontroll) til 28% (100 ng / ml EGF). Lignende data ble innhentet for MDA-NEO brystkreft celler, som vandrende aktivitet ble økt til 25,2 til 35,2 (median 30,4%, Tall 3B, 3D) ved EGF stimulering. Conjointly, mer MDA-NEO-celler migrert som respons på EGF-stimulering (100 ng / ml EGF: 66% sammenlignet med kontroll: 53%) og viste en forskjøvet tid aktive mønster (figur 3F). For eksempel ble mengden av celler som har et tids aktive av 60% markert økt til 30% i nærvær av EGF, sammenlignet med ubehandlede MDA-NEO-celler (13%).

Behandling av MDA-HER2 og MDA-NEO brystkreftceller med PLC-γ1 inhibitor U73122 resulterte i en inhibering av både spontan og EGF induserte migrasjon av celler (figur 3A-D). Men sammenlignet med MDA-NEO brystkreft celler hemmende effekt U73122 på spontan migrasjon av MDA-HER2-celler var ganske moderat, men likevelsignifikant (kontroll: 23,0 til 28,9%, median: 26.7% vs 2 mikrometer U73122: 17,8 til 21,5%, median: 20,0%; Figur 3C). Analyse av para tid aktive avslørte en litt økt mengde av ikke-glidende celler i nærvær av U73122 (kontroll: 36% g 2 uM U73122: 48%; figur 3E). Tilsvarende U73122 behandling blokkert EGF indusert migrering av MDA-HER2 brystkreft celler (100 ng / ml EGF: 30,4 til 35,2%, median 33,7% vs 100 ng / ml EGF + 2 mikrometer U73122: 19,3 til 24,1%, median 22.6 %; Figur 3C). I henhold til utelukkende U73122 behandlet MDA-HER2 celler denne hemmende effekt ble heller tilskrives en økt mengde av ikke-bevegelige celler, men ikke en endret tid aktiv mønster (Figur 3C). Faktisk en liten dreining mot økt tidspunktet for aktiv bevegelse ble observert hos migrere MDA-HER2 celler som behandles med EGF og U73122 (Figur 3C).

I motsetning, Behandling av MDA-NEO celler med to mikrometer U73122 resulterte i en markant redusert motorisk aktivitet av 5.6 til 10.7% (median: 9,3%; Figur 3F) som primært ble tilskrevet en økt mengde av ikke-bevegelige celler (kontroll: 47% g 2 pM U73122: 79%; figur 3F). Likeledes, EGF induserte migrering av MDA-NEO brystkreftceller ble markert blokkert av U73122 til 1,1 til 7,4% (median: 4,8%), som ble tilskrevet en øket mengde av ikke-glidende celler (100 ng / ml EGF: 34 % g 100 ng / ml EGF + 2 mM U73122: 70%) så vel som til en redusert tid aktive mønster (figur 3F).

Figur 1
Figur 1. Skjematisk oversikt over utarbeidelse av celle migrasjon kamre. (AE) En celle migrasjon kammeret er fremstilt ved å trekke 2-3 lag av en smeltet paraffin voks / vaselin blandes på en glass-slide. (F, G) Et dekkglass tilsettes og forseglet med smeltet parafinvoks / vaselin blanding. (H) Migrasjons kammeret er satt i en loddrett stilling, etterfulgt av tilsetning av kollagen-celle suspensjon. Derpå blir migreringskammeret plassert i en inkubator at kollagen-cellesuspensjonen for å polymerisere. (I, J) er Migreringen kammer fylt opp med mediene og forseglet med smeltet parafinvoks / vaselin blanding på den fjerde siden. Deretter blir migrasjons kamre plassert under et mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk oversikt over celle migrasjon dataanalyse. (A) Celle sporings datafil. The trekkende aktiviteter av 30 celler er bestemt per forsøk, hvorved 60 tidspunkt blir analysert. A "," indikerer at en celle ikke har beveget seg mellom to punkt, mens en "numerisk verdi" angir celle bevegelse. (B) Denne figuren er et skjematisk riss av data presentert i (A). Hver diamant indikerer at en har beveget seg mellom to tidspunkter; en linje indikerer lengre bevegelse. De grå linjer ble inkludert for å visualisere at cellepopulasjonen består av ikke-glidende celler og bevegelige celler (som imidlertid gjør pauser.) (C) Tid for aktiv bevegelse (tid aktiv) representerer den prosentandel av den totale tid i en celle har migrert i forhold til den totale tiden av observasjonsperioden. En tids aktive av 20% og en total tid på 15 timer angir at denne celle har beveget seg i totalt 3 timer. Denne parameteren blir videre brukt til å bestemme antallet av ikke-bevegelige celler, noe som tilsvarer en tids aktiv på 0%. (D) (E) Alternativt kan motorisk aktivitet av de analyserte celler vises som et boksplott diagram. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative celle migrasjon av data i MDA-HER2 og MDA-NEO brystkreftceller. Celler ble behandlet med 100 ng / ml EGF, 2 mM U73122 eller med en co mbination av begge. (A, B) Midlere motorisk aktivitet av MDA-HER2 (A) og MDA-NEO (B) celler i avhengighet av tiden. (C, D) Boks diagram av den midlere motorisk aktivitet, representerer 2 timer til 13 timers tidsintervall (se bar (a, b)) i MDA-HER2 (C) og MDA-NEO (D)-celler. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av Mann-Whitney- U-test. *** = P <0,001. (E, F) Histogram plott av tiden aktive av MDA-HER2 (E) og MDA-NEO (F-celler). En tids aktive på 0% viser at cellene ikke har beveget seg i løpet av observasjonsperioden. Conjointly, indikerer en tidspunkt aktive av 20% som, tatt i betraktning en observasjonsperiode på 15 timer, har disse cellene flyttet i opptil 3 timer. Vist er gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til å migrere er et kjennetegn på kreftceller fire. Uten mulighet til å løsne fra den primære tumor, og til å migrere gjennom den omkringliggende bindevev tumorceller ikke vil være i stand til frø sekundære lesjoner, som er den viktigste årsaken til død nesten alle kreftpasienter. På grunn av dette forholdet mange studier fokuserer på kreft celle migrasjon. Målet med disse studiene er identifisering av nye målmolekyler og mål-baner som effektivt blokkerer tumorcellemigrering, og derved svekke eller forsinke metastasedannelse. Et eksempel på et slikt forsøk kan være β-blokkere, som har vist seg å inhibere metastatisk spredning av brystcancerceller in vitro og in vivo 36 og som er forbundet med en forbedret tilbakefall overlevelse hos pasienter med trippel-negative bryst kreftceller 37. Vi har nylig vist at hybrid-celler, som stammer fra spontanelige fusjons hendelser mellom en human bryst epitelial cellelinje og en human brystkreft-cellelinje, men ikke de foreldreceller, svarte til kjemokin CCL21 med økt vandrende aktivitet 26. CCL21 har vært forbundet med lymfeknutemetastaser dannelsen av ulike krefttyper, inkludert bryst 38, noe som tyder på at cellefusjon kan være en prosess hvor tumor (hybrid) celler kunne erverve metastatiske egenskaper 39,40.

3D kollagen matrise migrasjon analysen har flere fordeler i forhold til Boyden kammer / Transwell analysen og scratch analysen / sårheling analysen. For det første blir cellene innleiret i et 3D fysiologisk miljø. Som angitt ovenfor, er vandringsadferd av cellene skiller seg markant mellom en to-dimensjonal og 3D miljø 3,14,15. Således kan det konkluderes at vandringsadferd av celler innleiret i en 3D-kollagen gitter ligner mer til in vivo situasjonen enn locomotory aktiviteten av celler gjennomgang på en todimensjonal overflate. Dernest, på grunn av tidsintervall videoopptak det mulig å analysere migrering av flere celler i løpet av et visst tidsrom, som tillater bestemmelse av ulike cellemigrerings parametere. I motsetning til dette, i Boyden kammer / Transwell analysen bare de cellene som er ansett for analyse som har beveget seg til det nedre rom. De celler som migrerer f.eks, på toppen av membranen er ikke inkludert i dataanalysen selv om de er aktive migrerende.

Den 3D kollagen matriks kan kombineres med microfluidic enheter, som i tillegg til å etterligne den ekstracellulære matriks har også etterligne den interstitielle væsken, som har blitt vist å påvirke morfologi og migrering av forskjellige celletyper, slik som fibroblaster, kreftceller, endotelceller og mesenchymale stamceller 41. Data Haessler et al. Avslørte at interstitiell strømmen øker prosentav celler som blir vandrende samt øker migrational hastighet i omtrent 20% av cellene 42. I tillegg til å studere den kjemotaktiske oppførsel av celler, f.eks leukocytter / lymfocytter eller tumor-celler, er en 3D mikrofluid innstilling også et egnet verktøy for å studere tumorcelle intravasation og endotelial barrierefunksjon 43.

Selv om 3D kollagenmatriksen migrasjon assay er et egnet verktøy til å analysere migrering av celler som respons på en stimulus, eller en inhibitor, eller en kombinasjon av begge deler må det bemerkes at dette assay også gjøre har noen begrensninger. For eksempel, er bare kollagen type I brukes for å etterligne den ekstracellulære matriks, som imidlertid er en kompleks blanding av flere komponenter, inkludert proteoglykaner, ikke-proteoglykaner (f.eks hyaluronsyre), kollagenfibre, så vel som fibronektin og laminin, og som sammensetningen videre varierer sterkt mellom ulike bindevev i ulike organer 45 samtidig med en differensial utfallet. For eksempel β1-inte stimulering forårsaket aktivering av ERK i monocytter mens β2-stimulering gjorde ikke 46. Likeledes PI3K var nødvendig for β1-integrin-, men ikke β2-integrin-, mediert NF-κB aktivering 46. På den annen side, er kollagen type I den mest rikelig kollagen i menneskekroppen 47 noe som tyder på at migreringen av celler er hovedsakelig forårsaket av dette kollagen type.

Et annet kritisk punkt i å tyde cellene vandrende aktivitet er cellen sporing prosedyren. For å få gyldig og objektive data er det obligatorisk at banen av enkeltceller analyseres nøyaktig. Cell sporing utføres manuelt for hånd, noe som krever celle sporing erfaring tilfå objektive data. For ytterligere å forbedre dataene og for å unngå et kritisk antall falske positive celler vi bruker en cut-off-nivået på 25 um, noe som betyr at celler som har migrert mindre enn 25 mikrometer, ble ekskludert fra analyse av data. Likeledes er cellene tilfeldig valgt for sporing uten å vite om de er vandrende aktiv eller ikke for å unngå forspenning data.

Løpet av de siste årene flere automatiserte celle sporing programmer har blitt utviklet, der noen av dem er egnet til å analysere celle og partikkel sporing i en 3D-innstilling 18. Fordelen med slike anvendelser er det migrerende celler er virkelig analysert på en objektiv måte. På grunn av at det ville være interessant å sammenligne automatiserte celle sporingsdata med manuelt-laget celle sporingsdata.

Som nevnt ovenfor, til gullstandard analysere cellemigrering innenfor et 3D fysiologisk sammenheng er bruken av intrabilde kombinert with to-foton laserskanning konfokalmikroskopi. Fordelen med denne analysen er at migrerende cellene er integrert i deres fysiologiske miljø bestående av spesifikke løselige faktorer, hormoner, etc., ekstracellulære matriks-komponenter, så vel som celle-til-celle-interaksjoner. Det er bemerkelsesverdig å se filmer som viser hvordan lymfocytter er menneskehandel innenfor en lymfeknute 17, hvordan immunceller kommuniserer med hverandre 48 eller hvordan legemidler er fordelt in vivo ved en enkelt celle nivå 12,49.

Imidlertid, intravital avbildning kombinert med to-foton laser-scanning konfokal mikroskopi er en temmelig kost-dyre teknikk på grunn av behovet for en hensiktsmessig mikroskop og egnede dyremodeller. Likeledes er det egentlig ikke egnet for å studere innflytelsen av enkelt-løselige faktorer / inhibitorer på migrering av bestemte celler eller analyse av cellemigrerings relatert signaltransduksjon kaskader. For disse formålene celle miintegrering assays er anbefalt at analysen av diskrete celletyper, noe som kan bli ytterligere modifisert, for eksempel overekspresjon eller knockdown av målmolekyler, i definerte forsøksbetingelser. På grunn av den svinge forhold mellom en 3D-miljø og motorisk oppførsel av celler konkluderer vi at 3D-migrasjon kollagenmatriksen assay er således en allsidig fremgangsmåte for å studere migreringen av celler i en in vitro-innstilling som er nær den in vivo-situasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica DM IL inverted microscope Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer Apple Macintosh
iMac Apple Macintosh
FileMaker Pro FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy) Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0 RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin Applichem GmbH, Darmstadt, Germany A4264
Petroleum jelly local drug store
Purecol (liquid collagen) Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M0275
7.5% sodium bicarbonate solution Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany S8761
EGF Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany E9644
U73122 Merck Millipore, Darmstadt, Germany 662035 dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Tags

Bioteknologi cellemigrasjon 3D kollagen matrise celle sporing
Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommerswinkel, N., Niggemann, B.,… More

Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (92), e51963, doi:10.3791/51963 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter